BAB I

INTRODUCTION

Penggunaan kombinasi kromatografi cair / spektrometri massa terus meningkat

dalam dekade ini, dan teknik ini baru-baru ini menjadi alat analisis yang kuat untuk sampel
yang terlalu labil terhadap panas atau tidak mudah menguap sehingga tidak dapat
menggunakan kromatografi gas / spektrometri massa. kami telah melaporkan pengembangan
LC/MS interface dan system yang dikombinasikan dengan kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) semimicro dan peningkatan berturut-turut dari nebulizer LC / MS interface.

Dalam makalah kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa, pada DLI LC/
interface, ionisasi kimia yang menggunakan pelarut LC sebagai gas reagen secara stabil
dicapai oleh jet efluen untuk memasukkan efluen LC ke dalam sumber ion dan secara
tercontrol dari tekanan ruang ionisasi. kami juga menggambarkan bahwa kinerja dasar yang
diperlukan untuk LC/MC terbukti untuk beberapa senyawa yang labil terhadap panas dan
tidak mudah menguap.

Dalam ionisasi kimia DLI LC / MS interface, yang diberi nama ionisasi kimia pelarut
yang diinduksi (SICI), ionisasi kimia negatif dari mekanisme reaksi molekul ion juga
diperkirakan terjadi karena affinitas proton molekul tinggi dari ion-ion negatif dari pelarut,
selain itu NCI juga berdasarkan penangkapan elektron
kemampuan LC/MS untuk memanfaatkan spektrum massa tidak hanya ionisasi kimia positif
(PCI) tetapi juga NCI untuk senyawa yang sesuai dengan LC/MS, cukup berguna, karena
spektrum massa NCI sering menawarkan peningkatan sensitivitas dan selektivitas yang tinggi
untuk kelas melecules tertentu. dan penting untuk menggunakan spectra massa NCI bersama-
sama dengan spektra PCI untuk penentuan berat molekul senyawa atau untuk penjelasan
strukturalnya.

Dalam penelitian ini dengan memperoleh dan membandingkan spektrum massa PCI dan NCI
dari senyawa-senyawa yang mengandung gugus hidroksil dan karbonil dan atom halogen,
dalam pelarut kromatografi fase terbalik, kami mengevaluasi ionisasi kimia yang diinduksi
pelarut dengan DLI LC/MS. minat khusus difokuskan pada kemampuan metode mendeteksi
spektra massa NCI di bawah operasi LC/MS
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1. spectrometer massa
Spektrometer massa : adalah alat atau instrumen yang digunakan untuk menentukan
struktur kimia dari molekul organik berdasarkan perhitungan massa dari molekul
tersebut serta pola fragmentasinya
2. Metode spektroskopi massa adalah suatu teknik analisis yang mendasarkan
pemisahan berkas ion-ion yang sesuai dengan perbandingan massa dengan muatan
dan pengukuran intensitas dari berkas ion-ion tertsebut. Dalam spektroskopi
massa, molekul- molekul senyawa organk ditembak dengan berkas elektron dan
diubah menjadi ion-ion bermuatan positif yang bertenaga tinggi (ion-ion
molekuler atau ion- ion induk), yang dapat dipecah menjadi ion-ion lebih kecil (ion-
ion pecahan)
3. Prinsip kerja
Prinsip kerjanya adaldah pembelokan partikel bermuatan dalam medan magnet.
Molekul bermuatan atau fragmen molekul dihasilkan dalam suatu hamapa atau segera
sebelum suatu sampel memasuki ruang sangat hampa dengan menggunakan berbagai
metode untuk produksi ion. Ion-ion dihasilkaan dalam fae gas sehingga ion tesebut
kemudian dapat dimanupulasi dengan penerapan pada medan magnet atau medan
listrik agar dapat menentukan molekul.
4. Chemical ionisasi (CI)
Pada chemical ionisasi, energi yang digunakan tidak terlalu tinggi sehingga fragmen
yang terbentuk tidak terlalu banyak (kelimpahan M+ banyak). Tekanan yang
digunakan tidak terlalau tinggi yaitu 102 nm-2. Jarak anatar molekul dekat sehingga
diperlukan tumbukan anatar ion pereaksi. Untuk CI spectra MS menunjukkan ion-
iona bermuatan positif maupun negative, untuk ion positif spectrum CI menggunakan
 gas peraksi seperti matana, isobutaana atau ammonia sedangkan ion negative
spectrum CI menggunakan peraksi CH3O. kelemahan dari CI yaitu energinya rendah
disbanding EI sehingga fragmen-fragmennya tidak terlalau banyak sedangkan M+nya
banyak.

