SYSTEMS BIOLOGY ANALYSIS OF

TEMPORAL IN VIVO Brucella melitensis

AND BOVINE TRANSCRIPTOMES PREDICTS
HOST:PATHOGEN PROTEIN–PROTEIN
INTERACTIONS

Disampaikan oleh:
APRILIA HARDIATI B261180058

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2020
 PENDAHULUAN

• Brucella, coccobacillus Gram-negatif non-motil aerobik, adalah agen etiologi brucellosis.

• Penyakit menular antropozoonosis yang menyebabkan infeksi kronis dengan
bakteremia persisten atau berulang dan menyebabkan abortus pada pertengahan
hingga akhir kebuntingan.
• 11 spesies yang dikenal dalam genus Brucella berdasarkan pada spesifisitas host
preferensial. Kambing dan domba adalah inang yang disukai untuk Brucella melitensis
meskipun patogen ini juga menginfeksi ternak tergantung pada kondisi epidemiologi
tertentu.
• Pada kondisi eksperimental, B. melitensis mampu menginvasi host sapi melalui epitel
jejuno-ileal Peyer’s patch diikuti oleh penyebaran sistemik yang cepat.
• Rute paparan dominan untuk penetrasi B. melitensis adalah saluran pencernaan.
 PENDAHULUAN

• Brucella tidak memiliki faktor virulensi klasik bakteri seperti exotoxins, cytolysins, kapsul,
fimbriae, plasmid, fag lisogenik, variasi antigenik, atau endotoksik lipopolysaccharide (Moreno
dan Moriyón, 2002).
• Brucella telah mengembangkan strategi tersembunyi untuk menghindari keberadaannya
sehingga tidak dikenalli dikenali dan berhasil menginfeksi host.
• Brucella menghindari respon imun bawaan yang kuat, menghalangi aksi langsung dari zat
bakterisida, tahan kehancuran oleh fagosit profesional dan menjaga sel hospes tetap hidup untuk
membuat infeksi jangka panjang.
• Faktor virulen terkait adhesi: Heat shock protein 60 (Hsp60) protein di permukaan Brucella
abortus untuk mengikat makrofag dan sel M usus.
• Faktor virulen terkait invasi: Protein SP41 (UgpB) homolog dengan glycerol-3 phosphatebinding
protein transporter ABC berinteraksi dengan residu asam sialat seluler, memfasilitasi invasi
hospes.
 PENDAHULUAN

• Faktor virulensi survival: sistem sekresi tipe empat (T4SS) faktor virulensi kunci
Brucella untuk kelangsungan hidup intraseluler
• Mekanisme virulensi tambahan yang digunakan oleh Brucella untuk bertahan
hidup secara intraseluler adalah senyawa periplasmik siklik B-1,2 glukan, yang
mengganggu pematangan vakuola sel yang mengandung Brucella dengan
mengganggu jaringan lipid kaya kolesterol pada membran fagosom dan
mencegah fusi fagosom-lisosom.
• Sebagian besar faktor virulensi ini ditandai secara individual tanpa
mempertimbangkan secara temporal dan koordinasi yang diekspresikan atau
dikeluarkan selama proses infeksi.
 PENDAHULUAN

Tujuan penelitian:
1) Mendeskripsikan pendekatan integratif eksperimen dan komputasi untuk menganalisis
profil transkripsional temporal in vivo dari B. melitensis selama 4 jam pertama interaksi
dengan host yang rentan secara alami, menggunakan model infeksi jejuno-ileal pedet.
2) Melakukan analisis tingkat sistem dengan menerapkan analisis diferensial statistik
tradisional untuk menentukan signifikansi ekspresi gen B. melitensis dan analisis
pathway dan gen ontologi (GO) yang menggunakan teknik Bayesian network dinamis
(DBN) untuk mengidentifikasi tren gangguan/perturbations dari waktu ke waktu.
 METODE
1. Model Infeksi

