BAB X

EKSTRAKSI & PURIFIKASI

Kapita Selekta
Biokimia I : Enzim
 A. PENDAHULUAN
Beberapa teknik isolasi enzim secara umum
adalah dikelompokkan menjadi:
 Metode klasik berupa distilasi dan ekstraksi
dengan pelarut organik (berdasarkan sifat umum
makromolekul : pH, kuat ion dan kelarutan).
Kurang digunakan lagi karena kaitannya dengan
kestabilan enzim.
 Perbedaan sifat protein globular : Mr, muatan
protein.
 Interaksi spesifik dan reversibel antara enzim
dengan substrat, koenzim, ligan.
Sejarah perkembangan teknik isolasi enzim
ditampilkan pada Tabel 1.

KSB I : Isolasi Enzim 2

Tabel 1. Beberapa penemuan berkaitan dengan
perkembangan metode separasi enzim
Penemuan Tahun
Pengendapan dengan alkohol 1833 (Payen & Persoz)
Adsorpsi spesifik amylase dengan 1910 (Starkenstein)
substrat insolubel
Penggunaan adsorbant untuk pemurnian 1922 (Willstater)
enzim
Penggunaan ultrasentrifugasi pertama 1923 (Svedberg & Nichols)
kali
Kristalisasi urease 1926 (Sumner)
80 enzim terisolasi 1930
Pengenalan resin penukar ion 1935 (Adams & Holmes)

KSB I : Isolasi Enzim 3

Kromatografi adsorpsi 1938-1941 (Zechmeister &
Brockman)
Metode pengendapan terfraksi dengan 1946 (Cohn)
pelarut organik
Kromatografi dengan hidroksi apatit 1951-1956 (Tiselius &
Swingle)
Pengenalan penukar ion selulosa 1956 (Sober & Peterson)
Pengenalan sepadex dan gel filtrasi 1959 (Porath & Flodin)
Elektrofokalisasi protein 1966 (Vesterberg)
Introduksi aktivasi dengan CNBr 1967 (Axen & Porath)
SDS Page Elektrolisis 1967 (Shapiro)
Introduksi konsep kromatografi afinitas 1968 (Cuatrecasas)
Kromatografi hidrofob 1971 (Yon, Er El & Shaltiel)
Lebih dari 2000 enzim terisolasi 1980
KSB I : Isolasi Enzim 4
SUMBER ENZIM
Sel Mikroorganisme
Paling banyak digunakan
Untuk menghasilkan enzim dalam jumlah banyak
perlu : sumber mikroorganisme, media dan nutrisi
pertumbuhan yang baik, serta kondisi fermentasi yang
tepat (pH, T, sumber O2, konsentrasi media, dsb)
Beberapa mikroorganisme sumber enzim secara
industri ditampilkan pada Tabel 2.
Sel Vegetatif
Hewan : beberapa organ seperti hati, pankreas, otot
dan cairan biologi