5. Proses yang terjadi di dalam spectrometer massa (MS)

1) Volatilisasi (proses yang memudahkan zat menguap). Bila senyawa/contoh
dimasukan ke dalam alat MS, sebagian berubah menjadi uap. Zat padat yang
dimasukan sebagian diubah menjadi gas, sebab system dalam keadaan vakum
tinggi (±10-6 torr atau 10-6 mmHg).
2) Uap tersebut dilewatkan suatu celah (A) dan masuk ke dalam ruang yang ada
filament yang menghasilkan berkas electron dengan energy tertentu
Ada dua kemungkinan pada penembakan dengan elektron:
1. Molekul tidak kena tembak
2. Molekul kena tembak. Ini yang penting. Akibat penembakan, molekul
terionisasi. Kemungkinan yang akan terjadi ialah:
a) M + e-  M+ + 2e-
b) M + e-  M-
Kebolehjadian reaksi b) kecil sekali disbanding dengan reaksi a) sehingga MS
dibuat berdasarkan deteksi kation (M+)
Untuk mengeluarkan satu elektron (e-) dari molekul, biasanya diperlukan energy
10eV/molekul (sebanding dengan 230 kkal/mol). Jadi elektron penembak minimal
harus punya energy 10eV. Jika energi electron lebih besar, misalnya sampai 70 eV,
akan terjadi beberapa kemungkinan, tergantung bagaimana tembakan yang terjadi ,
menyerempet atau tepat/telak.
Pada keadaan tersebut terjadi perpindahan tenaga dari electron ke molekul tersebut.
Energi ini digunakan untuk :
 10 eV untuk mengeluarkan (e-) dari molekul
 Sisanya diubah menjadi energi vibrasi
Jika energi vibrasi cukup besar, dapat terjadi pemutusan ikatan sehingga terjadi
fragmentasi. Energi ikatan kurang lebih besar 5 eV (=100 kkal/mol). Jadi selain
terjadi ion molekul, juga terjadi fragmen. Fragmen yang dapat dideteksi hanya
fragmen bermuatan positif (+).
Energi electron penembak bias diatur pada 10-70 eV (kadang-kadang sampai
100eV). Di dalam ruang penembakan/kamar pengion (ion chamber) dapat terjadi:
 Ion molekul, ini terjadi akibat ionisasi
 Ion fragmen, ini terjadi akibat fragmentasi
3) Semua ion-ion positif ini dilewatkan pada celah B dengan jalan memberikan
perbedaan tegangan antara celah A dan celah B sehingga ion akan bergerak ke
celah B. perbedaan tegangan tersebut dinamakan tegangan penolakan (repeller
potential)
4) Antara celah B dan celah C ada perbedaan tegangan yang disebut potensial
pemercepat (accelerator potential), dengan tegangan ± 8000 volt. Ion yang keluar
dari celah C sudah mempunyai kecepatan yang cukup tinggi.
5) Ion yang keluar dari celah C akan masuk ke analisator/penganalisa. Pada bagian
ini, ion-ion dipisahkan berdasarkan nilai m/z-nya (m=massa ion dan z=muatan,
yaitu +1).
Analisator yang digunakan adalah penganalisa magnet (magnetic analyzer). Pada
alat ini terdapat medan magnet sehingga benda bermuatan akan
dibelokkan/mengalami defleksi yang tergantung pada besarnya massa dan
muatannya, sesuai dengan rumus:

m/z = H2 .r2
2V

m = massa ion
z = muatan ion
H = kuat medan magnet
r = jari-jari kelengkungan
V = potensial pemercepat
Ada dua cara scanning, yaitu:
a) Mengubah H dengan V tetap
b) Mengubah V dengan H tetap
Dengan cara ini, partikel-partikel yang berbeda massanya dapat dipisahkan,
bahkan untuk yang bedah massanya 1 sma (satuan massa atom) dengan mudah
dapat dipisahkan. Bila beda massanya kecil sekali, masih mungkin dipisahkan
dengan MS resolusi tinggi. Sebagai contoh untuk molekul karbonmonoksida
(CO), etilena (C2H4), dan Nitrogen (N2), pada spectrometer resolusi rendah
ketiganya akan memiliki nilai bilangan massa=28. Akan tetapi nilai ini akan
berbeda jika digunakan MS resolusi tinggi.
 CO C2H4 N2
28 28 28  Bilangan massa secara kasar
27,9949 28,03128 28,0062  Bilangan massa secara telitii

