LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Penyakit Kelainan Pembuluh Darah Jantung Atherogenesis Kelompok 8 - Anissa Permatadietha Ardiellaputri (1006661203) Abstrak Atherogenesis menjadi salah satu penyakit kelainan pembuluh darah jantung yang menyebabkan kematian utama pada pria dan wanita di negara barat. Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 500.000 kasus baru dan 125.000 menginggal tiap tahunnya akibat atherogenesis. Tingginya angka penyakit karena atherogenesis membutuhkan pilihan terapi lain yang dinilai efektif. Suatu teknik yang dapat diterapkan pada penderita atherogenesis adalah menumbuhkan pembuluh darah baru (angiogenesis) yang dapat membawa darah ke jantung. Dalam hal ini, salinan dari gen yang mengkode Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) yang merupakan protein angiogenik mampu merangsang proses tersebut yang pada akhirnya memicu perbaikan aliran darah. VEGF yang dimasukkan ke dalam tubuh dan berikatan dengan reseptor VEGFR pada sel endotel akan mendorong muculnya pembuluh darah baru dari arteri dan jika berhasil, dapat membawa darah melintasi arteri-arteri yang tersumbat. Gen ini memiliki beberapa isoform, beberapa diantaranya dominan pada pertumbuhan angiogenik. Penggunaan VEGF 121 dinilai lebih efektif sebab homodimer ini tidak membentuk ikatan dengan molekul heparin sehingga gen ini dinilai yang paling mudah berdifusi. Kata kunci: Atherogenesis, angiogenesis, VEGF, reseptor VEGF/VEGFR

1.

Atherogenesis Atherogenesis atau aterosklerosis merupakan penebalan dan pengerasan arteri akibat terbetuknya plak yang tersusun dari sekumpulan lipoprotein, matriks esktrasel seperti kolagen, proteoglikan, dan glikosaminoglikan, kalsium, sel-sel otot polos, sera sel-sel radang terutama makrofag, limfosit T, mastosit, dan sel dendritik (Vuster, 2007). Aterosklerosis dapat terjadi pada seluruh arteri, sehingga manifestasi klinis yang muncul tergantung pada sistem organ yang terkena. Pada saat ini diketahui bahwa aterosklerosis merupakan respon inflamasi kronis terhadap cedera pembuluh darah akibat dari berbagai sebab yang mengaktivasi atau mencederai endotel (Albertini et al, 2008). Arteri normal merupakan bentukan menyerupai tabung dengan bagian dalam yang tersusun dari lapisan endotel yang berfungsi sebagai komponen antitrombotik dengan cara menghalangi makrofag yang beredar didalam aliran darah memasuki dinding pembuluh darah. Selain itu lapisan endotel juga merupakan organ autokrin dan parakrin yang mensintesa zat-zat anti peradangan, menjalankan fungsi mitogenik, kontraktil dan proses hemostasis.

Gambar 1. Perbandingan kondisi arteri normal (kiri) dengan kondisi arteri pada penderita aterosklerosis (Sumber. http://www.robertsfox.com/, diakses pada 18 Februari 2014, 5:55PM)

Plak atheroma yang terbentuk menyebabkan disfungsi endotel, dimana kada keadaan ini terjadi penurunan sintesis atau rilis nitrit oxide (NO). Nitrat oksida dikenal sebagai mediator kunci dari sel endotel. Dari review beberapa jurnal, nitrat oksida tidak hanya berperan dalam mengontrol
Teknologi Obat dan Kosmetik 1

