TEKNOLOGI DNA

REKOMBINAN
 DAHULU : Cara konvesional dengan
cara persilangan (inbreeding)
 Generasi yang baru berbeda sifat
genetiknya dari induknya
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 Merupakan kumpulan teknik atau metoda
yang digunakan untuk mengkombinasikan
gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-
teknik tersebut meliputi :
 Teknik untuk mengisolasi DNA
 Teknik untuk memotong DNA
 Teknik untuk menggabungkan atau
menyambung DNA
 Tknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel
hidup
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

 Contoh :
 Bakteri Rekombinan pembawa gen insulin
 Kapas trasngenik (membawa gen Bt
penyandi toksin dari Bacillus turingiensis
(Bt) yang mematikan haama ulat
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

 Transfer DMA atauperpindahan DNA ke

dalam bakteri bisa melalui 3 cara :
 Konjugasi perpindahan DNA dari 1 bakteri
ke bakteri lain melalui pili
 Transformasi masuknya DNA bebas ke
dalam bakteri
 Transduksi masuknya DNA dari bakteri
satu ke yang lain melalui fage (bakteriofage)
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

KONJUGASI
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
PERANGKAT YANG DIGUNAKAN
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 Sumber DNA target
 Enzim Restriksi
 Enzim DNA ligase
 Plasmid (vektor cloning/vektor expression)
 Transposom
 Pustaka genom (bisa juga dengan PCR)
 Enzim reverse transkriptase
 Pelacak DNA/RNA
Principles of cloning, vectors
and cloning strategies
DNA CLONING
 DNA cloning merupakan teknik untuk
mereproduksi fragmen DNA.
Hal ini dapat dicapai dengan dua pendekatan
yang berbeda:
 Berbasis sel
 Menggunakan polymerase chain reaction
(PCR).
 Vektor diperlukan untuk membawa fragmen
DNA yang diinginkan ke dalam sel inang     
DNA CLONING
 Kloning DNA memungkinkan salinan dari
setiap bagian tertentu dari urutan DNA (atau
RNA) yang akan dipilih di antara banyak
lainnya dan diproduksi dalam jumlah
terbatas.

 Teknik ini adalah tahap pertama dari

sebagian besar percobaan rekayasa genetika:
     ▪ produksi pustakaDNA
     ▪ PCR
     ▪ sequencing DNA  
 DNA CLONING
 Amplifikasi sekuens DNA
Propagasi urutan DNA
Sebuah molekul DNA tunggal harus dapat :
    ▪ Dipelajari : sequencing
    ▪ Dimanipulasi : melakukan Mutasi atau
rekayasa
    ▪ Expresi – Menghasilkan Protein
 CLONING PROCESS
 Gen yang ditargetkan
dipotong denganRE
(Enzim Restriksi)
 Plasmid Inang dipotong
denganRE yang sama
 Gen dimasukkan ke dalam
plasmid dan diligasi
dengan ligase
 Plasmid baru yang sudah
dimasuki insert
dimasukkan ke dalam
bakteri (melalui
transformasi)
 PLASMID CLONING STRATEGY
 Meliputi lima tahap :
Enzyme restriction memotong DNA sample.
Enzyme restriction memotong DNA plasmid vector.
Ligasi DNA sampel dan plasmid vector.
Transformation produk ligasi ke Bakteri
Penumbuhan bakteri dalam agar plate with seleksi
resistansi antibiotic.
STEP 1. RE MEMOTONG DNA
SAMPLE (mis. EcoRI G AATTC
CTTAA C
STEP 2. RE MEMOTONG DNA
PLASMID
STEP 3. LIGASI DARI DNA
SAMPLE DAN DNA PLASMID
 STEP 4. TRANSFORMASI DARI
PRODUK LIGASI
 Proses menstransfer DNA dari luar ke dalam sel
melalui disebut “transformation” (transformasi)
 Ada dua metode dasar yang umum digunakan untuk
mentransformasi ke bakteri. Pertama menggunakan
CaCl2 and kejut panas (heat shock) untuk
memungkinkan DNA masuk ke dalam sel.
 Metode kedua disebut electroporasi dengan
memberikan arus listrik tegangan tinggi secara
singkat untuk memfasilitasi DNA masuk bakteri.
CHEMICAL TRANSFORMATION
WITH CALCIUM CHLORIDE
TRANSFORMATION BY
ELECTROPORATION
STEP 5. GROWTH ON AGAR
PLATES
 STEP 5
 Koloni biru mewakili bakteri yang resisten-
ampisilin yang mengandung pVector dan
mengekpresikan fungsi fragment alpha dari
LacZ alpha.