KSB I : Isolasi Enzim 5

Tabel 2. Beberapa mikroorganisme sumber enzim
yang dimanfaatkan secara industri
Mikroorganisme Enzim
Bakteri
Bacillus amiloquefaciens Amilase
Glukanase
Protease (netral)
licheniformis Amilase
Protease (basa)
coagulans Glukosa isomerase (E)
Actinomycetes actinoplanes (sp) Glukosa isomerase (E)
Streptomyces (sp) Glukosa isomerase (E)
Escheria coli Penisilin asilase (E)
(E) = enzim endoseluler
KSB I : Isolasi Enzim 6
Kapang
Aspergillus orizae Amilase
Protease (asam)
niger Glukanase
Selulase
Glukosa oksidase
Katalase
Lipase
Rhizopus Amiloglukosidase
Lipase
Mucor pucillus Protease (asam)
miehei Esterase
Ragi
Sacharomyces cerevisae Invertase (E)
Kluyveromyces lactis Laktase (E)
fragilis Laktase (E)
KSB I : Isolasi Enzim 7
 B. TAHAPAN ISOLASI
Lokasi Enzim :
 Ekstraseluler (eksoenzim)
 Endoseluler (terikat pada partikel subseluler atau
membran)
Hal yang perlu diperhatikan
 Sifat khas materi utama :
bentuk (cair, padat);
tipe umum (animal, vegetal, mikroba),
struktur biologi (seluler, tisuler)
 Lokasi produk yang dicari : Mitokondria;
Sitoplasma; membran; dll.
KSB I : Isolasi Enzim 8
Sifat struktural dan fisiko-kimia :
Mr; struktur molekul; stabilitas;
pH optimum, pI,
aktivator; inhibitor;
konstanta kinetika
Penglepasan protein dalam bentuk cair tanpa
menghilangkan aktivitas
Tanpa merusak struktur :
Temperatur rendah (4oC)
Penggunaan bufer
Penggunaan reagen pelindung (EDTA, 2-
merkaptoetanol, substrat; dll)
Perlakuan secara cepat dan hati-hati.
KSB I : Isolasi Enzim 9
B.1. TAHAPAN ISOLASI
Materi utama sangat heterogen, maka untuk
mendapatkan enzim murni perlu tahapan isolasi
yaitu, Gambar 1 :
Ekstraksi : pelepasan enzim dari sel atau
bagian sel dan didapatkan ekstraks dalam
bentuk cair yang mempunyai sifat fisiko kimia
sama
Fraksionasi : memisahkan ekstraks
berdasarkan kelarutannya guna mendapatkan
kelompok molekul yang sama (fraksi)
Purifikasi : pemisahan fraksi lebih lanjut dengan
metode fisiko-kimia atau biospesifik untuk
mendapatkan molekul enzim lebih murni
KSB I : Isolasi Enzim 10
 Materi Primer

Animal Vegetal Mikroba

Tahap 1 : Ekstraksi

Ekstraks total
Tahap 2 : Fraksionasi

Ekstraks kasar
Tahap 3 : Purifikasi

Enzim murni

Gambar 1. Skema umum isolasi dan purifikasi enzim

KSB I : Isolasi Enzim 11
 Ultrasentrifugasi Kromatografi
Dialisa Elektroforesis
Penukar ion
Gel filtrasi
Ultrasentrifugasi Gel Elektroforesis Mobilitas Elektroforesis
Sentrifugasi zonal
Mr Muatan

Densitas Titik Isoelektrik Elektro

ENZIM dekantasi

Sifat permukatan Kelarutan

Kromatografi Stabilitas Pengendapan

Adsorpsi Isoelektrik
Perlakuan Perlakuan
Asam atau Suhu
Kromatografi Basa
* Afinitas Pengendapan terfraksi
* Hidrofob Partisi dengan garam atau
* kovalen Cair-cair pelarut organik

Gambar 2. Berbagai teknik separasi dan purifikasi enzim berdasarkan sifatnya

KSB I : Isolasi Enzim 12
B.2. KONTROL KUALITAS
• Enzim industrial perlu adanya kontrol kualitas,
Gambar 3, berupa :
Kemurnian enzim dalam periode waktu tertentu:
aktivitas spesifik.
Kontrol kemurnian dengan metode fisiko-kimia :
homogenitas dan sifat karekteristiknya ( Mr,
Polimorfisme, …)
Uji stabilitas : resiko denaturasi, semakin murni
enzim semakin mudah terdenaturasi. Perlu
dilakukan
 Eliminasi kontaminan
 Penyimpanan pada temperatur rendah (4oC)
 pH netral
KSB I : Isolasi Enzim 13
Pengukuran :
• Aktivitas katalitik Pengukuran
• protein * Tekanan osmose
• aktivitas spesifik * Elektroforesis • Pengendapan dg Ultrasentrifugasi
• kontaminan (enzim • Ultrasentrifugasi • Difusi dan koefisien difusi
& lainnya) • Gel filtrasi • Gel eksklusi kromatografi

Aktivitas biologi Homogenitas

& spesifik SDS PAGE elektroforesa

Mr
ENZIM Polimorfisme, Mr
Metode SANGER
MURNI
Kompoisis & sequence a.a.

