Pengembangan Teknik Kriopreservasi dari Sperma Segar Informasi dasar tentang Lele dumbo (Clarias gariepinus) Wan Khadijah

Wan Embong, Noor Azlina Kamaruding dan Ramli Bin Abdullah 1 Laboratorium Hewan Bioteknologi-Embrio (ABEL), Lembaga Ilmu Biologi, Fakultas Sains, University of Malaya, 50603 Kuala Lumpur, Malaysia. 2 Departemen Ilmu Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universiti Malaysia Terengganu, 21030 Kuala Terengganu, MALAYSIA Abstrak. Tujuan dari penelitian ini adalah: (a) Untuk mengevaluasi motilitas sperma segar sesuai dengan individu berat badan (BW) kelompok ikan lele, dan (b) Untuk mengembangkan teknik pembekuan sperma dengan upaya untuk mengoptimalkan keseimbangan dan faktor paparan uap. Dua percobaan dilakukan dalam penelitian ini. Di percobaan 1, pengaruh berat badan individu pada motilitas sperma segar dievaluasi dalam rangka untuk membentuk informasi dasar standar sebelum prosedur pembekuan sperma yang tepat dilakukan. Selain itu, Percobaan 2 dilakukan untuk mengevaluasi pengaruh faktor kombinasi durasi equilibrium, suhu uap dan uap durasi paparan pada posting-dicairkan cryopreserved tingkat motilitas sperma. Metodologi pembekuan Teknik ini diuraikan sebagai berikut: sedotan yang mengandung sperma ditempatkan dalam lemari es pada suhu 40C dengan tiga jangka waktu equilibrium (120, 140 atau 160 menit) setelah terkena uap nitrogen cair pada tiga uap suhu (-80, -90 atau-100oC) dengan tiga jangka waktu paparan uap (5, 10 atau 15 menit). Akhirnya, sedotan secara langsung terjun ke uap nitrogen cair pada-196o C. sperma beku yang dicairkan pada 30o C selama 30 detik untuk mengevaluasi tingkat motilitas menggunakan Semen Otomatis Analyzer-Ivos (Hamilton Thorne, USA). hasil dari percobaan 1 mengungkapkan bahwa BW besar lele dumbo memberikan total tertinggi motilitas (82,40 4,59%) percobaan 1 mengungkapkan bahwa BW besar lele dumbo memberikan total tertinggi motilitas (82,40 4,59%) diikuti oleh media BW (51,64 9,82%) dan BW kecil (40,40 12,16%), dimana ikan BW kecil yang berbeda secara signifikan total motilitas dibandingkan dengan dua kelompok lain. Pada percobaan 2, tertinggi nilai total motilitas dan motilitas progresif diperoleh dari faktor kombinasi 120 menit durasi equilibrium,-100o C Suhu uap dan 15 menit durasi paparan uap (87,44 2,07% dan 28.22 2.16%, masing-masing). Dapat disimpulkan kelompok berat badan besar diperoleh total motilitas tertinggi dan progresif motilitas. Kami juga berhasil mengembangkan teknik pembekuan dalam faktor-faktor kombinasi 120 menit durasi equilibrium, -100o C Suhu uap dan 15 menit paparan uap durasi dengan 28% adalah progresif motil dari total motilitas 87%. Kata kunci: motilitas sperma, sperma segar, berat badan, Equilibrium, paparan Vapor 1. pengantar Segar penilaian motilitas sperma merupakan langkah yang berguna untuk menunjukkan keberhasilan teknik kriopreservasi serta memberikan informasi dasar mengenai fekunditas lele dumbo. Sejumlah besar literatur telah dipublikasikan pada faktor-faktor yang mempengaruhi kualitas sperma pada ikan seperti membesarkan kontaminasi fotoperiode dan suhu, nutrisi, air dan makanan, stres, usia induk yang, musim kawin, penyakit induk yang, induksi hormonal dan

