Ubur-Ubur Berpendar

(Aequorea victoria )

TEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN
 PENGERTIAN

Teknologi DNA rekombinan atau sering juga disebut rekayasa

genetika merupakan teknologi yang memanfaatkan proses
replikasi, transkripsi, dan translasi untuk memanipulasi,
mengisolasi dan mengekspresikan suatu gen dalam organisme
yang berbeda.

DASAR TDR

Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang

terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum
(1946) menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme
seksual (pewarisan sifat).
Percobaan Lederberg dan
Tatum (1946)
 BIOTECHNOLOGY METHODS
• Why do we clone proteins
and receptors
• Provide structural
information, can be used to
synthesize small peptides
• Production of hormones by
recombinant DNA
techniques
BIOTECHNOLOGY METHODOLOGY
PERANGKAT TDR
Perangkat yang digunakan
dalam teknologi DNA
rekombinan antara lain:
1.Enzim restriksi
(endonuklease restriksi)
2.Enzim DNA ligase
3.Vektor (plasmid untuk
pembawa)
4.Transposon
5.Pustaka genom
6.Enzim transkripsi balik
7.Pelacak DNA/RNA
Transposon
alat untuk mutagenesis dan
menyisipkan penanda
Pustaka genom
 menyimpan gen atau fragmen
DNA yang telah diklonkan.
Fragmen DNA/gen disimpan untuk
sementara waktu di dalam pustaka
plasmid atau pustaka fage.
Enzim traskripsi balik (reverse)
 membuat DNA berdasarkan
RNA.
 ISOLASI DNA
Isolasi DNA Kromosom (gen of
interest)
1.Kultivasi sel dalam media yang
sesuai
2.Pemecahan dinding sel  secara
fisik (sonikasi) & kimiawi (lisozim,
EDTA, deterjen triton X-100, SDS)
3.Ekstraksi DNA genom 
sentrifugasi
4.Purifikasi DNA fenol atau
kloroform sentrifugasi  Rnase 
presipitasi etanol (20ºC) 
sentrifugasi
Isolasi DNA Plasmid
Teknik sentrifugasi gradient
densitas etidium bromida sesium
klorida yang berkecepatan tinggi
DNA plasmid membentuk pita
terpisah dengan pita genom
Pita DNA dalam tabung terlihat
melalui pendaran etidium bromida
yang disinari UV
DNA plasmid diambil dengan
menusukkan jarum suntik pada
dinding tabung dimana pita DNA
plasmid terlihat dan menyedotnya.
Etidium bromida yang terikat pada
DNA plasmid diekstraksi dengan n-
butanol, dan CsCl dihilangkan
dengan cara dialisis.
Enzim Restriksi
Enzim Ligase Plasmid

Pustaka Genom
MENYAMBUNG DNA

Menyambung merupakan proses penempelan DNA interest dengan DNA vektor

sehingga yang dibutuhkan untuk membuat plasmid rekombinan adalah DNA
interest dan DNA plasmid (vector)

 Vektor yang dapat digunakan

pada sel inang prokariot,
khususnya E.coli, adalah plasmid,
bakteriofag, kosmid dan fosmid.
 Vektor YACs dan YEps
DNA interest bisa diperoleh dengan
digunakan pada khamir.
dua cara, yaitu:
 Plasmid Ti, baculovirus, SV40
1.Isolasi langsung kemudian di PCR
dan retrovirus merupakan vektor
2.Fragmen DNA hasil pemotongan
yang digunakan pada sel eukariot
dengan enzim restriksi kemudian di
tingkat tinggi.
PCR
 DNA plasmid (rekombinan) yang
dapat bereplikasi secara otonom,
karena memiliki titik awal
replikasi (origin of replication =
ORI) sendiri.
 TAHAP TDR

Cakupan teknik dalam teknologi DNA rekombinan antara lain

sebagai berikut:
Teknik untuk mengisolasi dan mengidentifikasi DNA
Teknik untuk memotong DNA plasmid dan gene of interest
Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA
Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga
DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.
Teknik kloning sel
Teknik seleksi rekombinan
TAHAP TDR

DNA yang
akan di’klon’
+
Plasmid DNA
(vektor) rekombinan

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon

Sel Inang
Struktur Plasmid
MENYAMBUNG
DNA

 Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi

harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel (dapat
diligasi).
 Ada tiga cara meligasi fragmen DNA secara in vitro:
1. Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri (hanya untuk ujung
lengket).
2. Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 (enzim T4 ligase) (baik pada ujung lengket dan
tumpul).
3. Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai
tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan
diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
 Dilakukan pada suhu 4-15°C dengan waktu inkubasi semalam.
MENYAMBUNG
DNA

Pada reaksi ligasi fragmen DNA genomik dan DNA vektor, dapat terjadi
peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan
dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali  menurunkan
efisiensi ligasi  pemberian perlakuan:
penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100Ng/ml),
perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat
dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong,
pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik
3’
 MENYAMBUNG
DNA
 kedua ujung DNA berpasangan, kemudian enzim ligase dapat membentuk
ikatan fosfodiester antara kedua molekul DNA.
 Reaksi enzimatik ini memerlukan energi dari ATP.
MENYAMBUNG
DNA
MENYAMBUNG
DNA

 Rekombinasi dua fragmen DNA berujung lancip dapat menggunakan fragmen

EcoRI. Rekombinasi dua fragmen DNA berujung tumpul dapat menggunakan
fragmen SmaI.
MENYAMBUNG
DNA