Label penggunaan
Kemasan Penggunaan
stabilitas

Gambar 3. Prosedur umum kontrol kualitas enzim murni

KSB I : Isolasi Enzim 14
 C. EKSTRAKSI
Ekstraksi : pelepasan enzim dari sel atau bagian
sel menggunakan proses mekanik, dan non
mekanik (kimia, enzimatis, dll)
Jaringan vegetal dan animal : penghalusan dan
homogenisasi, secara mekanik.
Sel mikroorganisme secara umum adalah
pemecahan dinding sel secara mekanik dan non
mekanik
 kimia : alkali/asam, detergen, osmose; EDTA
memecah bakteri gram -,
 Enzimatis : lisozim (memutus 1-4 glukosida
peptidoglikan
Beberapa metode ekstraksi dirangkum pada Tabel
3.
KSB I : Isolasi Enzim 15
 Tabel 2. Beberapa metode ekstraksi
Metode Perlakuan
Pemecahan jaringan dan Mekanik : potong, pecah dan homogenisasi
sel Osilasi frekuensi tinggi : ultrasonikasi, turmix
Grinding
Pemecahan dan homogenisasi dengan tekanan tinggi
Ekstraksi dengan pelarut Temperatur : shock dingin
air pH : shock alkali atau asam
Konsentrasi garam : shock osmose
Effek spesifik substrat
Metode ekstraksi spesial Pelarut organic : butanol, aseton dan pelarut lipid
Pembekuan dan pencairan
Penggunaan detergen Na-deoksi kolat, Tween 20, Teepol XL, Triton X-100
Ekstraksi dengan enzim Otolisis : proteolisa dan lipolisa
Penggunaan enzim pemurni (tripsin, lipase)`
KSB I : Isolasi Enzim 16
Pemecahan dinding Mikroorganisme
Proses mekanik :
 Ultrasonikasi : sel pecah
 Pembekuan-pencairan
 Penggerusan/agitasi dengan partikel gelas
 Desintegrasi pada P >
Proses Non-Mekanik
 Desikasi dengan spray drying
 Lise Kimia & Fisika
 Perlakuan alkali
 Detergen : Na-lauril sulfat, Trixton X-100
 Shock dingin : jumlah keci;
 Shock Osmotik : perubahan konsentrasi garam
 Lise Enzimatik
 Lisozim : hidrolisis b-1,4-glukosida
 Autolisi dengan proteolise, lipolise
KSB I : Isolasi Enzim 17
 D. FRAKSIONASI
D.1. FRAKSIONASI PENGENDAPAN
D.1.1. PENGENDAPAN DENGAN GARAM

Garam yang paling banyak digunakan (NH4)2SO4

Prinsip :
 Protein larut dalam larutan garan pada pH sekitar
pI
 Kelarutan > dengan > kuat ion larutan (salting in)
 Batas kuat ion tertentu, kelarutan < (salting out),
berkaitan dengan dehidrasi protein

KSB I : Isolasi Enzim 18

Daerah pengendapan bergantung pada :
 Garam yang digunakan
 Jenis proteinnya
Kelebihan (NH4)2SO4
 Harganya murah
 Kemampuan pengendapan tinggi
 Kelarutannya besar, endotermik
 Efek denaturasi terhadap protein rendah
Kristalisasi : enzim yang terendapkan oleh
konsentrasi garam tertentu dapat dilarutkan
kembali dengan melarutkannya pada pelarut
dengan kadar lebih rendah
KSB I : Isolasi Enzim 19
 EKSTRAKS
Estrifugasi : 20 mnt, 10.000 g

Presipitat (P1) Supernatan (S1)

Fraksionasi dg (NH4)2SO4
0-45% (0-1,75)
Fosforilase (P2) (S2)
40-45% (1,75-2,34 M)

(S3) (P3) : LDH, PK, PGI, GDH

60-75% (2,34-2,92 M) PGM, PGluM, Aldolase

(S4) (P4) : CK, PGK,

75-90% (2,92-3,5 M) Enolase, Myokinase

(S5) (P5) : TIM, GAP-DH

Gambar 4. Fraksionasi enzim dari ekstraks otot kelinci.

LDH (Laktat dehidrogenase), PK (Piruvat Kinase), PGluM (Fosfogluko mutase), PGI
(Fosfoglukosa Isomerase), GDH ( Gliserol-3-fosfat dehidrogenase), PGM (Fosfogliserat
mutase), CK (Kreatin kinase), PGK (3-Fosfogliserat kinase), TIM (Trioesefosfat
KSB I : Isolasi
Isomerase), GAP-DH (Gliseraldehid-3-fosfat Enzim
dehidrogenase) 20
D.1.2. PENGENDAPAN PADA ISOELEKTRIK

pI Kelarutan minimum, mengendap

Pengaturan pH larutan

D.1.3. EFEK TEMPERATUR

Protein Globular T >, Kelarutan >, s/d 40-50oC

Pengaturan T Seleksi Protein

Protein terdenaturasi

Tidak digunakan
secara industri
KSB I : Isolasi Enzim 21
 D.1.2. PENGENDAPAN DENGAN PELARUT
ORGANIK
ENZIM Protein Protein
Pelarut Air Saling bergabung mengendap
< : konstanta dielektrikum
& kestabilan
Penambahan pelarut pada
Tambah pelarut Organik
T < shg tidak mendenaturasi

