ANALISIS PROTEIN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
JURUSAN ANALIS KESEHATAAN
DIPLOMA IV
2020
PENDAHULUAN
Protein berfungsi sebagia zat pembangun, zat pengatur dan
sumber tenaga.
Makromolekul, yg tersusun atas unsur utama C, O, H dan N.

Ciri khas molekul protein :

1) BM besar, sehingga mudah mengalami perubahan fisik dan
biologi.
2) Struktur molekul protein mengandung unsur N relatif
banyak, sehingga keberadaan protein dalam bahan dp
ditentukan berdasarkan kandungan unsur N.
3) Protein mrpk polimer yg tersusun oleh banyak monomer
asam amino, shg protein di dlm bahan pangan juga banyak
jenisnya
TUUAN ANALISIS PROTEIN
Menera jumlah atau kandungan protein dlm bahan pangan

Menentukan tk kualitas protein dr sudut gizi

Menelaah protein sbg suatu bahan kimia, mis biokimia,

fisiologi
JUMLAH UNSUR DLM MOLEKUL PROTEIN

No Jenis Unsur Jumlah (%)

1 Karbon (C) 50 - 55
2 Oksigen (O) 20 -25
3 Nitrogen (N) 15-18
4 Hidrogen (H) 5-7
5 Belerang (S) 0,4 – 2,5
6 Posfor (P) Sedikit
7 Besi (Fe) sedikit
8 Tembaga (Cu) Sedikit
METODE ANALISIS PROTEIN KUALITATIF
reaksi Xantoprotein,
reaksi Hopkins-Cole,
reaksi Millon,
reaksi Nitroprusida,
reaksi Sakaguchi.
Reaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati

ke dalam larutan protein.
Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat
berubah menjadi kuning apabila dipanaskan.
Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang
terdapat pada molekul protein.
Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin,
fenilalanin dan triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat
direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang
mengandung asam glioksilat.
Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk
magnesium dalam air.
Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam
sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk
lapisan di bawah larutan protein.
Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada
batas antara kedua lapisan tersebut.
3. Reaksi Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat

dalam asam nitrat.
Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein,
akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah
menjadi merah oleh pemanasan.
Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena
terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil
yang berwarna.
4. Reaksi Natrium nitroprusida
Natrium nitroprusida dalam larutan amoniak akan
menghasilkan warna merah dengan protein yang
mempunyai gugus –SH bebas.
Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan
hasil positif.
5. Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan
natriumhipobromit.
Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila
ada gugus guanidin.
Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat
menghasilkan warna merah.
6. Metode Biuret

Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian

ditambahkan larutan CuSO4 encer.
Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa senyawa yang
mengandung gugus amida asam yang berada bersama
gugus amida yang lain.
Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan
timbulnya warna merah violet atau biru violet.
METODE ANALISIS PROTEIN

Kjeldhal
Biuret
Lowry
Pengikatan zat warna
PRINSIP
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk
penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan
senyawa yang mengandung nitrogen.
Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis
dengan katalisator yang sesuai sehingga akan
menghasilkan amonium sulfat.
Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang
terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan
penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
TAHAPAN METODE KJELDAHL
1. Detruksi
2. Destilasi
3. Titrasi
PROSES DETRUKSI DAN DESTILASI SECARA
MANUAL
TAHAP DETRUKSI
Sampel dipanaskan dlm asam sulfat pekat, sehingga bahan
terdetruksi menjadi unsur – unsurnya. Hasil akhir pada
tahap detruksi ini adalah terbentuknya amonium sulfat.
Untuk mempercepat perlu ditambah katalisator :
Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1)
K2SO4
CuSO4
Selain campuran di atas bisa juga digunakan katalisator
siap pakai, mis : seleniun reagen miture.
Reaksi
(CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4
DETRUKSI
TAHAP DESTILASI

Amm Sulfat hasil dr detruksi dipecah menjadi amonia

(NH3) dgn cara penambahan NaOH dan pemanasan.

Selanjutnya NH3 ditangkap dgn larutan asam standar,

sampai destilasi tdk bereaksi basis.

Larutan asam standar yag dapat digunakan yaitu : HCl atau

asam borat 4%
DESTILASI
TAHAP TITRASI
Apabila digunakan HCl (sebagai penampung destilat), mk
sisa HCl yg tdk bereaksi dengan NH3 dititrasi dengan
NaOH 0,1N

Perhitungan
ml blanko – ml sampel x N NaOH 14.008 100%
berat sampel (g )
TAHAP TITRASI
Apabila digunakan asam borat (sebagai penampung
destilat), mk jumlah asam borat yang bereaksi dengan HN3
dititrasi HCl 0,1 N.

