UJI TOKSISITAS

Apt. Annisa Primadiamanti, M.Sc

 Profile

 TTL : Surabaya, 21 Juni 1986

 Status : Menikah, 2 anak
 S1 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2004-2008
 Pendidikan Profesi Apoteker Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
2008-2009
 S2 School of Pharmaceutical Sciences Universiti Sains Malaysia
2012-2014
 Email : annisa@malahayati.ac.id
 Phone/WA : 082131760892
Pendahuluan

Sebelum percobaan toksisitas

dilakukan sebaiknya telah ada data
mengenai identifikasi, sifat obat dan
rencana penggunaannya
Pengujian toksisitas biasanya dibagi
menjadi tiga kelompok yaitu :
1. Uji toksisitas akut
 Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang
diuji sebanyak satu kali, atau beberapa kali dalam jangka
waktu 24 jam.
2. Uji toksisitas jangka pendek (sub kronik)
•  Uji ini dilakukan dengan memberikan bahan tersebut
berulang- ulang, biasanya setiap hari, atau lima kali
seminggu, selama jangka waktu kurang lebih 10% dari masa
hidup hewan; yaitu 3 bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun
untuk anjing. Tetapi beberapa peneliti menggunakan jangka
waktu yang lebih pendek, misalnya pemberian zat kimia
selama 14 dan 28 hari.
• 3. Uji toksisitas jangka panjang (kronik)
 Percobaan jenis ini mencakup pemberian obat secara
berulang selama 3 – 6 bulan atau seumur hewan, misalnya
18 bulan untuk mencit, 24 bulan untuk tikus, dan 7 – 10
tahun untuk anjing dan monyet. Memperpanjang percobaan
kronik untuk lebih dari 6 bulan tidak akan bermanfaat,
kecuali untuk percobaan karsinogenik.
Uji Toksisitas Akut
• Sebagian besar penelitian semacam ini dirancang untuk
menentukan LD50 obat. LD50 obat didefinisikan sebagai
dosis tunggal suatu zat yang secara statistik diharapkan
akan membunuh 50% hewan coba. Percobaan ini juga
dapat menunjukkan organ sasaran yang mungkin
dirusak dan efek toksis spesifiknya, serta memberikan
petunjuk tentang dosis yang sebaiknya digunakan dalam
pengujian yang lebih lama.
• Bila pemberian suatu zat terjadi melalui inhalasi maka
yang harus ditentukan adalah kadar letal median (LC50)
untuk masa pemberian tertentu atau waktu letal median
(LT50) untuk kadar tertentu di udara
Uji Toksisitas Jangka Pendek

• Tubuh manusia sering terkena bahan

kimia pada level yang jauh lebih kecil dari
dosis yang mematikan dengan segera,
hanya mereka terkena lebih lama. Untuk
menyelidiki kenyataan akibat keracunan
dalam situasi yang lebih realistis,
dikerjakan studi toksisitas jangka pendek
dan jangka panjang.
Uji Toksisitas Subkronis

• Hewan Uji
Sekurang-kurangnya digunakan dua jenis hewan, hewan pengerat
dan bukan hewan pengerat. Biasanya dapat digunakan tikus dan
anjing, dari dua jenis kelamin, sehat, dewasa, umur 5 sampai 6
minggu untuk tikus, dan 4-6 bulan untuk anjing.

• Jumlah Hewan Uji

Masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor hewan pengerat atau
empat ekor anjing untuk setiap jenis kelamin. Bila pada percobaan
akan dilakukan pengorbanan/pembedahan, maka jumlah hewan uji
harus sudah dipertimbangkan sebelumnya.
Lanjutan…
• Dosis Uji
Sekurang-kurangnya digunakan tiga kelompok dosis dan satu kelompok kontrol untuk
setiap jenis kelamin. Dosis dan jumlah kelompok dosis harus cukup, hingga dapat
diperoleh dosis toksik dan dosis tidak berefek. Dosis toksik harus menyebabkan gejala
toksik yang nyata pada beberapa hewan uji dan terjadinya kematian tidak boleh lebih
dari 10%, sedang dosis tidak berefek tidak boleh menyebabkan gejala toksik. Sebagai
dosis toksik biasanya digunakan 10-20% dari harga LD50, dengan
mempertimbangkan hasil yang diperoleh pada uji pendahuluan, tingkat dosis lain
ditetapkan dengan faktor perkalian tetap 2 sampai 10.
• Batas Uji
Bila pada dosis 1000 mg/kg bobot tubuh tidak dihasilkan efek toksik, dosis tidak perlu
dinaikkan lagi, meskipun dosis yang diharapkan untuk manusia belum dicapai.
• Cara Pemberian Zat Uji
Pada dasarnya zat uji harus diberikan sesuai dengan cara pemberian atau pemaparan
yang diharapkan pada manusia. Bila diberikan secara oral, dapat diberikan dengan
cara pencekokan menggunakan sonde atau secara ad libitum di dalam makanan atau
minuman hewan. Bila zat uji akan dicampur dengan makanan atau minuman hewan,
jumlah zat uji yang ditambahkan harus diperhitungkan berdasarkan jumlah makanan
atau minuman yang dikonsumsi setiap hari.
• Lama Pemberian Zat Uji
Lama pemberian zat uji selama 28 sampai 90 hari atau 10% dari seluruh umur
hewan, diberikan tujuh hari dalam satu minggu.
Uji Toksisitas Jangka Panjang