Alkohol
 Isopropanol (paling banyak digunakan) untk enzi
ekstraseluler seperti Amiloglukosidase
 Metanol
Aseton & Etil eter : protein sedikit larut, perlu volume >
KSB I : Isolasi Enzim 22
 E. PURIFIKASI DENGAN
KROMATOGRAFI
Setelah didapat enzim dalam bentuk larutan atau
endapan maka perlu dilakukan pemurnian lebih
lanjut, antara lain dengan teknik kromatografi

E.1. KROMATOGRAFI GEL FILTRASI

(EKSKLUSI)
PRINSIP : pemisahan berdasarkan Mr dan
besarnya molekul

KSB I : Isolasi Enzim 23

GEL YANG DIGUNAKAN
Polimer dextran dengan epilorhidrin gliserol
dalam basa (Sephadex G Pharmacia)
Kopolimerisasi vinil akrilamid dengan N,N’-
metilen-bis akrilamida (Biogel P)
Campuran poliakrilamida dan agarosa (Ultroge
IBF)
Agarosa (Biogel A)
Polistiren untuk pelarut non-aquous (Bio Bead S)
Butiran kaca dengan porositas tertentu (CPG :
Controlled Pore Glass)

KSB I : Isolasi Enzim 24

 Ukuran molekul > pori gel
molekul
• tidak dapat masuk
• eksklusi
• keluar dahulu

Ukuran molekul < pori gel

• masuk dalam gel
• tertahan
gel • keluar berikutnya
B Mr A > B > C

In A C
ten
si
tas

Gambar 5. RT
Prinsip GEL EKSKLUSI KSB I : Isolasi Enzim 25
E.2. KROMATOGRAFI PENUKAR ION
Suport yang digunakan harus:
 Makroporous
 Hidrofil
 Tahan terhadap mekanik
 Kapasitas dan resolusi tinggi
 Stabil terhadap perubahan kimia & termal
 reprodusibel
Materi penukar ion : Resin , Selulosa
 Contoh penukar kation : Amberlit & DEAE Selulosa
(Dietil amino etil)
 Contoh penukar anion : CM-selulosa (karboksimetil)
KSB I : Isolasi Enzim 26
Pengikatan protein bergantung
muatan
pH
Kuat ion
temperatur
CM-selulosa (p-kation) < pI < DEAE selulosa (p-
anion)
Kurva perubahan muatan protein sebagai fungsi
pH ditampilkan pada Gambar 6.

KSB I : Isolasi Enzim 27

 +
M
u
pI Daerah stabil
a
t Menggunakan
a Penukar Anion
n

P
pH
4 6 8 10
r
o
t Menggunakan
e Penukar Kation
i
n
-
Gambar 6. Muatan protein sebagai fungsi pH. Berdasarkan muatan
yang terbentuk dilakukan pemisahan dengan penukar ion yang sesuai
KSB I : Isolasi Enzim 28
E.3. KROMATOGRAFI AFINITAS
Prinsip : interaksi antara protein atau
enzim secara spesifik dan reversibel
dengan ligan yang terikat secara kovalen
pada suatu suport
Faktor penting :
Pemilihan matriks
Pemilihan ligan
Metode fiksasi ligan pada suport
Kondisi elusi

KSB I : Isolasi Enzim 29

Pemilihan Matriks :
 Tidak larut dalam fasa mobil
 Resisten secara kimia & biologi
 Rigid, hidrofil dan cukup permiabel
 Tidak mempunyai interaksi non-spesifik
 Mempunyai beberapa cara aktivasi dengan kondisi
lunak dan kapasitas tinggi
Suport
 Turunan selulosa seperti agarosa
 Gel dekstran
 Kaca porous
 Silika gel