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

tonus vasomotor melainkan juga berperan dalam homeostasis pembuluh darah dan syaraf serta proses imunologik. Nitrat oksida endogen diproduksi melalui perubahan asam amino L-arginine menjadi L-citrulline oleh enzim NO-synthase (NOS). Nitrat oksida yang dihasilkan didalam endotel akan berdifusi ke dalam otot polos pembuluh darah yang akan mengaktifkan enzim guanylate cyclase (GC). Bersamaan dengan peningkatan cyclic GMP, akan terjadi relaksasi dari otot polos pembuluh darah. Jadi hasil akhir dari peningkatan Nitrat Oksida akan terjadi vasodilatasi. Disfungsi endotel, yang lebih tepatnya dapat dikatakan sebagai aktivasi endotel merupakan proses yang merupakan serentetan kejadian proses properadangan, proliferasi dan prokoagulasi, ditandai dengan turunnya sintesa NO, sehingga menyebabkan lipoprotein dan monosit lebih mudah menembus dinding pembuluh darah yang kemudian akan mengalami oksidasi dan akumulasi di intima, proliferasi sel otot polos pembuluh darah, penimbunan matriks ekstraseluler dan konstriksi pembuluh darah. Radikal bebas dan LDL yang teroksidasi dan penurunan antioksidan bertanggung jawab terhadap peningkatan degradasi NO. Selain itu peningkatan LDL dan LDL yang teroksidasi akan menghambat jalur signaling biosintesis dari NO melalui penghambatan protein kinase C dan protein G (Fatmawati dkk., 2010). 2. 2.1. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Struktur dan Karakteristik Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) atau faktor pertumbuhan pembuluh darah adalah protein yang merangsang pertumbuhan, daya tahan dan penggandaan sel pembuluh darah. VEGF membantu proses angiogenesis yaitu proses pembentukan pembuluh darah baru. VEGF juga meningkatkan pemeliharaan pembuluh darah sehingga bisa memastikan sel darah yang prematur dapat bertahan hidup. VEGF berperan dalam perpindahan sel untuk mencegah proses kematian sel secara normal (apoptosis).

Gambar 2. Signal anti-apoptosis yang dihasilkan oleh gen VEGF (Sumber. F.S. Zachary, 2001)

VEGF adalah sebuah basa, 34-460kGhomodimeric, hepari-binding glycoprotein, dan gen VEGF berada di kromosom 6p12 (Gambar 2). VEGF memiliki enam isoform, antara lain: VEGF-A yang biasanya hanya disebut sebagai VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEF-D, VEGF-E, dan Placental Growth Factor (PIGF). Pada manusia, splicing alternatif gen VEGF menghasilkan empat asam amino isoform,VEGF-a121, VEGF-a 165, VEGF-a 189, dan VEGF-a 206 serta varian-varian lain yang lebih jarang. Varian-varian ini bersifat isoform pada exon 1 dan 4 asam amino pada exon 2 yang mana ada daerah ini terjadi pemotongan signal eptida ketika VEGF bertemu dengan reseptornya. Perbedaan tiap varian didasarkan pada keberadaan ikatan molekul tersebut dengan heparin, terjadi exon 6 sampai 8 (Gambar 3). 2.2. Mekanisme aksi, Reseptor, serta Fungsi VEGF Anggota VEGF akan bekerja lewat pengikatannya pada reseptor dengan aktivitas torosin kinase. Reseptor VEGF tergolong pada reseptor tirosin kinase terdiri dari, VEGFR-1/Flt-1, VEFDR2/Flk-1, dan VEGFR-3/Flt4. VEGFR-1 terdapat di endotel vaskuler, haematopoietic stemcells,
Teknologi Obat dan Kosmetik 2

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

makrofag, dan monosit. Selain bentuk terikat VEGFR-1 juga mempunyai bentuk yang terlarut dalam serum disebut solube fms-like tyrosinekinase-1 (sFlt-1). VEGFR-2 terdapat di endotel vaskuler dan limfatik, sedangkan VEGFR-3 terutama terdapat di sel-sel endotel limfatik. Liganligan dari VEGFR-1 yait: VEGF-A, VEGF-B, dan PIGF. Ligan-ligan untuk VEGFR-2 yaitu: VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, dan VEGF-E. Sedangkan ligan-ligan untuk VEGF-3 yaitu: VEGF-C dan VEGFD (Gambar 4).

