VALIDASI METODE PEMERIKSAAN

MIKROBIOLOGI
 Kelompok 4
1. Aldina Salsabila (P17334119047)
2. Alya Nur Afifanhya H (P17334119049)
3. Anis Kholishotun Nisa (P17334119050)
4. Legiaputri L. Nurulhidayah (P17334119060)
5. Rindianti Nur Islami (P17334119075)
6. Rizkika Aprillia (P17334119077)
7. Salsabila Hidayani (P17334119078)
8. Salwa Nadia (P17334119081)
9. Shahilla Auliyya Nurilhasni (P17334119084)
10.Yanti Widiastuti (P17334119089)
Kelas : D3 – 2B
 Validasi Metode Pemeriksaan adalah proses
pembuktian atau konfirmasi pengujian yang objektif
di Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi
persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan
tujuan penggunaannya.
 Tujuan Syarat
Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, Menggunakan instrumen dan
01 selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus peralatan yang terkalibrasi
menguji kelemahan dan keterbatasan metode.
Dilaksanakan oleh pesonel
yang kompeten
Menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi Media/Reagent yang
02 kinerja metode dan mengetahui besarnya digunakan sesuai
pengaruh itu terhadap hasil analisis. . spesifikasinya

Kondisi lingkungan memadai

Melakukan verifikasi atau membuktikan
03 kinerja metode analisis baku yang
diadopsi/digunakan laboratorium.
 Jenis Validasi Metode
01 Primer 02
Validasi primer dilakukan jika
laboratorium menggunakan metode
analisis “baru” hasil pengembangan,
atau metode yang dimodifikasi
terhadap suatu metode standar.
Sekunder
Validasi sekunder dilakukan untuk
verifikasi, jika laboratorium
menggunakan atau mengadopsi
metode standar yang telah divalidasi.
 Faktor yang Menjadi Pertimbangan
Pemilihan Metode

Asal dan Penguasaan Kompetensi

Status metode. laboratorium terhadap sumber daya
teknologinya dan manusia/ analis
Peralatan laboratorium dan Ketersediaan
yang memadai. akomodasi

Biaya dan Kemudahan

waktu yang pengaplikasian
diperlukan metode
 Tahap Persiapan Validasi

Perencanaan dan Persyaratan

Persiapan Sampel Mikroorganisme

Kontaminasi
Perencanaan dan Persiapan Sampel
Hal-hal yang harus disiapkan dalam melakukan validasi:

Menggunakan peralatan yang sudah dikalibrasi

01

Dilakukan oleh personil yang kompeten, yang

mempunyai pengalaman dan skill
02

Media/reagent yang digunakan sesuai dengan

spesifikasinya
03

Sampel yang hendak digunakan telah tersedia dalam

jumlah yang sesuai dengan kebutuhan
04

Program statistika untuk menghitung, mengevaluasi

dan menginterpretasikan hasil pengujian
05
Perencanaan dan Persiapan Sampel
Dalam melakukan validasi diperlukan sampel, sebelum menggunakan
sampel ada beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain:

Untuk kategori sampel makanan itu

Nomor sampel dan kategori dibagi menjadi 2, yaitu:
makanan yang diambil Makanan tanpa proses
Makanan dengan proses

Adanya kontaminasi secara alami atau tidak

Yang terdiri atas kondisi saat

Inokulasi sampel pengkulturan, level inokulasi dn flora
kompetitif
 Persyaratan Mikroorganisme
Hal-hal yang harus diperhatikan antara lain:

1) Biasanya isolat, strain, 2) Mikroorganisme yang 3) Makanan mentah yang

serotipe atau spesies yang berasal dari makanan tanpa proses dapat
digunakan untuk setiap dengan proses biasanya stres diinokulasi dengan
jenis inokulasi dari sedangkan mikroorganisme organisme tanpa tekanan.
produk makanan berbeda- yang mengkontaminasi juga Inokulasi sampel jenis
beda, inokulasi harus ditekankan dalam makanan makanan padat jika
dilakukan dengan kultur ini.Mikroorganisme menjadi disimpan dalam kondisi
murni dari satu strain. stres bisa terjadi pada saat penyimpanan sesuai bisa
Inokulasi campuran tidak inokulasi ataupun pada saat membuat kondisi sampel
dianjurkan. proses pengolahan makanan. tetap stabil untuk dianalisis.
 Persyaratan Mikroorganisme
Jumlah mikroba dalam inokulum dan kontrol, yaitu:

Setiap jenis sampel makanan minimal dibagi menjadi 2 bagian. Satu

bagian sebagai kontrol negatif dan satu bagian lagi diinokulasi pada
tingkat yang menghasilkan pemulihan fraksional.
01

Sampel uji kontrol dan yang diinokulasi harus disiapkan pada waktu
yang sama. Mungkin disarankan untuk menyiapkan bagian ketiga
yang memiliki tingkat inokulum tinggi.
02
 Kontaminasi
Adapun hal yang harus dilakukan jika sampel uji terkontaminasi secara alami, yaitu:

Diperlukan 2 bagian dari setiap jenis makanan yang terkontaminasi

01 secara alami.