spermiation [1], [2], [3]. Umur induk yang dapat tampaknya terkait dengan berat badan mereka dan memainkan peran utama dalam periode pematangan sperma. Sampai saat ini, belum ada studi yang berkaitan dengan efek berat badan pada karakteristik motilitas sperma lele dumbo. Sampai saat ini, studi menyelidiki parameter kunci dari sampel sperma (misalnya komposisi ionik, osmolalitas [4], pengembangan media yang tepat aktivasi, solusi imobilisasi, agen cryoprotective, waktu equilibrium, harga pendingin, satuan kemasan sperma, air mani: rasio extender, bejana penyimpanan dan pencairan tarif [5], [6], [7] telah menunjukkan prestasi yang signifikan di banyak spesies ikan air tawar. Parameter-parameter ini yang selalu berbeda antara dan di dalam spesies ikan dan pertimbangan faktor interaksi harus dinilai dalam rangka untuk mengembangkan protokol pembekuan sukses. Protokol kriopreservasi sperma dapat bervariasi karena perbedaan spesifik spesies dalam ukuran sperma, bentuk, dan karakteristik biokimia [8]. Pengembangan protokol kriopreservasi sperma lele dumbo dalam penelitian ini bukanlah tugas yang sederhana karena komposisi mani ikan ini yang terdiri dari kadar lemak tinggi. Oleh karena itu, pilihan extender penting untuk memastikan pelarutan mudah dan penyerapan ke dalam sel-sel sperma. Freshwater Fish Ringer Extender (FRE) adalah pengencer yang digunakan dalam penelitian ini dan merupakan upaya awal di laboratorium kami untuk kriopreservasi sperma ikan lele dumbo. 2. metodologi 2.1. Pemeliharaan ikan induk yang Lele jantan Afrika, Clarias gariepinus, induk yang yang sehat dan matang secara seksual berusia 1 sampai 2 tahun dengan berat badan dalam kisaran 1 sampai 2 kg yang dipilih untuk tujuan percobaan. Manajemen rutin ikan meliputi pertukaran berkala air dengan air bersih yang segar untuk memastikan mudah penyerapan oksigen dan mengukur penyakit-pencegahan. Air keran dechlorinated sebelum dipasok ke ikan. Para induk yang sedang tangan-makan dengan "komersial finisher lapisan tumbuk" dua kali sehari, ad libitum dan harian dipantau. 2.2. Induksi Spermatogenesis Berat badan lele dipilih ditimbang untuk mengukur dosis hormon per berat badan untuk setiap individu ikan. Ovaprim (0,5 ml / kg berat badan, Syndel, Vancouver, Kanada) disuntikkan intramuskular ke dalam otot punggung ikan lele. Sebelum prosedur ini, kepala lele ditutupi oleh handuk basah untuk tetap tenang dan tenang selama injeksi. Sebagian besar ikan terus masih jika mata merekatertutup. Setelah menerima terapi hormon, jantanan tersebut diisolasi untuk bermalam dalam tangki terpisah untuk menghindari interaksi agresif dengan jantanan yang lain dan untuk memaksimalkan perawatan selama periode eksperimental. 2.3.2 . Percobaan 2 : Pengaruh Faktor Kombinasi Equilibrium Durasi , Vapor Suhu dan Paparan durasi Vapor on Post - Thawed Sperma cryopreserved dari Lele Afrika Semen dikoleksi dari testis ikan lele dikorbankan , diencerkan dengan Extender Ikan - Ringer terdiri dari NaCl ( 0,75 g ) , KCl ( 0,10 g ) , CaCl2 ( 0,016 g ) , MgSO4 ( 0,023 g ) , NaH2PO4 ( 0,041 g ) dan Glukosa ( 0,10 g ) per 100 ml , dengan rasio 1:10 menggunakan 0,5 ml atau 0,25 sedotan Perancis ml

. Sedotan yang mengandung semen diencerkan menjadi sasaran proses pembekuan . Penelitian ini melibatkan 3 x 3 x 3 percobaan faktorial yang terdiri dari 3 jangka waktu equilibrium ( 120 , 140 atau 160 menit ) , 3 suhu uap ( -80 , -90 atau - 100oC ) dan 3 jangka waktu paparan uap ( 5 , 10 atau 15 menit ) . Molaritas krioprotektan adalah tetap sebesar 10 % DMSO seperti yang dijelaskan oleh [ 9 ] . Setiap kombinasi perlakuan diulang 3 kali dengan 5 pengamatan per ulangan . Jumlah motilitas dan motilitas progresif digunakan untuk menilai tingkat survivability pasca - dicairkan sperma cryopreserved menggunakan analisa semen otomatis ( Ivos , Hamilton - Thorne , USA ) . 2.4. Statistical Analysis All the data were subjected to analysis of variance (ANOVA), followed by comparison of means using Duncans multiple range test (DMRT). Data analysis was performed by SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for windows, version 12.0. The data was presented as meanSEM which significant at (P<0.05). 3. Hasil dan Pembahasan BW besar lele dumbo memberikan total tertinggi motilitas (82,40 4,59%) diikuti oleh media BW (51,64 9,82%) dan BW kecil (40,40 12,16%), dimana ikan BW kecil secara signifikan berbeda total motilitas dibandingkan dengan yang lain dua kelompok. Nilai motilitas progresif BW kecil, menengah dan besar ikan 8.20 3,65%, 14,00 4,29% dan 17,40 3,36%, masing-masing (P> 0,05) (Tabel 1). Tabel 1: Penilaian motilitas sperma segar lele dumbo dalam kelompok berat badan yang berbeda

N * = Jumlah ikan.
ab

Berarti dengan berbeda superscripts dalam baris yang berbeda nyata (P <0,05).