Bila dihitung secara teliti, massa atom C=12,000 ;H=1,00782; O=15,9949 ;

N=14,0031. Dengan demikian terlihat, bahwa massa ketiga senyawa tersebut
berbeda sehingga dapat dipisahkan dengan MS resolusi tinggi.
Kesalahan terbesar dari magnetic analyzer ini disebabkan oleh ketidakseragaman
energy dari ion-ion yang masuk (ion-ion tersebut tidak monoenergetic).
Untuk membuat agar ion-ion tersebut monoenergetic, digunakan electrostatic
analyzer. MS dengan magnetic analyzer (MA) dan electrostatic analyzer (EA)
adalah MS berfokus ganda (double focus). EA melakukan seleksi energi,
sedangkan MA melakukan seleksi massa
6) Dari MA, ion melewati beberapa celah kolektor. Ion yang berhasil melalui celah
tersebut akan membentur dinding kolektor dan isyarat yang timbul diperkuat
dengan pelipat-ganda elektron (electron multiplier)
7) Adanya arus elektron akan menyebabkan adanya gerakan pada galvanometer.
Pada alat MS biasanya digunakan 3-6 galvanometer (terlihat pada jumlah garis
spectrum yang dihasilkan). Gerakan tersebut akan tercatat pada rekorder
6. Beberapa Hal Khusus dalam Spektroskopi Massa
 Kelimpahan Isotop
- Isotop Atom (12C, 13C, 14C)
Kelimpahan isotop perlu diperhatiakan karena atom-atom dari unsus
yang sama di alam tidak hanya terdiri dari satu isotope. Ada juga yang bersifat
mono isotop (terdiri dari satu isotop) misalnya atom F, P, dan I, masing-masing
dalam bentuk 100% 19F, 31P, dan 127I.
Karbon memiliki isotope 12C, 13C, dan 14C. isotop 13C dan 14C adalah
14
radio aktif pemancar β. Jumlah C kecil sekali sehingga untuk MS tidak
13
berarti, sedangkan C memiliki kelimpahan (abundance) 1,1% yang cukup
berarti untuk MS. Contohnya untuk molekul CH 4 (Metana), jika terdapat 1000
molekul metana, kemungkinan 11 buah diantaranya adalah CH4 dengan 13C.
Jadi ada puncak (M++1) dengan tinggi = 1,1% dari tinggi puncak M+. Adanya
isotop ini harus diperhatikan dalam MS, walaupun hal ini memperumit
spektroskopi massa.
Persentase (M++1) terhadap M+ dapat digunakan sebagai petunjuk
jumlah atom karbon yang terdapat di dalam molekul yang dianalisis. Misalnya
 kelimpahan (M++1) = 2,2% dari M+, ini berarti terdapat dua atom karbon,
karena kandungan isotop atom 13C sekitar 1,1% dari isotop atom C12 (Gambar
4.5). Untuk etana (CH3-CH3), jika terdapat 1000 molekul ini, kebolehjadian
13
salah satu atom C etana adalah C = 22 atom. Jumlah ini berasal dari 11
molekul 12CH3-13CH3 dan 11 molekul 13CH3 -12CH3.
Kebolehjadian kedua atom C etana adalah 13C= 1,1% X 1,1%= 1,21 %o
= 1,21/10.000. Nilai ini kecil sekali dibandingkan hanya salah satu atom C
13 13
adalah C. Jadi lebih mungkin bila hanya satu atom C yang ada dalam
molekul tersebut.

m/z Kelimpahan relatif

12
CH4  16 (M+) 100%
13
CH4  17 (M+ + 1) 1,1%

m/z Kelimpahan relatif

12
CH3-12CH3 30 (M+) 100%
12
CH3-13CH3 31 (M++1) 2,2%
13
CH3-12CH3
13
CH3-13CH3 32 (M++2) 1,21 %o

- Brom (75Br: 81Br)