Menghasilkan data inklusif dan eksklusif untuk membuktikan bahwa

metode tersebut reaktif untuk serotipe utama dari mikroorganisme
02 tertentu dan non-reaktif terhadap mikroorganisme atau spesies
lainnya.
Pilih setidaknya 50 strain murni dari mikroorganisme spesifik dan pilih
03 sekurangnya 30 strain yang berpotensi kompetitif untuk dianalisis
sebagai sediaan kultur murni.
Untuk metode Salmonella, jumlah tekanan analit target ditingkatkan
04 menjadi 100 strain yang dipilih untuk mewakili sebagian besar
serotipe Salmonella yang diketahui.
Kontrol untuk pengujian kontaminasi dilakukan dengan cara, yaitu:

1. Sampel uji yang diinokulasi dan kontrol yang diinokulasi

disiapkan pada waktu yang sama. Jika ada bagian test kontrol
yang tidak diinokulasi maka positif untuk mikroorganisme yang
diinokulasi, hasilnya menjadi tidak valid dan harus dilakukan
pengulangan karena diasumsikan telah terjadi kontaminasi
silang.

2. Sampel kontrol tidak termasuk dalam jenis makanan yang

terkontaminasi secara alami.
 Parameter Validasi Analisis Mikrobiologi

Akurasi/ Presisi/ 03
01 02 Sensitivitas
kecermtan keseksamaan
 Akurasi adalah kemampuan metode untuk  
Presisi adalah tingkat kesesuaian Sensitifitas (Kepekaan) yaitu
mengukur dan mendeteksi nilai actual atau nilai antara hasil pengujian individual Kemampuan metode untuk
sebenarnya dari mikroorganisme target dalam dengan hasil rata-rata pengujian mendeteksi/mengukur
sampel. berulang pada sampel yang mikroorganisme target dalam
Teknik analisis yang dilakukan dengan homogen dengan kondisi jumlah sekecil mungkin atau
menambahkan kultur acuan pada konsentrasi pengujian yang sama. kemampuan metode untuk
tertentu dalam suatu matriks contoh. Peritungan : RSD = mendeteksi/mengukur
x 100% CV (Coefisien of Variation) = mikroorganisme tertentu secara
H = Hasil Pengujian dengan metode (sample + RSD x 100% cermat dan seksama dengan
spike) – sample Syarat : adanya mikroorganisme asing
A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike) RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02) atau bahan/matriks lain.
Syarat > 70% CV = max.10%
Catatan : Gunakan sample yang tidak
megandung MO
 Parameter Validasi Analisis Mikrobiologi
04 Selektivitas
& Spesifitas
Selektifitas adalah kemampuan
metode analisis untuk
membedakan analat yang akan
ditetapkan terhadap senyawaan
lain yang terdapat dalam
sampel (Wood et al, 1998).
Selektifitas atau spesifitas suatu
metode menyatakan
kemampuan penetapan secara
akurat dan khusus dari
komponen lain yang dicurigai
dapat mengganggu kondisi
pengujian.
05 Linearitas
Keliniearan adalah
kemampuan metode analisis
yang menunjukkan bahwa
larutan sampel yang berada
dalam rentang konsentrasi
memiliki respon analit yang
proporsional dengan
konsentrasi, secara langsung
ataupun melalui transformasi
matematika.
06 Rentang Hitung 07 Robustness
yang diterima (Ketangguhan
( acceptable ) )
Pengujian Ketangguhan
sebenarnya harus dilakukan
Yaitu batas atas dan
pada saat fase pengembangan
batas bawah dari
metode dan tergantung pada
rentang perhitungan
faktor-faktor yang
berpengaruh pada pengujian.
Jika pengujian sangat peka
terhadap perubahan dalam
kondisi analisis,maka kondisi
pengujian hendaknya
dikendalikan atau dilakukan
dengan penuh kehati- hatian.
Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan :

Stabilitas Sampel

Pengaruh suhu inkubasi

Pengaruh waktu inkubasi

Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian

mikroba tertentu)
Pengaruh jenis media (nutrisi) dan sebagainya
 Metode Analisis
Mikrobiologi Pangan
01 Metode Kualitatif
Metode analisis yang responsnya
adalah ada atau tidaknya
anilit/mikroba yang terdeteksi baik
secara langsung maupun tidak
langsung.
02 Metode Kuantitatif
Metode analisis yang responsnya
adalah jumlah analit yang diukur baik
secara langsung (misalnya
pencacahan dalam massa atau
volume), atau secara tidak langsung
(misalnya penyerapan warna,
impedansi, dll.) dalam jumlah sampel
tertentu. Untuk metode kuantitatif,
indikator parameter termasuk tes
kualitatif dan pengulangan, reproduksi
dan penyimpangan standar relatif.
 Prosedur Validasi dan Verifikasi
a) Kuantitatif ( Hitungan Cawan)
1. Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali
2. Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode
spike sample) atau tidak mengandung organisme target
3. Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan semua
populasi
b) Kuantitatif MPN (Most Probable Number)
Kriteria :
1) Sensitifity
2) Specificity
3) False positive rate
4) False negatife rate
5) Efficiency
6) Confidence limit : 95%
Prosedur Validasi dan Verifikasi
Prosedur :
1. Siapkan sample (kontaminasi alami atau sengaja)
sesuai prosedur.
2. Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-
tabung pertumbuhan
3. Hitung jumlah tabung yang positif dan negative
4. Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang
terdapat pada cawan atau setiap tabung yang positif
dan negative
5. Hitung sensitifitas, spesifisitas, positif palsu, negative
palsu dan efisiensi.
 Prosedur Validasi dan Verifikasi
c) Kualitatif
1. Lakukan pengujian sedikinya 10 kali
2. Lakukan juga sample tanpa
diinokulasi (bila menggunakan
metode spike sample) atau tidak
menggunakan organisme target
3. Hitung sensitifitas, spesifisitas,
positif palsu, negative palsu dan
efisiensi.
Thank you!!!