VALIDASI

METODE ANALISIS
Engrid Juni Astuti,M.Farm.,Apt
 Metode Analisis

Pengembangan Optimasi Pre-validasi

D Revalidasi Validasi
R&

QC
Implementasi
(rutin)
Calibrated Validation
Instruments Method

Routine Analytical Method

Calibrated System
Software Suitability

Qualified Person
Kategori Metode Analisis
Penetapan kadar komponen utama
I dalam bahan baku obat atau bahan
aktif dalam sediaan farmasi

Penetapan cemaran atau hasil

II Degradasi
Penetapan kuantitatif (II a)
dan uji batas/kualitatif (II b)

III Penetapan karakteristik sediaan

(disolusi, pelepasan obat, dll)
IV
Metode analisis untuk identifikasi
 •Suatu proses (percobaan
laboratorium)
•Untuk membuktikan bahwa

Validasi karakteristik kinerja metode

Terminologi
analisis telah memenuhi
persyaratan yang telah ditetapkan
sebelumnya

•Suatu proses (percobaan

laboratorium)
Verifikasi •Untuk membuktikan bahwa
laboratorium mampu
menggunakan metode analisis
baku/standar pada kondisi nyata
di laboratoriumnya

Kualifikasi Kualifikasi instrumen:

DQ, IQ, OQ dan PQ
 Metode baku/Standar
Compendial Method Verifikasi
Verifikasi
(USP, FI, AOAC, ISO dll.)

 Metode tidak baku

 Metode pengembangan
 Metode baku yang
dimodifikasi Validasi
Validasi
 Metode baku yang
digunakan di luar
lingkup
 Tahapan Validasi Metode
Literature search
Pengembangan/
Telaah karakteristik Analit
optimasi Metode
Penyiapan bahan dan alat

Permintaan Pembuatan
Validasi
Validasi protokol Validasi

Metode
Penyerahan Percobaan
dokumen laboratorium sesuai
protokol validasi

Penyusunan Laporan
Analisis Data
Validasi
 Protokol Validasi/Verifikasi
• Metodologi atau prosedur bagaimana
percobaan atau pengujian parameter validasi
direncanakan
• Disusun secara rinci
• Penting dibuat sebelum pelaksanaan uji
parameter validasi
• Pelaksanaan validasi metode menjadi terarah
dan sistematis
• Disusun dalam format yang telah ditetapkan
 Isi Protokol Validasi/Verifikasi
• Cover
• Halaman Pengesahan
• Ruang lingkup
• Tujuan
• Bahan dan Alat
• Aspek Keamanan lab
• Prosedur percobaan
– akurasi
– presisi dll.
• Kriteria keberterimaan
• Daftar Rujukan
Karakteristik kinerja validasi metode USP and ICH

Presisi
Akurasi
Batas Deteksi
Validasi
Batas Kuantitasi
Metrode
Selektivitas/Spesifisitas
Linearitas
Rentang
Robustness/Ruggedness
System Suitability Test
USP Data Elements Required For Assay Validation

Assay Category 2
Analytical
Assay Category Assay
Performance
1 Quantitative Limit Tests Category 3
Parameter

Accuracy Yes Yes * *

Precision Yes Yes No Yes
Specificity Yes Yes Yes *
LOD No No Yes *
LOQ No Yes No *
Linearity Yes Yes No *
Range Yes Yes * *
Ruggedness Yes Yes Yes Yes
* May be required, depending on the nature of the specific test.
 ICH Validation Characteristics
Impurity testing
Type of
Analytical Identification Assay
Quantitative Limit Tests
Procedure

Accuracy No Yes No Yes

Precision

No Yes No Yes
Repeatability
Interm. Prec. No Yes No Yes
Specificity Yes Yes Yes Yes
LOD No No Yes No
LOQ No Yes No No
Linearity No Yes No Yes
Range No Yes No Yes
Pre-Validation: Stability testing
• Scope:
 Usage of autosampler for overnight runs with samples
in solution for hours in laboratory environment raises
concern about the stability of samples.
 e.g., degradation by hydrolysis, photolysis, adhesion to
glassware, etc.,
• Recommendations:
 Generate data to support standard and sample solution
stability under normal lab conditions for duration of
test procedure, e.g., 24 hours, 3-5 hours for TLC Profile
• Acceptance Criteria
 Maximal peak area difference is ± 2 %, compare to the
fresh solution
 No new Peaks and the analyte peak is still pure
 Percobaan Laboratorium pada Validasi Metode

Uji Selektivitas/
4
Spesifisitas
Uji terhadap
senyawa Ketegaran
1
pengganggu (Robustness/
dari matriks,
cemaran, hasil 3
Ruggedness)
degradasi

Linearitas/ 2 Presisi dan

Rentang; LOD Akurasi
dan LOQ
 Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH  menggunakan istilah

Specificity

IUPAC dan AOAC  menggunakan

istilah Selectivity

AOAC: Specificity  “highest selectivity”

Selektif:
Mampu membedakan antara senyawa analit
dengan derivat/degradan/ metabolit atau senyawa
pengganggu lainnya

Spesifik:
Mampu mengenal respons untuk analit
tunggal/murni
 Spesifisitas/Selektivitas

Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan:
• Blanko sampel/Placebo (Sampel minus analit)
• Zat Hasil degradasi (degradants)
• Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substances
• Zat metabolit (untuk bioanalisis)
 Spesifisitas/Selektivitas
• Blanko sampel/Placebo
 tidak menghasilkan
peak/noda dengan
waktu retensi/Rf yang
sama dengan analit

• Peak/noda analit
terpisah dari peak/noda
lainnya
(Rs ≥1,5)
Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)
●
pemisahan yang baik antar analit dan
komponen-komponen lainnya (misalnya
matriks, pengotor, produk hasil degradasi,
dan metabolit).
●
nilai resolusi (R atau Rs) harus lebih dari
1,5

Kromatografi

●
Faktor kemiripan (match factor)
atau indeks kemiripan (similarity
index) dimana match factor harus
berada di rentang 900-1000

Spektra UV-Vis

●
kemurnian puncak (peak purity)
Puncak dikatakan tidak murni
(0,0000-0,8900), terkontaminasi
(0,9000-0,9500), murni (0,9600-
1,0000)
 Linearitas (Linearity)
Kemampuan suatu
metode untuk
menunjukkan hubungan
secara langsung atau ●

Respon alat
proporsional antara ●

respons detektor dengan ●

●

perubahan konsentrasi ●

analit. A B C D
 Linieritas
A. Melalui analisis statistik Linear Regression (y = bx + a)
– Correlation Coefficient (r),
– y-intercept (a), slope (b),
– residual sum of squares

B. Disarankan menggunakan minimum 5 macam konsentrasi analit

- Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan dari sampel
hasil pengenceran
-Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran dan/atau larutan spike

C. ANOVA-linearity testing

D. Relative process standard deviation (Vxo)

 Rentang (Range)

• Interval antara konsentrasi terbesar

dan terkecil dari analit dalam sampel
• Memenuhi syarat dalam hal presisi,
akurasi dan linieritas
 Batas Deteksi

Batas Deteksi?

Batas Deteksi:
Konsentrasi terendah analit
dalam sampel yang masih
dapat terdeteksi
 Detection Limit Quantitation Limit
(DL) (QL)
• Lowest amount of  Lowest amount of
analyte in a sample analyte in a sample
that can be detected that can be quantified
but not necessarily with suitable accuracy
quantitated. and precision.
• Estimated by Signal to  Estimated by Signal to
Noise Ratio of 3:1. Noise Ratio of 10:1.
 Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi rendah Akurasi tinggi Akurasi tinggi Akurasi rendah

Presisi tinggi Presisi tinggi Presisi rendah Presisi rendah
 Akurasi

• Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan

kembali (% recovery)
• Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil
analisis antara metode yang divalidasi dengan
metode standar  uji t  harus tidak berbeda
makna
• Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap
blanko atau sampel.
 Akurasi
• Persen perolehan kembali (% recovery)

Kadar yang diperoleh

% Re c  x100%
Kadar sesungguhnya
Persyaratan untuk assay validation = 98-102%

• Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi

masing-masing 3 kali replikasi
• Adisi standar pada blanko/plasebo
 Analyte recovery at different concentration

Analyte Ingred. Analyte

Unit Mean recovery (%)
(%) ratio
100 1 100 % 98-102
≥ 10 10-1 10 % 98-102
≥1 10-2 1% 97-103
≥ 0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
 Presisi
•Kedekatan dari suatu seri pengukuran yang
diperoleh dari sampel yang homogen

•Dalam bentuk RSD (relative standard

deviation)

•Meliputi:
- Repeatability
- Intermediate Precision
- Reproducibility
Repeatability

• Kondisi sama pada interval waktu yang

singkat
• Satu larutan uji  disuntikkan berkali-kali
pada hari yang sama, alat yang sama,
analisis serta kondisi lain yang sama.
• Disebut juga Intra-assay precision
Intermediate Precision
Disebut juga “within-laboratory variations”.

Berbeda hari, atau analis, atau instrument

(dalam satu laboratorium)

Sebagai bagian Ruggedness menurut USP

 Reproducibility

• Repeatability test at different labs.

• Berbeda analisis atau instrument dari

laboratorium yang berbeda
 Uji Presisi

• Dianjurkan menggunakan 3 macam konsentrasi

berbeda, misal 80, 100 dan 120 % dari
konsentrasi target
• Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 replikasi
• Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang
berbeda dan analisis yang berbeda
• Kriteria penerimaan: tergantung kategori analisis
atau konsentrasi analit
• Contoh: RSD < 2% (kategori I)
 Analyte concentration vs precision

Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)

100 1 100 % 1.3
≥ 10 10-1 10 % 2.7
≥1 10-2 1% 2.8
≥ 0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30
 Robustness
• Definition: Capacity to remain unaffected by
small variations in method parameters
• Determination: Comparison results under
differing conditions with precision under normal
conditions
– Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase,
different column (lot/supplier), temperature,
flow rate.
 Ruggedness
• degree of reproducibility of test results
• obtained by the analysis of same samples
under a variety of conditions,
such as different laboratories, analysts,
instruments, different lot of reagents,
days etc.
 DOING CHEMICAL OR
PHARMACEUTICAL ANALYSIS
WITHOUT DOING VALIDATION METHOD
OF ANALYSIS AT FIRST
IS NONSENSE
THANK YOU