Analisis protein dalam

bahan pangan
Analisis yaitu penguraian suatu bahan menjadi komponen –
komponen penyusunnya, sehingga data yang diperoleh dapat
dikaji lebih lanjut.

Pangan yaitu makanan atau bahan hasil pertanian dan

olahannya yang layak dikonsumsi manusia.

Protein merupakan rantai dari asam amino yang saling

bergabung melalui ikatan peptida, berfungsi sebagai zat
pembangun, zat pengatur, dan sebagai sumber tenaga.
 Bahan pangan

Penetapan Penetapan
Penetapan Penetapan Penetapan
kadar N non jenis asam
kadar protein Alfa amino TVBN
protein amino

Metode
Metode Metode Metode
spektroskopi Metode HPLC Metode TNBS
kjeldahl kjeldahl Ninhidrin
UV-VIS

Metode
Metode biuret Metode lowry pengikatan zat
warna
Metode kjeldahl
 Metode umum untuk menentukan kadar
protein pada bahan makanan

 Berdasarkan penentuan kandungan Nitrogen

yang ada pada bahan makanan

 Kadar protein diketahui dengan mengalikan %N

dengan faktor 6,25 (100/16=6,25)

 Terhadap bahan dilakukan 3 tahapan, yaitu:

destruksi, destilasi dan titrasi
 Metode kjeldahl
Destruksi
Senyawa N organik didestruksi oleh H2SO4 pekat dengan katalis
campuran selen menghasilkan amonium sulfat.
Senyawa N + H2SO4 Campuran Se CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
Destilasi
Amonium sulfat pada tahap destruksi ditambah larutan NaOH dan
didestilasi menghasilkan amoniak yang ditampung dengan larutan asam
(antara lain asam borat) yang mengandung campuran indikator MM dan
BCG
(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + NH4OH
NH4OH NH3 + H2O

NH3 + H3BO3 NH4H2BO3

Titrasi
Amoniak dititer langsung dengan asam (HCl) yang sudah diketahui
kenormalannya
NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3
Penetapan kadar protein dalam biskuit
Metode kjeldahl

Perhitungan

Kadar Protein =
V HCl x N HCl x 0,014 x 6,25 x fp x 100%
Berat contoh (g)
Metode biuret
Prinsip :
dalam suasana basa, ion cupri (cu2+) dapat membentuk
kompleks yang berwarna ungu jika berinteraksi dengan ikatan
peptida dari suatu protein.
Reagen yang direaksikan pada protein ini disebut reagen biuret.

Garis besar prosedur :

Larutan protein ditambah pereaksi biuret, kemudian
didiamkan selama 15-30 menit dan diukur pada spektro uv vis
dgn panjang gelombang 540nm.
Hasil pengukuran dibandingkan dengan kurva standar yang
dibuat dengan larutan protein serum aalbumin.
Uji Biuret Pada Sampel Pupuk Urea
Cara Kerja :
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Sampel dilarutkan dalam tabung reaksi dengan air dan
alkohol.
3. Dibubuhi beberapa tetes larutan CuSO4 dan NaOH 10 % dan
didiamkan selama 5 menit.
4. Membandingkan dengan standar atau blangko ( tanpa contoh
). Bila terbentuk warna lembayung maka uji biuret positif (+)
Catatan:
Uji biuret akan menunjukkan hasil negatif pada asam amino bebas
karena tidak memiliki ikatan peptida. Uji biuret bisa digunakan
untuk uji protein secara umum dengan dilanjutkan mengukur
absorbansi pada spektro UV VIS.
Metode Lowry

Prinsip :
protein dengan asam fosfotungsat dan
fosfomolibdat pada suasana alkalis dapat membentuk
warna biru yang intensitasnya tergantung pada
konsentrasi protein.
Analisis Protein Pada Sampel “Bakso” Dengan Metode
Lowry
Pembuatan larutan standar Perlakuan Sampel Pengukuran larutan
Metode Pengikatan zat warna
Prinsip penetapan ini didasarkan pada kemampuan gugus
polar protein yang bermuatan ion berlawanan mengikat zat
warna dan membentuk kompleks tidak larut lalu dipisahkan
dengan sentrifus.
Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu
asam amino basa (seperti histidine, arganine dan lysine) dan
pada gugus asam amino bebas di ujung.
 Zat warna yang tidak terikat dengan protein diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer .
[Pewarna terikat] = [Pewarna awal] - [Pewarna bebas]
Semakin rendah intensitas warna pada larutan maka semakin
banyak zat warna yang terikat oleh protein,semakin tinggi pula
kandungan protein dalam contoh.
Metode Pengikatan zat warna
Bahan pewarna yang digunakan adalah orange G , orange 12,
amido black.

