NIM : 1881028 PENGERTIA N PRINSIP PEMISAHAN ELEKTROFORESIS (Andreas Manz dkk,2010) Lanjutan................. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008). Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006) JENIS-JENIS ELEKTROFORESIS Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving boundary) Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang. Dengan pengemban padat atau matriks seperti: A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah) B. Elektroforesis Kertas C. Elektroforesis selulosa asetat D.Elektroforesis gel E. Elektroforesis Kapiler Lanjutan............. A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah): Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas atau konformasi. B. Elektroforesis Kertas : Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut. C. Elektroforesis Tirai (kontinyu): Elektroforesis kontinu suatu elektroforesis yang dilakukan secara yaitu kontinu lanjutan................ D.Elektroforesis gel Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Gambar Elektroforesis Gel Gel Media Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam: Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151). Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan analit/DNA Ukuran molekul DNA. Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak. Konsentrasi gel. Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel. Bentuk Molekul Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel. Lanjutan...... Densitas muatan Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume molekul. Pori-pori gel. Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA. Voltase. Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan. Larutan buffer. Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi DNA akan lebih cepat. Elektroforesis Kapiler Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan kapiler elektroforesis sebagai partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Diagram Instrumen Elektroforesis Kapiler APLIKASI GE (produksi amplikasi PCR dari genomic DNA dari jenis starin bakteri Pseudomonas putida) APLIKASI CE (ANALISIS PEPTIDA) APLIKASI LAIN ELEKTROFORESIS Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya : Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA. Lanjutan............. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di- sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom DNA Fingerprinting Mendeteksi kelainan genetik. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen Mempelajari evolusi tingkat molecular Mengetahui variasi genetik yang ada di alam Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR KELEBIHAN DAN KEKURANGAN ELEKTROFORESIS KELEBIHAN : Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. KEKURANGAN : Memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak terlalu jelas memisah. TERIMA KASIH