16

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-April 2012. Penelitian analisis komposisi kimia dan pembuatan bioetanol buah lindur dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, penelitian histologi buah lindur dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan, Intitut Pertanian Bogor dan pengujian kadar bioetanol di Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari bahan utama, yaitu dari buah lindur (B. gymnorrhiza) yang diperoleh dari Pulau Kaya, Kota Tual, Kabupaten Maluku Tenggara dan bahan untuk perhitungan proksimat misal akuades, HCl, NaOH, katalis selenium, H2SO4, H3BO3 dan pelarut heksana. Bahan untuk pembuatan bioetanol adalah gula pasir, HCl, NaOH, pupuk NPK (Natrium, Posfor, Kalium), pupuk ZA (zwavelzuur ammonia), isolat

Saccharomyces cerevisiae, PDA (Potato Dextrose Agar), PDB (Potato Dextrose Broth). Sedangkan bahanbahan yang digunakan untuk pewarnaan preparat adalah parafin, xylol, toluidine blue, etanol, larutan seri Johansen, FAA. Alat-alat yang digunakan antara lain mikroskop merk Olympus BH-2, kromatografi gas SupelcoTM 37 Component FAME Mix, beker glass 2 L, kompor listrik, alat pengaduk, timbangan digital, pH meter, gelas ukur 100 ml, saringan, spatula, pipet volumetrik, piknometer, selang (d=3 mm), toples kaca 300 ml, alumunium foil, jarum ose, blender, parutan kelapa, pisau, plastik, baskom,

inkubator, autoclave, thermometer, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas erlenmeyer, tabung Kjeldahl, tabung soxhlet, buret, mortar, tanur, kertas saring, homogenizer, botol vial, waterbath, dan syringe.

17

3.3 Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimen di Laboratorium sesuai dengan prosedur kerja. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi karakterisasi bahan baku (buah lindur), analisis histologi, uji proksimat, pembuatan starter (regenerasi kultur dan starter media cair), pembuatan media fermentasi, penambahan nutrient, pengaturan pH dan pasteurisasi. Penelitian utama meliputi pembuatan bioetanol, yaitu fermentasi alkohol, pelakuan inkubasi, dan pengujian (uji pH akhir dan uji kadar etanol). 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Penelitian ini diawali dengan pengambilan dan preparasi sampel buah lindur (B. gymnorrhiza). Buah lindur ditemukan di daerah mangrove dan banyak terkena sinar matahari. Setelah sampel buah lindur diperoleh kemudian dibawa dengan cool box hingga ke laboratorium kemudian dicuci dengan air bersih untuk menghilangkan benda asing yg menempel lalu dikeringkan di bawah sinar matahari. 3.3.2 Pembuatan preparat dengan metode parafin dan pengamatan Pengamatan jaringan tanaman diawali dengan pembuatan preparat tanaman lindur (B. gymnorrhiza) kemudian pengambilan gambar objek pada mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode parafin. Tahapannya terdiri atas fiksasi, pencucian, dehidrasi dan penjernihan, infiltrasi, pemurnian dalam blok, penyayatan, perekatan, dan pewarnaan. Bagian tanaman lindur yang diambil adalah daun, batang dan daun. Fiksasi dilakukan selama >24 jam (5 hari) dalam larutan FAA, setelah itu larutan fiksasi dibuang dan sampel dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 30 menit. Kemudian didehidrasi dan dijernihkan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri Johansen pada suhu ruang. Proses infiltrasi dimulai dari perendaman sampel dalam TBA dengan minyak parafin dengan perbandingan 1 : 1 dan 1/3 parafin beku dan disimpan pada suhu ruang selama 4 jam yang dilanjutkan pengovenan pada suhu 58 oC selama 18 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 5 jam sekali sebanyak 4 kali.