KSB I : Isolasi Enzim 30

Metoda aktivasi seperti pada imobilisasi enzim :
 bergantung ligan dan
 sifat gugus fungsi yang diikat
Pemilihan Ligan :
 Spesifik terhadap molekul yang dimurnikan
 Afinitas menengah
 Dyes ligand = Dyes Ligand Chromatography atau
Pseudo Affinity Chromatography
Untuk enzim :
 Inhibitor
 Kofaktor (kurang spesifik) atau analog substrat
Metode Elusi : menggunakan kompetitor,
memecah kompleks ligan dengan molekul protein

KSB I : Isolasi Enzim 31

 L E L E

Penambahan
Modifikasi pH I
Inhibitor
Dan Kuat ion

L E
L I E

Pengaturan
Dialisis
buffer

L I

Gambar 7. Mekanisme Purifikasi Enzim

L = Ligan E = Enzim Dengan Kromatografi Afinitas
I KSB I : Isolasi Enzim 32
= Inhibitor
 F. CONTOH ISOLASI ENZIM
Contoh isloasi enzim Lipoksigenase yang terdapat
pada kacang panjang (Vigna sesquipedalis)
Skema tahapan isolasi seperti Gambar 8., meliputi
ekstraksi, dialisis dan kromatografi penukar ion
DEAE Selulosa.
Tahapan purifikasi meningkatkan aktivitas spesifik,
Tabel 3.
Kromatogran separasi dengan DEAE Selulosa
pada Gambar 9a, aktivitas masing-masing puncak
ditampilkan pada Gambar 9b.
Puncak kromatogram yang besar mengandung
banyak protein tetapi belum tentu mengandung
enzim yang dicari (aktivitasnya).
KSB I : Isolasi Enzim 33
 Biji Kacang
Panjang
+ buffer fosfat pH 9,0
Blender & saring

Filtrat Residu
Sentrifugasi, 4oC, 6000 rpm, 30 menit

Residu Supernatan Uji Aktivitas &

(Enzim kasar, Eo) Kadar Protein
Fraksionasi, variasi (NH4)2SO4
Biarkan semalam
Sentrifugasi 4oC, 7500 rpm70 menit
Filtrat
Endapan
Uji Aktivitas &
E1 E2 E3
Kadar Protein
Dialisis
Uji Aktivitas &
E4
Kadar Protein
Kromatografi Penukar
Ion DEAE Selusosa
Uji Aktivitas &
E5, E6, E7
Kadar Protein

Gambar 8. Skema isolasi Lipoksigenase dari kacang panjang

KSB I : Isolasi Enzim 34

 Tabel 2. Aktivitas spesifik lipoksigenase dari setiap tahap pemurnian

Kadar Protein Aktivitas Pemur

Volume Protein Total Spesifik
Tahap Isolasi nian
(ml) (mg/ml) (mg) (U/mg) ( kali)
Ekstraksi (Eo) 445 0,825 367, 13 0,226 1,00

Salting out 0-30 % (NH4)2SO4 483 0,519 250, 68 0,172

Salting out 30-60 % (NH4)2SO4 203 0,597 121,19 0,182

Salting out 60-90 % (NH4)2SO4 (E2) 135 0,314 42,35 0,418 1,85

Dialisis (E4) 63 0,377 23,76 0,523 2,31

DEAE Selulosa (puncak 1), (E5) 2,5 0,085 0,213 22,433 99,26

DEAE Selulosa (puncak 2) (E6) 2,5 0,017 0,043 350,588 1550,6

DEAE Selulosa (puncak 3), (E7) 2,5 0,130 0,325 40,308 178,35

KSB I : Isolasi Enzim 35

 0,30 0,5
0,40 0,20 0,30
0,25 0,02 Puncak 2

Serapan optik pada 234 nm

Serapan optik pada 234 nm

0,30 0,50 0,4

0,20 0,10 0,10 0,40

0,3 0,02 0,50
0,15
0,20 Puncak 3
0,10 0,2
Puncak 1
0,05
0,1

0,00
0 10 20 30 40 50 0
(0,05) 0 10 20 30 40 50

(0,10) -0,1

Fraksi (@ 2,5 m l) Fraksi (@ 2,5 ml)

(a) (b)

Gambar 1. (a) Kromatogram DEAE selulosa protein isolat

lipoksigenase dengan eluen NaCl, (b) Aktivitas lipoksigenase
yang terdapat pada tiap fraksi protein
KSB I : Isolasi Enzim 36