Gambar 3. (a) Struktur VEGF, (b) Skema varian VEGF-A (Sumber. F.S. Grnewald et al., 2010)

Gambar 4. Skema ilustrasi spesifikasi interaksi ligan VEGF dengan reseptornya (Sumber. Ferrarra et al., 2003)

Masing-masing isoform VEGF memiliki peranan berbeda-beda. VEGF-A merupakan faktor permeabilitas vascular kuat dan dominan pada proses angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru). VEGF-A dan VEGF-B memicu diferensiasi sel progenitor endotel masa awal embrional, merangsang pertumbuhan sel endotel, pembentukan formasi tubular, dan migrasi sel. PIGF diekspresikan tinggi di plasenta dan terikat hanya pada VEGFR-1. Derajat eskpresi VEGF-C dan VEGF-D pada VEGFR-3 yang tinggi memungkinkan metastasis tumor melalui pembuluh limfe pada binatang percobaan. VEGF-E memicu adanya angiogenesis pada kulit secara lokal dan sementara. Bebrapa fungsi dari setiap isoform VEGF dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Tipe VEGF dan peranannya

Tipe VEGF-A

Fungsi Angiogenesis migrasi dan mitosis sel endotel aktivitas methane monooxygenase dan v3 Kemotaksis makrofag dan glanulosit Vasodilatasi
3

Teknologi Obat dan Kosmetik

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

Angiogenesis embrionik Proses limfangiogenesis Dihasilkan plasenta dan penting untuk angiogenesis keadaan iskemik, peradangan, penyembuhan luka dan kanker 2.3. Aktivitas Biologis VEGF (Mekanisme Angiogenesis sebagai salah satu metode Penyembuhan Aterosklerosis) 2.3.1. Proses Angiogenesis Proses angiogenesis tersusun dari beberapa tahapan yang dimulai dari proses inisiasi, yaitu dilepaskannya enzim protease dari sel endotel yang teraktivasi; pembentukan pembuluh darah vaskular, antara lain terjadinya degradasi matriks ekstraseluler ( Extra Cellular Matrix, ECM), migrasi dan proliferasi sel endotel, serta pembuatan ECM baru; yang kemudian dilanjutkan dengan maturasi/ stabilisasi pembuluh darah yang terkontrol dan dimodulasi untuk memenuhi kebutuhan jaringan. Tahapan-tahapan angiogenesis dapat dijelaskan sebagai berikut: A. Pelepasan faktor stimulus angiogenik Kumpulan sel pada jaringan yang mengalami kerusakan (luka) atau mengalami hipoksia, akan melepaskan faktor angiogenik (berupa faktor pertumbuhan dan protein rantai pendek lainnya) yang dapat berdifusi ke sel-sel pada jaringan sekitarnya. Menyusul proses tersebut, terjadi pula proses inflamasi (Carneliet dan Coll, 1998). Pada proses inflamasi, pembuluh darah kecil yang terdapat secara lokal memegang peranan penting dalam proses yang terjadi selanjutnya karena pembuluh darah merupakan suatu jaringan yang dilapisi oleh sel endotel, yang akan berinteraksi dengan faktor peradangan dan angiogenik (Gambar 5).

VEGF-B VEGF-C dan VEGF-D PIGF

Gambar 5. Struktur matriks ekstrakseluler Membrana basalis dan matriks interstitialis merupakan bagian dari matriks ekstraseluler. Terlihat adanya ikatan antar sel epitel dan endotel, yang melapisi pembuluh darah, pada ECM (Sumber. Anonymous)