4 pedet
 Inokulasi intraluminal
 3 ml suspensi B. melitensis (1 × 109 CFU of B. melitensis 16M/ml) total of 3 ×
109 CFU)
 log fase pertumbuhan akhir di medium F12K (ATCC R) + 10% heat-inactivated
fetal bovine serum (HI-FBS)
5 segmen jejunum-ileum
 15 menit, 30 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam
 6-10 mm
Eutanasi pedet
 Intravenous
 bolus sodium pentobarbital
 METODE
2. Isolasi RNA, Labeling dan Hibridisasi

• Ekstraksi: total RNA B. melitensis-infected bovine Peyer’s patches

• Enriched: total RNA tissue-associated B. melitensis
• Presipitasi: enriched RNA di 100% ethanol suhu −20◦C, washed and re-suspended
pada 25 μl DEPC-treated water
• Amplifikasi: 30 μg total RNA B. melitensis-infected bovine Peyer’s patches

Amplifikasi linear total amount RNA, 3 tahap:

1) RNA direverse transcripsi menjadi cDNA menggunakan B. melitensis genome direct primers
(BmGDPs), T7 promoter-template switching primer (T7-TS)
2) second-strand cDNA disintesis dan dimurnikan pada speed-vac tanpa pemanasan
3) transkripsi in vitro dengan template double-stranded cDNA T7 polymerase
 METODE

10 μg @sampel
 direverse transkriptase semalam menjadi amino-allyl cDNA menggunakan 1.5 ug B. melitensis
genomic directed primers (BmGDPs) berlabel Cy3
 dicampur dengan 0.5 ug Cy5 berlabel B. melitensis gDNA

Labeling B. melitensis gDNA sesuai prosedur Rosetti et al. 2009

Hibridisasi: slides dihibridisasi pada suhu 45 °C ± 20 jam di ruang lembab gelap. Kemudian,
dicuci selama 10 menit pada suhu hibridisasi dengan buffer stringitas rendah [1X SSC, 0.2%
SDS] selanjutnya dilakukan pencucian 5 menit dengan buffer stringitas yang lebih tinggi
[0.1X SSC, 0.2% SDS, dan 0.1X SSC] pada suhu kamar dengan agitasi ringan, dikeringkan
dengan sentrifugasi dan segera discan.
 METODE

2. Akuisisi Data, Normalisasi dan Analisis Data Microarray

• Slides kering discan were scanned: commercial laser scanner, saturasi persentase
piksel 0.03%.
• Dilakukan normalisasi terhadap kontrol internal.
• Ekspresi gen B. melitensis terkait-jaringan pada setiap titik waktu (0,25-4 jam)
dibandingkan dengan ekspresi gen inokulum (yaitu, kultur B. melitensis yang
ditanam secara in vitro pada fase log pertumbuhan akhir, dikultur dalam Media
F12K dengan 10% HI-FBS; n = 4).
• Gen yang diekspresikan secara signifikan ditentukan dengan uji-z (p <0,025).
 METODE

• Integrasi berbagai prior biological knowledge (PBK) ke dalam prediksi interaksi

protein-protein host-patogen (PPI) dilakukan dengan mengadopsi tiga metode
algoritmik: (1) prosedur interaksi sekuen similaritas; (2) algoritma berbasis domain
protein struktural; dan (3) algoritma berbasis gen ontologi fungsional
• Validasi hasil microarray, enam gen yang dipilih secara acak
yang secara konsisten diekspresikan dari 15 menit hingga 4 jam p.i oleh hasil
microarray, dianalisis pada setiap titik waktu dengan RT-PCR kuantitatif (qRT-
PCR).
 HASIL
Down-Regulated Faktor Virulensi Utama Brucella pada Awal Infeksi

• 2.356 gen B. melitensis (1.221 up-regulated

vs. 1.135 down-regulated) setidaknya sekali
pada 4 h p.i., dibandingkan dengan kontrol in
vitro
• jumlah total gen Brucella relatif konstan
dalam 4 jam pertama (15 mnt: 1.899 gen, 30
mnt: 1.937 gen, 1 jam: 1.968 gen, 2 jam: 1.909
gen, dan 4 jam: 1.912 gen)