18

Proses penanaman dilakukan dengan cara sampel dari tahap infiltrasi dimasukkan ke dalam blok kotak yang berisi parafin cair dan disimpan pada suhu ruang hingga benar-benar membeku. Proses penyayatan dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar setebal 10 m. Blok parafin terlebih dahulu dipotong dan dirapihkan kemudian ditempelkan pada holder lalu disayat. Hasil sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi albumin-gliserida dan ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot plate dengan suhu 45 oC selama 3-5 jam. Pewarnaan dilakukan dengan toluidin blue. Proses selanjutnya adalah penutupan dengan pemberian entellen atau canada balsam pada gelas objek dan ditutupi dengan gelas penutup. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan mikroskop cahaya. Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin, pewarnaan dan pengamatan disajikan pada Gambar 5.
Tumbuhan Lindur (daun, batang dan buah)

Pemotongan dengan panjang 2 cm dan tebal 0,1 mm

Fiksasi FAA

Pencucian dengan etanol

Infiltrasi dengan parafin

Penanaman dalam parafin

Penyayatan blok parafin

Perekatan dengan gelas objek

Pewarnaan

Pengamatan dengan mikroskop

19

Gambar 5 Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin.

3.3.3 Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui kandungan gizi secara kasar (crude) yang meliputi kadar air dengan menggunakan metode oven (AOAC 2005), kadar abu dengan menggunakan tanur (AOAC 2005), protein dengan menggunakan metode kjeldahl (AOAC 2005) dan lemak dengan menggunakan metode sokhlet (AOAC 2005). a. Analisis Kadar air (AOAC 2005) Kadar air dalam suatu bahan dapat diukur dengan berbagai cara. Metode pengukuran kadar air yang umum digunakan di laboratorium adalah dengan cara pengovenan atau destilasi. Tahap pertama yang dilakukan adalah mengeringkan cawan porselen pada suhu 102-105
o

C selama 30 menit. Cawan tersebut

diletakkan dalam desikator kurang lebih 30 menit hingga dingin kemudian ditimbang. Sampel buah lindur ditimbang sebanyak 1-2 gram setelah terlebih dahulu dipotong kecil-kecil, lalu dihomogenkan. Sampel yang telah

dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Cawan porselen beserta sampel ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Setelah 6 jam cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator hingga dingin kemudian ditimbang bobotnya. Rumus

Keterangan: A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum dioven C = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) setelah dioven b. Analisis Kadar Abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan dengan mengabukan sampel di dalam tanur. Tahap pertama cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit

20

dengan suhu 105 oC, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel buah lindur sebanyak 1-2 gram yang telah dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan porselen beserta sampel buah lindur didalamnya dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu 105 oC sampai tidak berasap. Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 oC selama 2-3 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan abu porelin didinginkan dalam desikator selam 30 menit, kemudian ditimbang bobotnya. Perhitungan kadar abu:

Keterangan: A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum ditanur C = Berat cawan porselen dengansampel (gram) setelah ditanur c. Analisis Kadar Protein (AOAC 2005) Tahap tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. Pertamatama, sampel dimasukkan sebanyak 0,1 gram ke dalam tabung kjelhdal. Selanjutnya ditambahkan selenium dan 3 ml H2SO4 ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 0C. Proses dekstruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening (Tahap destruksi). Selanjutnya isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam Erlenmeyer 125 ml berisi larutan H3BO3 indikator yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H3BO3 indikator dalam erlenmeyer (Tahap destilasi). Terakhir dilakukan titrasi dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan Erlenmeyer berubah menjadi pink. Kadar protein ditentukan dengan rumus:

21

Keterangan: fp = Faktor pengenceran = 10 fk = Faktor konversi = 6,25 d. Analisis Kadar Lemak (AOAC 2005) Lemak adalah senyawa yag larut dalam pelarut non polar. Sifat kelarutan lemak sangat tergantung pada strukturnya. Metode yang sering digunakan di Laboratorium adalah metode ekstraksi soxhlet, yakni secara langsung

mengekstraksi lemak dari bahan degan pelarut organik non polar, misal heksana, petroleum eter, dan dietil eter. Mulamula sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang reaktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 oC dengan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung diruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Perhitungan kadar lemak yaitu : % Kadar lemak = Keterangan: W1 = berat sampel (g) W2 = berat labu lemak tanpa lemak (g) W3 = berat labu lemak dengan lemak (g)

e. Analisis Karbohidrat (AOAC 2005) Pengukuran kadar karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dari penjumlahan kadar air, kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangan. Hal ini karena karbohidrat sangat berpengaruh terhadap zat gizi lainnya.