Faktor-faktor angiogenik ini dapat menarik dan mendorong proliferasi sel endotel dan sel radang. Menjelang proses migrasi, sel-sel radang juga mensekresi molekul-molekul yang juga berperan sebagai stimulus angiogenik. B. Pelepasan enzim protease dari sel endotel Faktor angiogenik berupa faktor pertumbuhan kemudian berikatan dengan reseptor yang spesifik terdapat pada reseptor sel endotel (EC) di sekitar lokasi pembuluh darah lama. Ketika faktor angiogenik berikatan dengan reseptornya, sel endotel akan teraktivasi dan menghasilkan signal yang kemudian dikirim dari permukaan sel ke nukleus. Organelorganel sel endotel kemudian mulai memproduksi molekul baru antara lain adalah enzim protease yang berperan penting dalam degradasi matriks ekstraseluler untuk mengakomodasi percabangan pembuluh darah (Liekens S. et al., 1987) (Gambar 6). C. Disosiasi sel endotel dan degradasi ECM yang melapisi pembuluh darah lama Disosiasi sel endotel dari sel-sel di sekitarnya, yang distimulasi oleh faktor pertumbuhan angiopoietin, serta aktivitas enzim-enzim yang dihasilkan oleh sel endotel yang teraktivasi,
Teknologi Obat dan Kosmetik 4

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

seperti urokinase-plasminogen activator (uPA) dan matrix metalloproteinases (MMPs), dibutuhkan untuk menginisasi terbentuknya pembuluh darah baru. Dengan sistem enzimatik tersebut, sel endotel dari pembuluh darah lama akan mendegradasi ECM dan menginvasi stroma dari jaringan-jaringan di sekitarnya sehingga sel-sel endotel yang terlepas dari ECM ini akan sangat responsif terhadap signal angiogenik (Polverini PJ, 2002).

Gambar 6. Tahap-tahap Proses Angiogenesis Proses ini melibatkan aktivasi sel endotel (EC) oleh faktor angiogenik, proliferasi EC, degradasi membran basal (ECM), pembentukan struktur tabung pembuluh darah, dan stabilisasinya (Sumber. Liekens S. et al., 1987)

D. Migrasi dan proliferasi sel endotel Degradasi proteolitik dari ECM segera diikuti dengan migrasinya sel endotel ke matriks yang terdegradasi. Proses tersebut kemudian diikuti dengan proliferasi sel endotel yang distimulasi oleh faktor angiogenik, yang beberapa di antaranya dilepaskan dari hasil degradasi ECM, seperti fragmen peptide, fibrin, atau asam hialuronik (Kleinsmith LJ, et al). E. Pembentukan lumen dan pembuatan ECM baru Sel endotel yang bermigrasi tersebut kemudian mengalami elongasi dan saling menyejajarkan diri dengan sel endotel lain untuk membuat struktur percabangan pembuluh darah yang kuat (Kleinsmith LJ, et al). Proliferasi sel endotel meningkat sepanjang percabangan vaskular. Lumen kemudian terbentuk dengan pembengkokan (pelengkungan) dari sel-sel endotel. Pada tahap ini kontak antar sel endotel mutlak dibutuhkan. F. Fusi pembuluh darah baru dan inisiasi aliran darah Struktur pembuluh darah yang terhubung satu sama lain akan membentuk rangkaian atau jalinan pembuluh darah untuk memediasi terjadinya sirkulasi darah. Pada tahap akhir, pembentukan struktur pembuluh darah baru akan distabilkan oleh sel mural (sel otot polos dan pericytes) sebagai jaringan penyangga dari pembuluh darah yang baru terbentuk. Tanpa adanya sel mural, struktur dan jaringan antar pembuluh darah sangat rentan dan mudah rusak (Carneliet dan Coll, 1998). 2.3.2. Faktor Angiogenesis Berdasarkan aksi dan targetnya, faktor-faktor angiogenik dapat dikategorikan menjadi 3 kelompok, yaitu sebagai berikut: i. Kelompok faktor angiogenik yang memiliki target sel endotel, untuk menstimulasi proses mitosis. Contohnya faktor angiogenik vascular endothelial growth factor (VEGF) dan angiogenin yang dapat menginduksi pembelahan pada kultur sel endotel (Folkman dan Klagsbrun, 1987). ii. Kelompok kedua merupakan molekul yang mengaktivasi sel target secara luas selain sel endotel. Beberapa sitokin, kemokin, dan enzim angiogenik termasuk dalam kelompok ini. Fibroblast growth factor (FGF-2) merupakan sitokin kelompok ini yang pertama kali dikarakterisasi (Goren HG. et al., 2002).