Representasi grafis dari gen B. melitensis yang diekspresikan secara berbeda-beda (DE)
selama percobaan. Batang biru mewakili gen yang diaktifkan; batang merah muda mewakili
gen yang ditekan. Untuk analisis diferensial, ekspresi gen loop terinfeksi in vivo dibandingkan
dengan inokulum fase log pertumbuhan in vitro sebagai kontrol.
 HASIL
• 1.740 gen (55% dari genom B. melitensis) markedly perturbed (sangat terganggu) pada arah
yang sama dalam 4 dari 5 titik waktu.
925 (53%) gen yang diaktifkan
815 (47%) yang ditekan, dibandingkan dengan kultur in vitro
• Gen-gen ini dianggap sebagai kelompok gen inti yang terkait dengan perubahan adaptif B.
melitensis selama infeksi awal bovine Peyer’s patch.
• Kelompok gen inti yang diaktifkan sebagian besar terletak di kromosom I (>1.174 gen
berbeda: 752 up-regulated dan 422 down-regulated).
Kromosom I mengkodekan sebagian besar metabolisme inti transkripsi, translasi dan sintesis
protein.
• Kelompok gen yang ditekan sebagian besar terletak di kromosom II (566 gen berbeda: 173
up-regulated dan 393 down-regulated).
Kromosom II terlibat di jalur untuk pemanfaatan substrat spesifik (transportasi membran, metabolisme
energi, regulasi).
 HASIL

• Data ekspresi gen microarray divalidasi oleh qRT-PCR.

• Perubahan ekspresi gen konsisten antara microarray dan qRT-PCR untuk gen
dengan peningkatan ekspresi atau gen dengan penurunan ekspresi relatif
terhadap kontrol.
 PEMBAHASAN

• Dalam 15-30 menit setelah paparan in vivo, B. melitensis adhesi dan penetrasi
menembus mukosa usus melalui Peyer’s patch dan menyebar dengan cepat melalui
sirkulasi sistemik.
• Ekspresi tahap awal gen hospes yaitu gen Syndecan 2, Integrin alpha L dan Integrin
beta 2 bertepatan dengan adhesi awal Brucella yang digabungkan dengan
represi/penekanan simultan dari dua jalur pertahanan usus (Tight Junction dan
Trefoil Factor Initiated Mucosal Healing) sehingga fungsi pertahanan epitel mukosa
tidak berfungsi/hancur dan memfasilitasi migrasi transepitel Brucella.
• Pathway dan kelompok Gene Ontology terdiri dari set gen yang dapat diaktifkan
atau ditekan dari waktu ke waktu. Metode penilaian Bayesian menghitung
kemungkinan log-likelihood data in vivo dan mengukur goodness-of-fit model
terhadap data kontrol (data inokulum in vitro).
PEMBAHASAN
 PEMBAHASAN

• Di awal proses infeksi, kategori jalur “Environmental Information Processing” memiliki

beberapa jalur penting yang terlibat dalam patogenisitas B. melitensis yang ditekan pada 15
menit p.i. yaitu "sistem sekresi tipe IV," "sistem sekresi tipe III," sistem dua komponen“ dan
“transporter ABC”.
• Namun jalur sistem pengatura dua komponen (TCRSs) dan sistem sekresi Tipe III berbalik ke
keadaan diaktifkan pada 30 menit. p.i.
• TCRS adalah mekanisme sinyal transduksi yang memungkinkan mikroorganisme
melakukan sensing dan merespons perubahan kondisi lingkungan.
• TCRS awalnya ditekan pada 15 menit. p.i. dan kemudian diaktifkan untuk sisa waktu
poin memberikan bukti bahwa Brucella in vivo melakukan sensing dan secara aktif mengatur
metabolisme mereka melalui transisi ke gaya hidup intraseluler.
• Perubahan ekspresi antara 15 - 30 mnt p.i. oleh gen TCRS dctM, glnG, glnL, phoB, phoQ, citE,
dan divJ menghasilkan jalur TCRS yang beralih dari keadaan tertekan ke keadaan diaktifkan
dengan pengecualian aceA yang diaktifkan lebih awal dan kemudian ditekan.
 PEMBAHASAN

