TEKNIK

AMPLIFIKA
SI ASAM
NUKLEAT
SITTI HADIJAH
Konsep Polymerase Chain Reaction
(PCR)
PCR merupakan teknologi yang mampu melipat gandakan secuplik fragmen DNA
yang terdapat dalam komplek makromolekul genom dari berbagai sumber (hewan,
tumbuhan, bakteri, dan virus) menjadi 2 kali lipatnya secara enzimatis

Teknologi ini juga dikenal dengan tingkat sensitifitas yang cukup tinggi karena
hanya membutuhkan secuplik sampel DNA saja untuk mendapatkan jutaan kopi
DNA baru
 Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis
enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.
 Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan
jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali.
 Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali
jumlahnya.
 Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.
● Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara
amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan
amplifikasi urutan non-target.
● Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan
perkembangan biologi molekuler.
● PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus,
diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal
and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis
of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.
Teknologi polymerase chain reaction
(PCR) ditemukan oleh Kary Banks
Mullis pada era 1980an.
 Sejarah PCR
Pada musim semi 1983, ide tentang teknik pengujian DNA itu muncul kali
pertama saat Mullis merenungkan tentang uji diagnostik klinis yang sedang
dikembangkannya
Uji diagnostik itu didasarkan pada strategi sekuensing pada deoxynucleotide
berbasis Frederick Sanger
Tujuannya adalah menggunakan DNA polimerase dan memasangkan
oligonukleotida primer untuk membaca nukleotida tunggal dalam DNA manusia
yang terletak di antara keduanya.
 1
INTRODUCTIO
Kary B. Mullis (kiri)
saat menerima
Nobel prize bidang
N kimia Tahun 1993
 Prinsip Dasar
Amplifikasi PCR
Prinsip yang terjadi dalam
sintesis DNA sama dengan
proses replikasi
DNA yang terjadi di dalam sel
(in vivo).
MERCURY VENUS
Dalam proses PCR, materi pokok
berupa DNA untai ganda hasil
isolasi suatu
organisma, di antaranya
direaksikan dengan komponen-
komponen PCR yang terdiri
Setelah larutan mix
dari: PCR tersebut
 enzim DNA polymerase, homogen, larutan
 deoxynucleoside triphosphate
(dNTPs),
tersebut siap
 MgCl2, dan direaksikan dalam
 Primer (potongan pendek DNA mesin PCR
untai tunggal) yang mengawali
sintesis DNA
 Prinsip dasar PCR adalah proses siklus yang

berulang
PCR dimulai dengan cetakan DNA dalam jumlah yang sedikit (nanogram= ng),
kemudian setelah mengalami beberapa siklus amplifikasi, jumlah copy DNA akan
menjadi jutaan kali lipat.
 Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid
dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan akan mengamplifikasi
urutan yang diinginkan.
 Dasar siklus PCR umumnya terdiri dari 30-35 siklus meliputi denaturasi (95°C)
 selama 30 detik, annealing (55–60°C) selama 30 detik dan ekstensi (72°C), waktu
 tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk
amplifikasi.
 Peningkatan jumlah siklus PCR di atas 35 siklus tidak memberikan efek yang
positif
Gambar. A. Ilustrasi Skematik Profil Suhu Pada PCR dan B. Siklus Dasar PCR. Sistem tiga
suhu yang berbeda
Terdapat tiga tahap penting dalam
proses PCR yang selalu terulang
dalam 30- 40
siklus dan berlangsung dengan
cepat, yaitu:
(1) denaturasi (95°C),
(2) annealing (55–60°C)
(3) ekstensi (72°C).
 Denaturasi untai
ganda DNA

 Tahap pertama pada sistem amplifikasi PCR

adalah denaturasi DNA sampel dengan
menaikkan suhu dalam tabung reaksi sampai
95ºC.
 Tabung reaksi ini berisi DNA target,
dua primer oligonukleotida dalam jumlah berlebih,
Taq DNA polymerase yang tahan panas, keempat
deoksiribonukleotida dan bufer yang
mengandung Mg.
Next…
 Selama proses denaturasi, untai ganda DNA (dsDNA)
mencair dan ikatannya terbuka sehingga terjadi
pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA
(ssDNA).
● Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis
selama proses PCR ,berlangsung selama 1-2 menit
● Suhu yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan
untai ganda DNA.
 Catatan…
Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini dapat mengakibatkan gagalnya
proses PCR.
waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktivitas
enzim Taq DNA polymerase
Aktivitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2
jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5ºC ,
95ºC dan 97,5ºC.
Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC,
(suhu 94ºC merupakan pilihan standar)
 Catatan…