Kadar karbohidrat dapat dihitung dengan mengunakan rumus:

22

[ [

3.3.4 Pembuatan starter (Fardiaz 1992) Pembuatan starter untuk fermentasi diantaranya melalui proses regenerasi kultur dan starter pada media cair. Metode regenerasi kultur yang digunakan untuk menumbuhkan khamir atau S. cerevei adalah pada PDA (Potato Dextrose Agar) dengan metode tebar. Isolat S. cerevei dimasukkan ke dalam agar miring. PDA (Potato Dextrose Agar) sebanyak 10 ml dengan cara ditebar dipermukaan media PDA (Potato Dextrose Agar) sebanyak 3-5 jarum ose dan dibiakkan dalam inkubator selama 48 jam dengan kondisi aerobik pada suhu 25-30 oC. Setelah itu, biakan pada PDA (Potato Dextrose Agar) diinokulasi sebayak 5 jarum ose ke dalam PDB (Potato Dextrose Broth) 100 ml, kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan kondisi aerobik pada suhu 25-30 oC. Hasil biakan ini akan dipakai pada fermentasi utama. Diagram alir pembuatan starter disajikan pada Gambar 6. 3.3.5 Pembuatan media fermentasi (Junk dan Pancoast 1980) Pembuatan media fermentasi yaitu dengan preparasi buah lindur, penambahan nutrient, pengaturan pH dan pasteurisasi. Tepung buah lindur (B. gymnorrhiza) sebanyak 100 g dibuat menjadi larutan suspensi, yakni tepung buah lindur dicampur dengan HCl 5% (v/v) dengan perbandingan 1:20 (b/v), kemudian diaduk hingga rata sambil dipanaskan pada suhu 100 oC selama 1 jam. Kemudian hidrolisis dilanjutkan di autoclave pada suhu 121 oC, tekanan 1 kg/m2 dengan waktu 1 jam. Hasil hidrolisis diendapkan 1 jam, lalu disaring menggunakan nilon mesh 150, dan diambil filtratnya sebagai media untuk difermentasi. Selanjutnya, cairan hasil hidrolisis ditambah dengan nutrient berupa 0,5% NPK (b/b), 1% ZA (b/b) dan 2% gula pasir (b/b), diaduk hingga rata. Kemudian pH larutan diatur 4-5, diambil nilai tengahnya 4,6 dengan cara ditambah NaOH sedikit demi sedikit. Langkah selanjutnya adalah pasteurisasi pada suhu 80 oC selama 5 menit, lalu didinginkan hingga 30 menit. Diagram alir pembuatan media fermentasi diperlihatkan pada Gambar 7. 3.3.6 Pembuatan bioetanol