Misalnya untuk senyawa metilbromida, CH3Br, brom di alam terdapat
dalam bentuk isotop 75Br. 81Br dengan perbandingan kelimpahan = 1:1. Bila
terdapat 1000 molekul metilbromida dan dianggap semua C adalah isotop
12
C, massa per muatan (m/z) CH3Br dengan isotop 75Br yang memiliki nilai
m/z untuk M+ =94: CH3Br dengan 81
Br yang memiliki M+ =96 akan
menghasilkan perbandingan = 1:1 (tingginya sama)
 Untuk CH2Br2 m/z Kelimpahan relatif
CH279Br79Br 172 1x1=1
CH279Br81Br 174 1x1=1 =2
CH281Br79Br 174 1x1=1
CH281Br81Br 176 1x1=1

Untuk CH2Cl2 m/z Kelimpahan relatif

CH235Cl35Cl 84 3x3=9
CH235Cl37Cl 86 3x1=3 =6
CH237Cl35Cl 86 1x3=3
CH237Cl37Cl 88 1x1=1

79 81
Kelimpahan isotop Br : Br = 1:1, sedangkan kelimpahan isotop
35
Cl : 37Cl = 3:1. Jika dibuat matriks kebolehjadian kedua isotop Br terdapat
di dalam satu molekul, demikian pula kedua isotop Cl, akan diperoleh hasil
sebagai berikut:

79 81
Br=1 Br=1
79
Br=1 1x1=1 1x1=1 =2
81
Br=1 1x1=1 1x1=1

35 35
Cl=3 Cl=1
35
Cl=3 3x3=9 1x3=3 =6
35
Cl=1 3x1=3 1x1=1

Kelimpahan relative puncak Br pada spektrum massa CH 3Br2

(dengan isotop Br) dengan m/z 172: 174: 176 = 1:2:1, sedangkan kelimpahan
relatif Cl pada spektrum massa CH2Cl2 dengan m/z 84: 86: 88 = 9:6:1
Dengan cara serupa dapat diperkirakan pengaruh isotop tiga atom Br dan tiga
atom Cl dalam molekul CHBr3 dan CHCl3.
 BAB III
RESULT AND DISCUSSION

1. HPLC solvent : MeOH : H2O

Gambar 1 menunjukkan PCI dan NCi spectra masa dari pelarut MEOH: H2O [Me ;
CH3]; umumnya digunakan untuk fase gerak kromatografi. Pelarut tersebut dapat
digunkaan pada DLI LC/MS. Dalam mode PCI, caraterictic ion dalam
 menghilangnya ion prioton dari pelarut (MeOH)3H+ [ n= 1,2,3] yg diamati,
sementara dalam mode NCI, ion kateritisknya adalah (MeOH)mMeO- [m= 0,1,2]
disebabkan oleh afinitas elektron yang tinggi dari metanol. (MeOH)mMeO- memiliki
afinitas ion proton yang besar (MeO- : 1577 KJ/mole), mereka bertindak sebagai base
bronsted dan sering menyebabkan reaksi transfer proton dengan molekul sampel dan
memberikan ion (M-H)- .

2. Nonvolatile and thermally labile compounds

Gambar diatas menunjukkan spektra massa PCI dan NCI dari estriol, salah satu
hormon steroid, dengan menggunakan CH3OH; H2O (10/1) sebagai fase gerak.
Dalam mode PCI, (MH-H2O)- [m/z 271] ion fragmen memberikan base puncak, dan
ion quasi-molekul kuat (M +H)+ [m/z 289] yang diamati.
Puncak ion pada m/z 321 diamati di daerah massa yang lebih tinggi diperkirakan
gugus ion yang dihasilkan dari penambahan pelarut. Dalam mode NCI, ion quasi-
 molekul (M-H)- [m/z 287] memberikan base puncak dengan gugus ion kecil (M
+MeO)- [m/z 319]. Puncak ion yang dihasilkan dari kehilangan gugus air yang tidak
terdeteksi dalam mode NCI