Renaturasi merupakan suatu proses yang dapat terjadi secara in vivo

maupun in vitro. Renaturasi in vitro merupakan suatu fenomena yang
sangat berguna untuk analisis molekuler, misalnya untuk mengetahui
kesamaan atau kedekatan genetis antara suatu organisme dengan
organisme lain, untuk mendeteksi macam RNA tertentu, untuk
mengetahui apakah suatu urutan nukleutida tertentu ada lebih dari
satu pada suatu jasad, serta untuk mengetahui lokasi spesifik suatu
urutan nukleutida pada genom
Gambar Tahapan Pertama PCR: Denaturasi
 Primer
Annealing
- Tahap kedua pada sistem amplifikasi PCR adalah primer
annealing.
Primer Annealing merupakan pengenalan (annealing)
suatu primer terhadap DNA target
tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan
GC, dan konsentrasi primer.
 Next….

● Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik.

● Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi suhunya.
● Kisaran suhu penempelan yang digunakan adalah antara 37ºC - 60ºC.
● Pada tahap ini, primer menempel pada sekuen komplementernya pada DNA
target
Next………
● Optimalisasi suhu annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan cetakan DNA.
● Cara termudah menghitung untuk mendapatkan melting-
temperatur yang tepat menggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +
{ (A+T)x2}.
● Suhu annealing biasanya 5ºC di bawah Tm primer yang
sebenarnya.
● Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen: buffer,
konsentrasi primer dan cetakan DNA.
 Next…………

● Amplifikasi akan lebih efisien bila suhu annealing tidak kurang dari 37ºC
agar tidak terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang
salah
● Suhu 55ºC yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya
merupakan kompromi karena pada suhu sekitar 55ºC akan dihasilkan
produk amplifikasi yang mempunyai spesifisitas tinggi.
● Primer akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan
primer itu sendiri, dan menempel pada posisi ujung-5’ dari untai DNA
target yang telah terurai pada tahap sebelumnya yaitu tahap denaturasi
 Next…
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah

1. primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50-60% G+C dan

untuk primer sebaiknya sama.

2. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri sebaiknya tidak

saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya
struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR.
Gambar tahapan kedua PCR: annealing
 Ekstensi/ Elongasi
Pada tahap extension ini terjadi proses
pemanjangan untai baru DNA, dimulai
SIMILARITIES
dari posisi primer yang telah menempel di
urutan basa nukleotida DNA target yang
akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung
3’ dari untai tunggal DNA.
Pada setiap satu kilobase (1000pb)
yang akan diamplifikasi memerlukan
waktu 1 menit. Sedang bila kurang
dari 500pb hanya 30 detik dan pada
kisaran 500 pb ,tapi kurang dari 1Kb
perlu waktu 45 detik.
apabila lebih dari 1Kb akan
memerlukan waktu 2 menit di setiap
siklusnya.
temperatur ekstensi berkisar antara
70-72°C.
Tahapan Ketiga PCR: Ekstenzi/Elongasi
 Contoh pengaturan suhu amplifikasi
PCR
Siklus Denaturasi Annealing Polimerase

Pertama 10 menit , 94ºC 2 menit, 55°C 2 menit, 72°C

2 - 29 1 menit, 94°C 2 menit, 55°C 2 menit, 72°C

10 menit, 94°C;
Terakhir Ditahan pada 4°C
2 menit, 55°C 10 menit, 72°C
 Komponen PCR
DNA cetakan (template) yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan,

oligonukleotida primer spesifik yaitu suatu sekuen oligonukleotida

pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis
rantai DNA,

deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) terdiri

atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP dan (
enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan
katalisi reaksi sintesis rantai DNA. yang thermostabil.
 1. Template DNA
Fungsi : sebagai cetakan dapat berupa :
untuk pembentukan - DNA kromosom,
- DNA plasmid atau
molekul DNA baru yang
- fragmen DNA ( apapun
sama DNA cetakan tersebut, harus
mengandung fragmen DNA
target yang dituju
 REVIEWING CONCEPTS
Prinsip isolasi DNA kromosom
atau DNA plasmid adalah
pemecahan dinding sel diikuti
dengan pemisahan DNA
kromosom / DNA plasmid dari
komponen-komponen lain.
Tujuan Isolasi DNA ketidakmurnian suspensi DNA
dapat mempengaruhi reaksi
Untuk mendapatkan
amplifikasi dan dapat
kualitas DNA yg baik
menghambat kerja enzim DNA
dan Murni
polymerase