Koloni putih mewakili bacteri Ampicillin-

resistant yang mengandung plasmid yang
berisi DNA insert dan tidak memproduksi
fragmen LacZ alpha
 ISTILAH YANG DIGUNAKAN
CLONING
 Rekombinasi DNA.
     Fragmen DNA yang akan dikloning
dimasukkan ke dalam vektor.
 Transformasi.
     DNA rekombinan masuk ke dalam sel inang
dan berproliferasi.
 Amplifikasi selektif.
     Antibiotik tertentu ditambahkan untuk
membunuh E. coli tanpa perlindungan apapun. E.
coli rekombinan dilindungi oleh gen resisten
antibiotik
 Isolasi klon DNA yang diinginkan  
 VECTOR KLONING

 Vektor kloning adalah molekul DNA yang digunakan untuk

"transportasi" urutan kloning antara host biologis dan
tempat
  
Vektor kloning dibagi empat sifat umum: ?
 1. Kemampuan untuk mempromosikan replikasi otonom.??
 2. Mengandung penanda genetik (biasanya dominan) untuk
seleksi.??
 3. Situs restriksi yang unik untuk memfasilitasi kloning dari
DNA insert.??
 4. Meminimalkan Jumlah DNA yang tidak penting untuk
mengoptimalkan kloning.
 PLASMIDS
 Sel bakteri mungkin
mengandung DNA
ekstra-kromosom
yang disebut plasmid.
 Plasmid biasanya
diwakili oleh kecil,
DNA melingkar.
 Beberapa plasmid ada
beberapa salinan
(copy) dalam sel
 PLASMID VECTORS
 Vektor plasmid adalah ≈ 1.2-3kb
dan mengandung:
 daerah awal replikasi (ORI)
 urutan
gen yang memungkinkan seleksi,
Berikut gen selektif adalah ampr,
yang mengkode enzim ᵝ-
laktamase, yang menginactifkan
ampisilin.
DNA eksogen dapat dimasukkan
ke dalam wilayah kurung (hijau)
 SELECTIVE MARKER
 Penanda selektif diperlukan untuk
pemeliharaan plasmid dalam sel.
Karena kehadiran penanda selektif
plasmid menjadi berguna bagi sel.
 Di bawah kondisi selektif, hanya sel-
sel yang mengandung plasmid
dengan penanda dipilih bisa bertahan
 Gen yang memberikan ketahanan
terhadap berbagai antibiotik
digunakan.
Gen yang membuat sel tahan
terhadap ampisilin, neomisin, atau
kloramfenikol digunakan
ORIGIN OF REPLICATION
 Origin of replication
(orI) segmen DNA yang
dikenali oleh enzim-
enzim untuk replikasi
 Tanpa ORI, DNA tidak
dapat melakukan
replikasi dalam sel.
 Banyak cloning vectors mengandung
banyak tempat kloning (multiple
cloning site or polylinker) : yaitu
segmen DNA dengan beberapa tempat
spesifik untuk pemotongan enzim
restriksi endo- nuclease yang saling
berdekatan.
 Restriction sites (daerah ER) dari
polylinker tidak ada ditempat lain di
dalam plasmid.
 Cutting plasmids with one of the
restriction enzymes that recognize a site
in the polylinker does not disrupt any of
the essential features of the vector
 MULTIPLE CLONING SITE

 Gen yang akan

dikloning dapat
dimasukkan ke dalam
vektor kloning di salah
satu situs restriksi
hadir di polylinker
(Segment pendek
mengandung daerah
pemotongan)
TYPES vektor kloning
CLONING VECTORS
 Berbagai jenis vektor kloning digunakan
untuk berbagai jenis eksperimen
kloning.
vektor yang dipilih sesuai dengan
ukuran dan jenis DNA yang akan
dikloning
 PLASMID VECTORS
 Vektor plasmid digunakan
untuk mengkloning DNA
ukuran mulai dari beberapa
pasangan basa sampai
beberapa ribu pasangan
basa (100 basis poin -10kb).
ColE1 berdasarkan, pUC
sarana?
 Komersial yang tersedia,
misalnya pGEM3, pBlueScript
Disadvantages using
plasmids
 Tidak dapat menerima fragmen
besar
 Ukuran berkisar dari 0- 10 kb
metode standar
 Jika lebih transformasi tidak efisien
BACTERIOPHAGE LAMBDA
 Fag lambda adalah bakteriofag atau fag, virus bakteri
yaitu, yang menggunakan E. coli sebagai tuan rumah.
 Struktur adalah bahwa dari fag yang khas: serat
kepala, ekor, ekor.
 Lambda genom virus: 48,5 kb DNA linier dengan 12
basis ssDNA "lengket end" di kedua ujungnya; tujuan
ini saling melengkapi dalam urutan dan dapat
berhibridisasi satu sama lain (ini adalah cos situs:
ujung kohesif).
Infeksi: serat ekor lambda menyerap ke reseptor
permukaan sel, kontrak ekor, dan DNA disuntikkan.
The circularizes DNA di lokasi cos, dan lambda mulai
siklus hidupnya dalam coli tuan E..
BACTERIOPHAGE LAMBDA
COSMID VECTOR
 Tujuan: sisipan besar
tiruan dari DNA: ukuran
~ 45 kb

 Fitur: Kosmid yang

Plasmid dengan satu
atau dua situs Lambda
Cos.
Kehadiran Cos situs
dapat dikemas vitro
DNA kosmid menjadi
partikel Lambda