3. Spectra fase gerak

Spektrum massa asam asam kolat, yang diperoleh dengan menggunakan ionisasi yang
dilaporkan oleh K. menunjukkan bahwa fragmen yang dihasilkan dari kehilangan air
(MH) dan (MH3H2O), kuat dengan ion (M +) yang sangat lemah. dalam spetrum ion
positif, asi kuasi-molekul (M + H) adalah fragmen kecil dan besar yang dihasilkan
dari kehilangan air, diamati sebagai ion kheteristik. tetapi yh spetrum ion negatif, ion
kuasi-molekul (M-H) diamati sebagai puncak basa dengan beberapa ion fragmen
lemah
4. Obat influenza
Gambar diatas menunjukkan arus ion total (TIC) [m/z 130 – 1000] dan kromatogram
massa untuk PCI dan NCI dari obat influenza, yang diperoleh dengan menggunakan
DLI LC / MS.
Larutan sampel dibuat dengan melarutkan 1 mg obat dalam pelarut yang sama [H 2O;
CH3OH : CH3CN (55/35/10)] seperti yang digunakan untuk fase gerak. setelah
pembacaan dari pelarut, 3 μl diinjeksikan. puncak yang diperoleh dalam TIC dan
kromatogram massa menunjukkan adanya lebih dari empat senyawa berbeda dalam
obat.
Gambar b. diatas menunjukkan spektra massa diperoleh puncak yang sama yang
ditunjukkan pada gambar a.
Spektra PCI dan NCI yang sesuai dengan puncak 1 hingga 4 ditunjukkan pada gambar
b. memberikan charateristic ion sebagai base puncak yang harus diubah ke ion quasi-
molekul (M + H) + dan (M-H)- . Bobot molekul sesuai dengan puncak 2, puncak 3 dan
puncak 4 diperkirakan 151, 194 dan 137.
Mempertimbangkan komponen biasa yang terkandung dalam obat ini, kami
memperkirakan bahwa senyawa yang sesuai dengan tiga puncak ini yaitu
asetaminofen (M.W. 151), kafein (M.W. 194) dan salisilamid (M.W. 137). Pendapat
kami dikonfirmasi oleh percobaan lain untuk membandingkan data dalam waktu
retensi dan spektra massa yang diperoleh dalam kondisi yang sama dari bahan murni
dan sesuai dengan senyawa yang disebutkan di atas. Adapun komponen yang sesuai
dengan puncak 1, berat molekul diperkirakan 162, tetapi belum dipastikan.
5. Obat anti inflamasi

Gambar .a. menunjukkan NCI TIC dan kromatogram massa obat anti inflamasi yang
mengandung tiga senyawa atau komponenyang diketahui dari volume yang sama:
hidrokortisol (M.W. 362), flunixin (M.W. 296) dan ibuprofen (M.W 206).
Walaupun kami berusaha memisahkan senyawa-senyawa ini menggunakan kolom
C18 dan pelarut 1 % CH3COOH : CH3OH (35/65) tetapi komponen yang
diperkirakan hidrokortisol (puncak 1) yang terpisah dari dua senyawa lainnya dalam
kondisi ini.
Puncak kromatografi massa dari m/z 205 dan 296 diduga dihasilkan dari ibuprofen
dan flunixin. Data dapat dilihat dari profil kromatogram bahwa sampel secara
berurutan dimasukkan ke dalam sumber ion dan terionisasi.
Gambar .b. menunjukkan spektra massa PCI dan NCI untuk puncak 1, puncak 2, dan
puncak 3 ditunjukkan pada gambar .a.
Spektrum PCI dari hidrokortisol yang sesuai dengan puncak 1 memberikan ion
fragmen yang kuat (M –CO.CH2OH) + [m / z 303] sebagai base puncak dan beberapa
ion karakteristik lain yang dihasilkan dari kehilangan gugus air, dan ion quasi-
molekul [m / z 363] juga terdeteksi.
Dalam mode NCI, ion fragmen yang dihasilkan dari kehilangan gugus/ senyawa air,
[m / z 344], menjadi base puncak. Karena fluxinin mengandung atom-atom fluorin
dengan afinitas elektron yang tinggi, puncak ion M- yang kuat diperoleh pada m / z
296 sebagai base puncak dalam NCI spektra massa yang ditunjukkan pada gambar
gambar.b.
Dalam spektra massa PCI dan NCI yang sesuai dengan puncak 2, yang mungkin
+
dihasilkan dari ibuprofen, ion quasi-molekul (M + H) [m /z 207] dan (M-H) - [m/z
205] yang diperoleh sebagai base puncak, bersama dengan beberapa ion gugus
pelarut.