• Jalur Brucella lain yang terlibat dalam virulensi tersebut sebagai "transporter ABC"
dan "sistem T4SS" terus menerus ditekan, ini adalah strategi membungkam untuk
menghindari stimulasi respon imun innate hospes pada proses awal infeksi.
• Gen yang sangat direpresi terkait dengan represi transporter ABC yaitu BMEII0196, BMDII0861,
PBMII0120, BMEI1138, proW, ybbP, pstB, potB, afuB, rbsC dll.
• Represi sistem T4SS diinduksi oleh gen yang direpres yaitu virB4, virB5, virB6, dan virB9. Sesuai
dengan hasil eksperimental in vivo penelitian ini, ekspresi gen dari operon virB ditekan seperti
yang dikonfirmasi oleh qRT-PCR.
• Penelitian in vitro telah menunjukkan bahwa T4SS tidak diperlukan untuk invasi seluler, dan
ekspresinya dimulai 15 menit setelah fagositosis dan maksimal pada 5 jam p.i. (Sieira et al.,
2004) dan telah terbukti sangat diperlukan untuk kelangsungan hidup intraseluler Brucella.

• Dalam kategori “cellular processes” jalur "Flagellar assembly" dan "Bacterial

chemotaxis" juga ditekan setiap waktu. titik p.i.
 PEMBAHASAN
Hasil Pemodelan Interactome Sistem Biologi In Vivo

• Analisis PPI menunjukkan identifikasi gen virB yang mengkode protein T4SS memiliki interaksi yang
memungkinkan dengan sejumlah gen dalam jalur respon imun hospes (Tabel 2 dan Tabel S8).
• Sebagai contoh, gen virB11 yang terganggu secara signifikan memiliki prediksi pengikatan domain
protein tinggi dengan korelasi negatif dengan ekspresi gen hospes/protein PIK3R2.
PIK3R2 adalah protein pengatur utama dalam beberapa jalur utama termasuk pensinyalan
mTOR, reseptor sel-B dan sel B, adhesi sel yang dimediasi Integrin, regulasi sitoskeleton aktin,
apoptosis, dan TLR.
• Gen hospes PIK3R2 tetap diaktifkan untuk semua titik waktu p.i.
• VirB11 juga memiliki prediksi ikatan domain protein yang kuat dengan korelasi negatif dengan gen
hospes MAPK8IP1 / 2 dari jalur pensinyalan MAPK. Gen hospes MAPK8IP1 / 2 sangat ditekan 15 menit
p.i. dan setelah itu diekspresikan secara tidak signifikan.
• MAPK8IP1 / 2, faktor transkripsi JUND dan faktor inti sel-T yang diaktifkan, sitoplasmik 3, NFATC2
keduanya sangat ditekan.
 PEMBAHASAN

• Flagellum Brucella adalah faktor virulensi yang diekspresikan sementara selama

pertumbuhan vegetatif dan diperlukan untuk infeksi persisten, tetapi tidak untuk
internalisasi in vivo (Fretin et al., 2005).
• Hasil selama 4 jam pertama infeksi menunjukkan represi dari tiga lokus yang pengkode
flagellum (BMEII0150-0168, BMEII1080-1089, dan BMEII1105-1114))
• Faktor sigma RopE1 (BMEI0371), penekan flagellar (Ferooz et al., 2011), aktif sepanjang
percobaan.
• Interaksi dengan hospes: Tiga PPI yang berkorelasi tinggi diidentifikasi yaitu gen flagela
BMEI0324, BMEII1085 (flgA), dan BMEII1113 (fliG-2).
• ORF BMEI0324 memiliki kemiripan urutan pengikatan yang kuat dan korelasi positif
dengan host yang dinyatakan JUN (onkogen Jun). Bagian dari jalur host yang sangat
terganggu: TLR, Pemberian Sinyal ErbB, Pensinyalan BRC, Pensinyalan sel-B, Pensinyalan
sel-T, pensinyalan sel-T , Signaling Sel Epitel, Signaling WNT, dan Signalling MAPK.
 PEMBAHASAN