Tabel 2 menunjukkan jumlah motilitas dan motilitas progresif pasca-dicairkan sperma cryopreserved dari lele dumbo. Nilai total tertinggi motilitas dan motilitas progresif diperoleh dari faktor kombinasi 120 menit durasi equilibrium,-100o C Suhu uap dan 15 menit durasi paparan uap (87,44 2,07% dan 28,22 2,16%, masing-masing). Kombinasi dari 140 menit,-100o C dan 10 menit menunjukkan terendah nilai total motilitas (59,27 8,00%), tetapi nilai terendah motilitas progresif diamati pada kombinasi 160 menit,-90oC dan 10 menit (12,20 2,24%). Ikan Ringer Extender (FRE) ditemukan pengencer yang cocok untuk lele dumbo berdasarkan penelitian ini, karena mempertahankan aktivitas sperma ketika semen diencerkan sebelum kedinginan karena stabilisasi sifat fisikokimia [10]. Extender telah dikembangkan menggunakan garam-dan-gula berbasis pengencer [11], [12]. Paparan krioprotektan sebelum pembekuan lain

parameter yang penting dalam kriopreservasi sperma dari banyak spesies, dan efeknya akan bervariasi tergantung pada krioprotektan tersebut, durasi paparan dan konsentrasi [13]. Peningkatan paparan krioprotektan dapat meningkatkan efek cryoprotective, tetapi juga dapat mengakibatkan peningkatan toksisitas pada sel sperma [14], [15]. Selain itu kelebihan, krioprotektan memiliki kelemahan karena dapat menginduksi denaturasi protein pada suhu yang lebih tinggi dan menyebabkan keracunan selular di sistem selular. Telah lama diakui bahwa paparan krioprotektan dapat menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan selama equilibrium sebelum pembekuan karena toksisitas mereka [16]. Toksisitas jelas krioprotektan tergantung pada jenis dan konsentrasi krioprotektan, durasi equilibrium dan suhu selama pemuatan [17]. Beberapa krioprotektan telah dilaporkan toksik pada sperma dan embrio ikan. Misalnya, natrium sitrat dikenal berbahaya bagi struktur dan integritas beberapa sperma ikan [18], sementara propilen glikol dan etilena glikol dilaporkan menjadi lebih beracun dari DMSO pada embrio tiram [19]. Namun, tingginya tingkat DMSO dapat menjadi racun bagi sperma ikan dibandingkan dengan krioprotektan yang umum digunakan seperti metanol, etanol dan gliserol [20]. Beberapa metode pembekuan dapat dilakukan seperti suhu diprogram perubahan atau perendaman sederhana dalam uap nitrogen cair diatas permukaan nitrogen cair [21]. Untuk lele dumbo, kami menerapkan dua langkah proses pembekuan dengan memungkinkan pengurangan suhu perlahan-lahan dengan waktu. Sebagai hasilnya, kami menemukan tingkat motilitas sperma berfluktuasi dengan kombinasi equilibrium dan faktor paparan uap karena beberapa langkah dan interaksi mereka, beberapa kesalahan terjadi pada setiap langkah dapat menumpuk dan menyebabkan kerugian besar sel layak. Dengan demikian, perhatian harus diberikan untuk berbagai detail pada setiap langkah, dan perawatan harus dilakukan untuk mengurangi atau menghilangkan sumber-sumber variasi yang tidak terkontrol [22]. Tabel 2: Jumlah motilitas dan motilitas progresif (rata-rata SEM) pasca-dicairkan sperma cryopreserved ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) menggunakan 10% DMSO di FRE extender untuk kombinasi durasi equilibrium, suhu uap dan durasi paparan uap.

N * = Total jumlah observasi (sedotan). abc Berarti dengan berbeda superscripts dalam kolom yang berbeda nyata (P <0,05) 4. Ucapan Terima Kasih Kami ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada anggota ABEL dan staf dari Institut Ilmu Biologi Mini Pertanian (Peternakan), yang membantu secara langsung maupun tidak langsung dalam proyek ini. Proyek ini secara finansial didukung oleh PPP Hibah Penelitian (P0060 / 2008a), University of Malaya.