Dalam analisis ini diperlukan kurva standar hubungan antara

absorbansi dengan kadar protein.

Penetapan protein dengan metode ini terjadi secara tidak

langsung. Metode ini sesuai untuk analisis contoh bentuk cair.

Contoh aplikasi metode ini yaitu penetapan kadar protein

pada susu.
Penetapan N- non protein
 Metode ini dapat diterapkan pada semua jenis pangan.

 Protein sampai diekstrak dengan air dan diendapkan dengan

tembaga asetat.

 Komponen nitrogen (N)-non protein tinggal dalam larutan.

 Setelah penyaringan , N dalam filtrat ditetapkan dengan

metode kjeldahl.
Uji Nitrogen Non protein pada ikan
tongkol
Ditimbang 2gr Sampel daging ikan tongkol, dimasukkan
kedalam labu kjeldal
Ditambahkan 50ml aquades dan diberi batu didih, tunggu
hingga mendidih tetapi jaga jangan sampai mengering
Ditambahkan 2ml Aluminium sulfat , campur sampai merata,
panaskan kembali sampai mendidih kemudian tambahkan
larutan tembaga sulfat sebanyak 50ml campur hingga merata,
biarkan dingin.
Disaring dengan menggunakan kertas saring dan corong,
setelah itu filtrate yg didapatkan ditampung dalam labu kjeldal
kemudian ditetapkan kadar nitrogennya dengan menggunakan
metode kjeldal.
Penentuan Asam amino dengan
HPLC
Asam amino dalam protein dapat ditentukan jenis dan jumlahnya
dengan menggunakan metode HPLC.

Protein di hidrolisis dengan asam kuat (HCL 6N) sehingga asa –

asam amino penyusunnya dapat saling terpisah dan melalui kolom
penukar kation pada HPLC sehingga menghasilkan kromatogram.

Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram asam – asam

amino standar

Untuk mengetahui jenis asam amino, dapat membandingkan waktu

retensinya.

Untuk mengetahui jumlah asam amino, dapat membandingkan luas

kurvanya.
Penentuan alfa amino
Asam amino merupakan satu atom C yang mengikat gugus
amina, karboksil, hidrogen dan residu, sehingga atom c pusat
disebut c alfa . Karena gugus amina terikat pada c alfa, maka
senyawa tersebut merupakan asam alfa amino.
Penetapan alfa amino dapat menggunakan metode TNBS
maupun metode ninhidrin.
Prinsip Metode tnbs yaitu Gugus alfa amino dari suatu protein
dapat direaksikan dengan trinitro benzen sulfonat pada ph
tertentu dan membentuk senyawa berwarna yang dapat
diukur absorbannya pada panjang gelombang 340 nm.
Metode ini banyak diterapkan untuk bahan hewani atau
bahan nabati yang sedikit karbohidrat. Metode ini dapat juga
diterapkan untuk bahan ekstrak lipid.
Penetapan alfa amino dengan
Metode TNBS
Sampel sebanyak 1 ml menggunakan buffer fosfat pH 8,2.

Ditambah dengan 1 ml larutan TNBS 0,1% dan dipanaskan

pada penangas air pada suhu 40o C selama 2 jam.

Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan HCl 1 N.

Dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm.

Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan larutan leusin

sebagai standar.
Uji Ninhidrin
Ninhidrin adalah suatu senyawa oksidator kuat yang apabila
bereaksi dengan asam alfa amino akan menghasilkan warna
ungu.

Reagen ninhidrin berguna untuk menedeteksi asam amino

dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan.

Uji ninhidrin biasa dipakai polisi untuk mendapatkan sidik jari

di TKP, karena dalam keringat manusia terdapat asam amino.
Sehingga ketika di tempat tempat yang diperkirakan terdapat
sidik jari, polisi menyemprot daerah tersebut dengan reagen
ninhidrin.
Penetapan TVBN

Senyawa TVBN (total volatil base nitrogen) merupakan

senyawa nitrogen volatil yang dihasilkan dari dekomposisi
bahan yang kaya protein oleh mikroba.

Prosedurnya yaitu sampel diekstraksi dengan TCA 5% (tri

chloro acetic acid) sehingga protein mengendap dan
komponen N volatil larut dalam TCA. Ekstrak TCA didestilasi
dan komponen N ditangkap HCl. Destilat dititrasi dengan
NaOH sehingga TVBN diketahui.
…Terima kasih…