 Ikatan Fosfodiester dari penggunaan enzim T4 DNA Ligase

TRANSFER DNA

 Beberapa spesies bakteri yang sering digunakan dalam industri bioteknologi

antara lain adalah Bacillus subtilis, Eschericia coli, Saccharomyces
cerevisiae (Radji, M., 2011).
 Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel tersebut harus diberi
perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang mampu menerima
DNA dari luar.
 Kemampuan paling tinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi pada
sel yang berada dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan sel
sedang cepat.
 Proses transfer DNA rekombinan ke dalam sel hospes tergantung pada jenis
vektor yang digunakan. Beberapa cara transfer:
1. Transformasi
2. Transfeksi
3. Mikroinjeksi
4. Mikroprojektil
TRANSFER DNA

Transformasi
vektor: plasmid DNA. Transfeksi
DNA rekombinan dapat vektor: virus bakteriofag.
DNA rekombinan yang akan
ditransformasikan ke dalam sel
inang dengan cara: ditransfer dikemas terlebih dahulu
1.Induksi Kimia  heat shock dalam kapsid bakteriofag, kemudian
dengan CaCl2 suhu 42°C 90 detik diinfeksikan kedalam sel penerima.
Proses transfer DNA melalui
2.Elektroporasi  meningkatkan
transfeksi ini menyerupai proses
permeabilitas dinding sel dengan
infeksi oleh virus yang terjadi
menempatkan sel pada medan listrik
secara alamiah.
yang kuat.
Replikasi dan propagasi akan
3.Konjugasi  terjadi secara
meningkatkan jumlah DNA
alamiah diantara sel bakteri melalui
rekombinan
pili bakteri. Ex: plasmid Ti
TRANSFER DNA

Mikroinjeksi
mentransfer DNA secara Mikroprojektil
untuk mentransfer DNA kedalam
langsung kedalam sel menggunakan
sel atau jaringan tanaman.
jarum suntik mikro
Partikel DNA ditembakkan
mentransfer DNA kedalam sel
langsung dengan suatu alat
hewan atau sel tanaman, karena sel
penembak khusus langsung kedalam
tersebut berukuran relative lebih
sel tanaman.
besar daripada sel bakteri.
berbagai jenis alat penembak gen,
DNA rekombinan yang akan
salah satu jenisnya antara lain
ditransfer diinjeksikan lengsung
adalah pistol penembak gen.
kedalam nucleus sel penerima.
 KULTUR SEL

 Sel diisolasi  dimasukkan kedalam tabung kultur yang mengandung

medium perbenihan cair yang sesuai  sel akan tumbuh  DIHASILKAN DNA
Rekombinan dalam jumlah banyak.
SELEKSI KLON REKOMBINAN

 klon-klon perlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yang

membawa plasmid rekombinan
 Terdapat beberapa cara seleksi klon rekombinan, diantaranya:
1. Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik.
Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai dua gen resistan
terhadap antibiotik. Misalnya gen Ampr (gen resistan ampisilin dan gen
Tetr (gen resistan terhadap tetraciclin). Penyisipan DNA asing dilakukan di
dalam gen Tetr, sehingga bila mengandung sisipan DNA asing gen Tetr
tidak akan aktif. Bakteri transforman pertama ditumbuhkan pada media
yang mengandung Ampicilin, sehingga koloni yang tumbuh adalah koloni
yang membawa plasmid. Kemudian koloni-koloni ini dipindahkan ke
media yang mengandung tetrasiklin, sehingga koloni yang mengandung
DNA sisipan (dimana gen Tetr-nya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh.
Maka kita akan tahu koloni mana yang mengandung DNA sisipan.
SELEKSI KLON REKOMBINAN

2. Seleksi dengan melibatkan gen LacZ.

Plasmid yang digunakan mempunyai gen Ampr dan gen LacZ. Gen LacZ
mengkode enzim β-galaktosidase yang mengkatalisis pemecahan laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa.
Penyisipan DNA dilakukan di dalam gen LacZ ini, sehingga bila mengandung
DNA sisipan maka gen LacZ akan inaktif.
Seleksi dilakukan dengan menambahkan substrat analog laktosa yaitu X-gal yang
akan dipecah oleh enzim β-galakotosidase menjadi senyawa yang berwarna
biru (5-bromo-4 kloro-3-indigo). IPTG (isopropil tiogalaktopiranosida)
digunakan sebagai inducer.
Bakteri transforman ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, X-
gal dan IPTG. koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid.
Akan tetapi terdapat dua jenis koloni, yaitu yang berwarna putih dan biru. Koloni
yang berwarna biru menandakan terdapat senyawa 5-bromo-4 kloro-3-indigo
(hasil penguraian X-gal oleh β-galaktosidase), artinya gen LacZnya aktif
sehingga tidak ada DNA sisipan. Sedangkan koloni yang berwarna putih,
adalah koloni yang tidak menghasilkan senyawa berwarna, gen LacZ inaktif
dan mengandung DNA sisipan.
 APLIKASI TDR

Beberapa aplikasi dari teknologi DNA rekombinan antara lain pada bidang
penelitian dasar berupa penentuan urutan dan letak DNA, proyek “human
genom”, keperluan forensik, bidang medik berupa penentuan penyakit tertentu
dan pemenuhan kebutuhan farmasi seperti vaksin, bidang lingkungan berupa
penanganan limbah, bidang peternakan berupa hewan transgenik, dan bidang
pertanian berupa tanaman transgenik.
Human Genome
Produk Farmasi
Vaksin
Insulin
DNA Fingerprinting
Bidang Lingkungan
Bidang Pertanian
Bidang Peternakan