23

Pembuatan bioetanol ini terdiri dari fermentasi alkohol dan perlakuan inkubasi. Fermentasi utama dilakukan pada toples kaca 200 ml. Substrat berupa cairan glukosa hasil hidrolisis dimasukkan ke dalam 3 toples kaca 250 ml masingmasing 200 ml. Starter ditambahkan sebanyak 10 %. Fermentasi dilakukan pada kondisi anaerobik. Pipa kecil dipasang pada kepala toples kaca yang sebelumnya ditutup, ujung pipa tersebut dibenamkan ke dalam air untuk menangkap CO2 dan menghambat adanya sirkulasi udara bebas. Perlakuan yang diberikan yaitu saat inkubasi atau waktu fermentasi (X) adalah 3, 5, 7 hari. Terbentuknya gelembung-gelembung udara menunjukkan proses fermentasi pembentukan alkohol sedang berjalan. Fermentasi berlangsung pada suhu kamar (25-30 oC). Setelah masing-masing toples kaca dan isinya mendapat perlakuan inkubasi, kemudian dilakukan pengujian jumlah alkohol yang didapat dari tiap perlakukan dengan menggunakan Gas Chromatography (GC). Diagram alir proses fermentasi diperlihatkan pada Gambar 8. 3.3.7 Pengujian Pengujian yang dilakukan diantaranya uji pH akhir fermentasi, uji kadar dan etanol (penetapan berat jenis). Diagram alir penentuan uji pH akhir, serta kadar alkohol disajikan pada Gambar 8. 1) Uji pH akhir fermentasi (AOAC 2005) Media yang sudah difermentasi di uji pH akhirnya dengan menggunakan pH meter. Katoda pH meter dibilas dengan akuades kemudian dikeringkan dengan kertas tisu. Katoda dimasukkan ke dalam buffer dengan pH 6,8, ditunggu sampai ada tanda bunyi yang menunjukkan bahwa pH meter siap digunakan. pH meter dimasukkan ke dalam media uji, hasilnya dicatat. 2) Uji kadar etanol (Subekti 2006) Pengukuran konsentrasi etanol yang dihasilkan dengan menggunakan Gas Chromatography (GC). Identifikasi kadar etanol dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada kromatografi gas SupelcoTM 37 Component Fame Mix dengan kondisi sebagai berikut: gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit, sebagai bahan pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 ml/menit, dan oksigen

24

dengan aliran 200-300 ml/menit, kolom yang digunakan adalah kolom kapiler (capillary column) dB-23 berisi cyanopropil methylsil sepanjang 60 m dengan diameter dalam 0,25 mm, dengan tebal lapisan film 0,25 m. akhir 225 oC, suhu injektor 220 oC, dan suhu detektor 240 oC. Konsentrasi etanol diperoleh dari perhitungan rasio Area dimana luas area etanol sampel dibagi dengan luas area n-propanol sampel. Kemudian hasil rasio area tersebut dibagi dengan slope hasil kurva kalibrasi etanol. Rasio Area = Luas area etanol sampel : Luas area n-propanol sampel Temperatur terprogram sebesar 125 oC, kemudian suhu dinaikkan 5 oC per menit hingga suhu

Konsentrasi (%) = Rasio/Slope Konsentrasi etanol standar = 99,9 % Berat Jenis etanol standar = 798,21 g/L

25

Isolat Sacharomyces cerevei

Inokulasi 3-5 jarum ose

Ditumbuhkan pada PDA 10 ml

Inkubasi 48 jam suhu 25-30 oC

Inokulasi (5 jarum ose)

Ditumbuhkan pada PDB 200 ml

Inkubasi 48 jam suhu 25-30 oC

Kultur starter

Diambil 10 % dari media, dimasukan ke dalam 200 ml media

Kultur starter dan media

Gambar 6 Diagram alir pembuatan kultur starter.

(Rinaldy 1987 dalam Devis 2008 dimodifikasi)

26

Buah Lindur (B. gymnorrhiza)

Preparasi pemisahan daging dan kulit buah lindur

Pengeringan dan penghalusan

Diambil 200 gr

Hidrolisis (HCl 5 % 1:20 b/v, 121 oC, 2 jam)

Penyaringan (Nilon mesh 150)

Filtrat Gula 2 % NPK 0,5 % ZA 1%

Penambahan nutrisi

Media

Pasteurisasi 80 oC, 5 menit

Media

Perlakuan 1 (X1) 200 ml media (toples kaca)

Perlakuan 2 (X2) 200 ml media (toples kaca)

Perlakuan 3 (X3) 200 ml media (toples kaca)

27

Gambar 7 Diagram alir pembuatan media fermentasi dari buah lindur (B. gymnorrhiza).
(Rinaldy 1987 dalam Devis 2008 dimodifikasi)

Kultur starter dan media fermentasi 660 ml

Inkubasi 3 hari (X1)

Inkubasi 5 hari (X3)

Inkubasi 7 hari (X5)

Alkohol

Uji pH Uji Kadar etanol

Gambar 8 Diagram alir proses fermentasi dan penentuan kadar alkohol.

(Rinaldy 1987 dalam Davis 2008 dimodifikasi)