Perhitungan
ml sampel – ml blanko x N HCl 14.008 x 100%
berat sampel (g )
Setelah diperoleh prosentase N , maka kadar protein sampel
dp dihitung dengan cara mengalikan dengan faktor
konversi N

Faktor konversi Ntergantung pada presentase/jumlah unsur

N yg menyusun protein.
FAKTOR KONVERSI N
No JENIS BAHAN KF N
1 Biji – bijian 6,25
2 Buah – buahan 6,25
3 Makanan pada umumnya 6,25
4 Makanan ternak 6,25
5 Beras 5,95
6 Roti 5,70
7 Kedelai 5,75
8 Susu 6,38
9 Kacang tanah 5,46
10 Gelatin 5,55
METODE BIURET

Prinsip dalam larutan basa, Cu 2+ membentuk komplek

dgn ikatan peptida (-CO-NH-) dr suatu protein yg
membentuk warna ungu dengan absorbansi 540 nm.
Besarnya absorban tsb berbanding langsung dengan
konsentrasi protein dan tidak tergantung dari jenis protein,
karena semua protein pada dasarnya mempunyai jumlah
ikatan peptida yang sama persatuan berat.
HAL YG PERLU DIPERHATIKAN

1. Jumlah sampel harus mengandung protein sekitar 1 – 10

mg/ml

2. Senyawa penggangu diantisipasi :

a) Urea, krn mengandung gugus –CO- NH –
b) Gula pereduksi, yang bereaksi dengan Cu2+

Metode biuret mempunyai ketepatan lebih besar dr

Kjeldhal
PROSEDUR BIURET
Sebanyak 4 ml lart protein ditambah 6 ml pereaksi ( reagen
biuret), kemudian didiamkan selama 10 menit pada suhu
37 ⁰C, atau didiamkan selam 30 menit pada suhu 30 ⁰C.
Intensitas warna ungu laarutan diukur absorbansinya
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540
nm.
Kurva standar menggunakan lart protein serum albumin
(BSA, bovine serum albumin) secara seri mis 0,1 – 1,0 %
Kadar protein dihitung berdasar persamaan regresi kurva
standar
Y = a + bX
Y = nilai absoransi
X = konsentrasi protein
METODE LOWRY

Prinsip adl protein dengan asam posfotungstat dan

posomolidat pd suasana alkalis dp membentuk warna biru
yg instensitasnya tergantung pada konsentrasi protein
asam amino yang bereaksi dengan reagen Lowry adalah
tirosin dan triptofan.
METODE

Metode hampir sama dengan metode Biuret.

Perbedaan adalah reagen yang digunakan. Dalam analisis
ini digunakan reagen Lowry dan perlu disiapkan larutan
protein untuk pembuatan kurva standar.

Sensitifitas metode Lowry lebih tinggi (10 - 20 x)dibanding

dengan metode Biuret.

Penggangu adalah adanya phenol, krn membentuk warna

biru, tetapi dp dihilangkan dengan cara pengendapan
menggunakan TCA (Tri Chloro Acetic acid)
METODE PENGIKATAN ZAT WARNA/PENGECATAN

Prinsip
Zat warna yang bereaksi dengan gugus polar protein
mementuk kompleks tak larut. Komplek dipisahkan
(dengan sentrifus dan penyaringan) dan diukur densitas
optiknya.

Bahan pewarna yg digunakan : Orange G, Orange 12,

Amido Black
Sisa bahan pewarna yang tdk bereaksi diukur dengan
diukur dengan kolorimeteer. Dalam analisis ini diperlukan
kurva standar hubungan antara densitas optik dengan
kadar protein.
PENETAPAN ALFA AMINO NITROGEN

Pada prinsipnya gugus alfa amino dr suatu protein dapat

direaksikan dengan Trinitrobenzen sulfonat pd pH
tertentu dan mementuk senyaa berwarna yang dapat
diukur asorbansinya pada panjang gelomang 340 nm.

Metode ini banyak di terapkan pada bahan dr hewani atau

nabati yang sedikit karbohidrat. Metode ini juga digunakan
untuk ekstrak lipid.
PENETUAN ASAM AMINO DGN HPLC

Protein dihidrolisis dg HC 6N, shg asam amino penyusus

dp terpisah. Melalui kolom penukar kation dr alat HPLC
(High Performance Liquid Chromatography),asam- asam
amino tsb dp ditentukan jenis dan jumlahnya. Hasil
kromatografi ini adal berupa pola elusi atau kromatogram.

Pola (kurva) elusi kromatografi diandngakan dg pola elusi

asam- asam amino standar. Untuk mengetahui jenis asam
amino dp memandingkan waktu retensi dengan standar.

Untuk mengetahui asam amino do membandingkan luasa

kurva sampel dengan standar.
PENENTUAN TVBN DAN TMA

Senyawa TVBN (Total Volatile Base Nitrogen) dan TMA

(Tri Methyl Amine), mrpk senyawa yang dihasilkan dr
dekomposisi bahan yang kaya protein oleh mikroba.

Pada prinsipnya analisis TVVBN dan TMA dilakukan

dengan cara ekstraksi sampel dengan Tri Chloro Acetic
Acid (TCA) 5% sehingga protein mengendap dan
komponen N volatile larut dalam TCA.
Ekstrak TCA didistilasi dan komponen N ditangkap HCl.
Distilasi dititrasi dengan NaOh sehingga TVBN diketahui