• Umumnya satu atau lebih jenis binatang yang

digunakan. Kecuali tidak ditunjukkan, tikuslah yang
digunakan, anjing dan primata merupakan pilihan
berikutnya.
• Karena ukurannya yang kecil, tikus tidak cocok
digunakan dalam studi toksisitas jangka panjang,
meskipun mereka sering digunakan dalam studi
karsinogenesitas. Jantan dan betina dalam jumlah yang
sama digunakan. Umumnya 40-100 tikus ditempatkan
dalam kelompok masing-masing dosis dan juga dalam
kelompok kontrol. Penggunaan anjing dan primata non
manusia jauh lebih sedikit.
Contoh Perhitungan LD50 Cara Weil.
Nilai LD50 ekstrak etanol 40% kulit buah mahoni
Diketahui :
r = 0, 3, 4, 5
f = 0,10000
D = 2, 364
d = 0,0752575

Maka :
Log m = log 94, 55 + 0,0752572 (0,10000 – 1)
= 2,055661533
m = antilog 2,055661533
= 113,6741022 mg = 0,11g
LD50 ekstrak etanol 40% kulit buah mahoni
adalah 0,11g/20 g bb.
Untuk lebih memahami metode Weil,
carilah :
1. Artikel/jurnal penelitian yang
menggunakan metode tersebut dalam
perhitungan LD50nya.
2. Carilah literature buku atau literature
internet mengenai perhitungan metode
Weil.
Brine Shrimp Lethality Test
(BST)
• Selain menggunakan hewan pengerat untuk uji
toksisitas, dapat juga digunakan larva udang (Artemia
salina leach) untuk mengetahui sifat toksik bahan alam.
Metode yang menggunakan larva udang untuk uji
toksisitas disebut Brine Shrimp Lethality Test (BST).
• Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu
metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam
penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari
bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai
bioassay-guided fractionation dari bahan alam, karena
mudah, cepat, murah dan cukup reproducible. Beberapa
senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan
dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya
korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker.
Eksperimen
Penetasan Telur Udang Artemia salina Leach.
• Penetasan telur dilakukan pada wadah bening seperti gelas kimia atau
stoples yang diberi bahan plastik, negatif film, atau kaca dengan
menggunakan media air laut (brine=saline). Wadah penetasan dibagi
menjadi dua bagian terang dan gelap oleh suatu sekat berlubang. Bagian
gelap digunakan untuk meletakkan telur yang akan ditetaskan. Sekat
berlubang menjadi jalan bagi larva yang telah lahir untuk bergerak secara
alamiah ke arah terang. Selama penetasan diberi penerangan dengan
cahaya lampu pijar/neon 40-60 watt agar suhu penetasan 25-300C tetap
terjaga.
• Sebagai media penetasan telur digunakan air laut buatan dengan kadar
garam (NaCl) 15 g/L. Kadar oksigen yang dibutuhkan selama
penetasan harus lebih dari 3 mg/l, sehingga media air laut harus diberi
udara, baik dengan acrator, kompressor, maupun blower. Dalam waktu
24-36 jamtelur-telur sudah menetas menjadi larva yang disebut nauplii.
biasanya
Nauplii aktif yang telah berumur 48 jam digunakan sebagai hewan uji
dalam penelitian.
Pengujian Toksisitas Ekstrak dengan BST

 Larutan stok (induk) sampel dibuat dengan

konsentrasi 50 mg dalam 5 ml metanol atau
dengan pelarut lain yang sesuai, lalu dibuat
serangkaian konsentrasi sebesar 1, 10, 100, 500, 1000 dan
1500 g/ml ke dalam vial-vial. Larutan uji dalam
vial tersebut diuapkan sampai kering dan
tidak mengandung pelarut organik. Untuk kontrol negatif
(blanko) diberi perlakuan sama seperti larutan uji tetapi
tanpa ekstrak (hanya diberi metanol dalam jumlah yang
sama dengan sampel). Setiap dosis dibuat lima replikasi.
 Ekstrak kering dalam vial dilarutkan dalam air laut
• secukupnya. Sepuluh ekor larva Artemia dipindahkan ke
dalam masing-masing vial yang telah berisi senyawa uji dan
ditambahkan air laut sampai volume 5 ml. Ke dalam setiap
vial dimasukkan satu tetes suspensi ragi (0,6 mg/ml) sebagai
makanannya. Pengamatan dilakukan selama 24 jam dan
tingkat toksisitas ditentukan dalam menghitung jumlah larva
yang mati. Hasil dibandingkan dengan kontrol negatif.
 % kematian = jumlah kematian – jumlah kematian kontrol x 100
%
 jumlah larva awal (10)
Lanjutan…
Tingkat toksisitas dihitung sebagai :
Kons.(g/ml) Jml larva yang mati % kematian Konversi probit

Y = a + bx
Dengan y = nilai probit
X = konsentrasi ekstrak
Cari nilai x = ….  dimana y = 5,00 (kematian 50%)
LC50 ditentukan dengan analisis probit pada taraf kepercayaan 95%.
Untuk lebih memahami metode BST,
carilah :
1. Artikel/jurnal penelitian yang
menggunakan metode tersebut dalam
perhitungan LD50nya.
2. Carilah literature buku atau literature
internet mengenai perhitungan metode
BST.