• Gen FlgA flagel juga memiliki kemiripan urutan pengikatan yang kuat dan korelasi ekspresi
gen positif dengan gen CASP2 host, dan memiliki korelasi terbalik (negatif) dengan host
gen CASP3 yang diaktivasi.
• CASP2 yang diekspresikan dengan rendah hanya terkait dengan jalur pensinyalan MAPK
yang sangat terganggu, sementara
• CASP3 memiliki beberapa asosiasi jalur yang meliputi: Apoptosis, Pensinyalan Epitel, Sel
Killer Alami, dan Pensinyalan MAPK.

• Gen flagel ketiga fliG-2 memiliki kesamaan urutan pengikatan yang kuat dengan gen
MAP4K1 host .
• MAP4K1 yang sangat aktif dikaitkan dengan hanya jalur pensinyalan MAPK host. Interaksi
tersebut dapat menjadi kandidat virulensi baru yang memfasilitasi menghindari respon imun
inang.
 PEMBAHASAN
• Sel inang mengidentifikasi motif pola molekuler yang terkait dengan patogen spesifik
(PAMP) yang terdapat dalam bakteri dengan reseptor pengenal pola (PRR), seperti TLR.
Reseptor ini adalah kunci untuk membangun jaringan penting antara sistem kekebalan
tubuh innate dan adaptif.
• TLR5 adalah reseptor seluler untuk flagelin ekstraseluler, protein struktural utama flagela
Gram-negatif. Pengikatan flagelin ke domain ekstraseluler TLR5 dengan cepat
menginduksi kaskade sinyal yang berujung pada produksi mediator proinflamasi seperti
sitokin, kemokin, dan molekul costimulatory (Honko dan Mizel, 2005).
• Oleh karena itu, tidak adanya alat flagel selama kehidupan ekstraseluler sementara di
dalam host menunjukkan strategi Brucella adalah untuk menghindari memicu respon
imun host dan inisiasi mekanisme persistensi Brucella (Terwagne et al., 2013).
• Namun, analisis kami sebelumnya menunjukkan bahwa jalur TLR5 diaktifkan di Peyer’s
patch sapi yang terinfeksi B. melitensis selama jam pertama p.i. (Rossetti et al., 2013), yang
mungkin telah dikaitkan dengan sisa-sisa flagela dalam media kultur in-vitro yang
diinokulasi secara intraluminal.
 PEMBAHASAN

• Analisis lebih rinci dari jalur ini menunjukkan bahwa TLR5 sangat menekan
beberapa gen PIK3C2B, PIK3R4, STAT1, AKT3, RAC3, IL6, dan TICAM3. Ini
mungkin menunjukkan bahwa patogen memanipulasi proses pensinyalan
penting oleh beberapa mekanisme lain.
• Analisis PPI menunjukkan bahwa gen virB berinteraksi dengan STAT1,
PIK3C2B, dan IL6 untuk menghindari respons TLR5 terhadap stimulasi
flagelin dan mencegah host untuk meningkatkan respons imun yang
efektif.
 KESIMPULAN

• Pemodelan interaksi in silico menawarkan wawasan informatif yang mengarah ke

hipotesis baru mengenai mekanisme invasi dan penghindaran host-patogen.
• Pemodelan ini menyimpulkan bahwa B. melitensis memiliki beberapa titik
interaksi host yang terjadi pada tahap awal pasca infeksi. Sejumlah jalur respon
imun innate yang penting menjadi target potensial yang terganggu dengan
adanya invasi B. melitensis, seperti regulasi Cytoskeleton Actin, pensinyalan
mTOR, MAPK, dan pensinyalan Toll-like receptor.