Catatan: Ukuran target amplifikasi

amplifikasi PCR masih dapat bekerja
dalam suspensi kasar : koloni
bakteri.
Bakteri tidak perlu diekstraksi dan
secara langsung dicampurkan pada
larutan kit PCR sebagai cetakan
biasanya kurang dari 1000
pasangan basa (bp, base
pair) /1kb,
Hasil amplifikasi yang
efisien antara 100-400bp
produk yang panjang rentan
terhadap inhibitor yang
mempengaruhi kerja enzim
DNA polimerase dan waktu
yang diperlukan lebih lama
Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan genetik dari
daerah/ urutan nukleotida yang ditargetkan

Perubahan atau hilangnya sebagian urutan target akan

berakibat pada hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid
yang membawa sifat virulensi suatu bakteri adalah salah
satu contoh elemen genetik yang potensial tidak stabil.
Elemen genetik ini bisa hilang saat isolasi atau pemindahan
serial

sebaiknya amplifikasi segera dilakukan setelah isolasi DNA selesai

2. Primers
fungsi
sebagai pembatas fragmen DNA
target yang akan diamplifikasi dan
juga menyediakan gugus hidroksi
(-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA.
 Perancangan Primer dilakukan
berdasarkan urutan DNA atau urutan
protein yg dituju
Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan/
didownload dari database GenBank
Apabila urutan DNA maupun urutan
protein yang dituju belum diketahui
maka perancangan primer dapat
didasarkan pada hasil analisis Ketentuan penyusunan
homologi dari urutan DNA atau
protein yang telah diketahui primer : primer disusun dari
mempunyai hubungan kekerabatan urutan oligonukleotida
yang terdekat
sepanjang 15-32 pasangan
basa (pb) pada ujung -5’ pita
DNA cetakan maupun
komplemennya
Kriteria perancangan
Primer: ONLINE
1. Panjang Primer : 18 – 30 Pasangan basa COURSE
2. Komposisi Primer :
a. urutan nukleotida yg sama dihindari krn dpt menurunkan
spesifitas primer, memungkinkan terjadi misspriming
(prnrmprlan primer di tempat lain yg tdk diinginkan)
b. % jlh G dan C sebaiknya sama /lebih besar dr DNA target
c. Urutan pada nukleotida 3’ sebaiknya G atau C karena
nukleotida T dan A lebih toleran untuk mismatch
3. Melting Temperatur (Tm) : berpengaruh terhadap pemilihan suhu LEARN
annealing , berkisar 50 ºC -65ºC
4. Interaksi Primer-Primer: self-homology dan cross homology ,
misspriming
 Nukleotida (dNTPs) : suatu
campuran nukleotida yang terdiri atas
:
Nucleotides/
Nukleotida - dATP (deoksiadenosin trifosfat),
(dNTPs) - dTTP (deoksitimidin trifosfat) ,
- dCTP (deoksisitidin trifosfat)
- dGTP (deoksiguanosin trifosfat)
dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam
proses ekstensi DNA.
dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3’ dari primer dan
membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA
cetakan. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus
ditentukan

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah

200 μM. Pada konsentrasi ini, sangat penting untuk mengatur
konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km yaitu untuk
setiap dNTP 50mM, harus selalu diatur pH7,0.
Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan
dengan enzim polimerase. pada konsentrasi rendah akan
memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi
hasil akhir.
Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan
mengubah secara bebas.
 DNA polimerase
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis
untuk reaksi polimerisasi DNA

diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik

oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur
95ºC.

Jelaskan jenis-jenis DNA

Polimerase
 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
MgCl2 bertindak sebagai kofaktor
Fungsi buffer adalah untuk yang berfungsi menstimulasi
menjamin pH medium aktivitas DNA polimerase. MgCl2
akan meningkatkan interaksi primer
ion Mg2+ dengan templat/ cetakan yang
membentuk komplek larut dengan
berasal dari MgCl2 dNTP (senyawa antara).
 PCR Thermal Cycler (Mesin PCR)
alat yang dipergunakan untuk
mengamplifikasi atau menggandakan untaian basa-
basa DNA yang dibatasi oleh pasangan
primer pengapitnya melalui pengaturan suhu dan
penggunaan enzim tahan panas tinggi
Gambar alat PCR
Next…
Gambar RT – PCR dan hasil analisis
 Tugas
Latihan
1) Jelaskan:
a. sejarah pengembangan teknik PCR!
b. kelebihan teknik PCR secara umum sehingga banyak diterapkan di berbagai
bidang
2) Jelaskan tentang pengertian PCR berdasarkan beberapa definisi yang sudah
dijelaskan
3) Jelaskan tahapan dan tujuan masing-masing tahapan yang terjadi pada proses PCR
4) Jelaskan:
a. komponen utama dan masing-masing fungsinya pada Proses PCR
b. komponen selain utama beserta masing-masing fungsinya yang juga penting
pada proses PCR
Terima Kasih