Teknologi Obat dan Kosmetik

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

iii. Kelompok ketiga merupakan faktor yang bekerja tidak langsung. Faktor-faktor angiogenik pada kelompok ini dihasilkan dari makrofag, sel endotel, atau sel tumor. Kelompok faktor yang paling banyak dipelajari adalah tumor necrosis factor alfa (TNF-) dan transforming growth factor beta (TGF-) yang menghambat proliferasi sel endotel in vitro.( Liekens S. et al., 1987) Secara in vivo, TGF- menginduksi angiogenesis dan menstimulasi ekspresi TNF-, FGF-2, Platelet Derived Growth Factor (PDGF), dan VEGF dengan menarik sel-sel inflamatori. TNF- diketahui meningkatkan ekspresi VEGF dan reseptornya, interleukin-8, dan FGF-2 pada sel endotel. Aktivitas TNF- ini menjelaskan peranannya dalam angiogenesis secara in vivo. Beberapa kemungkinan mekanisme stimulasi angiogenesis oleh faktor angiogenik tipe ini antara lain: Mobilisasi makrofag dan mengaktivasi sel tersebut untuk mensekresi hormon pertumbuhan atau faktor kemotaktik sel endotel pembuluh darah, atau bahkan mensekresi keduanya. Menyebabkan terjadinya pelepasan mitogen sel endotel (contohnya b-FGF) yang dapat disimpan di ECM. Menstimulasi pelepasan penyimpanan intraseluler faktor pertumbuhan sel endotel. 2.3.3. Aktivitas VEGF dalam Mekanisme Angiogenesis VEGF berinteraksi dengan reseptor FLK-1 atau KDR (VEGFR-2) sehingga menstimulasi proliferasi, migrasi, ketahanan, dan permeabilisasi sel endotel. Sedangkan VEGFR-1 berfungsi sebagai inhibitor dari aksi VEGFR-2. Peran VEGF pada sel endotel dapat dilihat pada gambar 7.

Gambar 7. Pengikatan VEGF pada VEGFR-2 yang Menstimulasi Proliferasi Migrasi, Ketahanan, dan Permeabilisasi Sel Endotel (Sumber. Perona R, 2006)

Tepat setelah VEGF menempel pada VEGFR, terjadi peristiwa dimerisasi atau perubahan konformasi pada VEGF reseptor. Lalu terjadi autofosforilasi atau transfosforilasi. Proses autofosforilasi ini terjadi pada tyrosine kinase reseptor yang berada di sitosol. Proses ini membutuhkan suatu fosfat, sihingga proses dapat berjalan bila fosfat menempel pada tyrosine kinase reseptor. Tirosin yang terfosforilasi (phosphotyrosine) akan bertindak sebagai tempat ikatan bagi protein lain, yaitu protein yang mengandung SH2 domains. SH2 domain (Src homology region 2) merupakan suatu jenis kelompok protein yang dapat mengenal tirosin yang terfosforilasi. Setelah itu terikat dengan SOS. SOS adalah suatu guanyl nucleotiderelease protein (GNRP). Jika teraktivasi akan menyebabkan pertukaran GDP dengan GTP pada suatu protein G, yaitu Ras. Nantinya Ras ini yang awalnya inaktif menjadi aktif. Ras merupakan protein penting dalam signaling RTK berfungsi mengantarkan signal dari reseptor tyrosine kinase ke dalam nukleus. Ras yang teraktivasi akan mengaktifkan kinase seluler yaitu raf1. Kemudian Raf-1 kinase akan memfosforilasi cellular kinase yang lain yaitu MEK sehingga MEK menjadi aktif. MEK aktif ini akan diubah menjadi ErK di dalam nukleus sel. Salah satu target akhir kinase cascade adalah faktor transkripsi. Fosforilasi faktor transkripsi akan menjadi aktif dan
Teknologi Obat dan Kosmetik 6

LTM 1 - Gen VEGF 121 sebagai Bahan Aktif dalam Pengobatan Atherogenesis

mengikat DNA lalu akan mempengaruhi perubahan transkripsi gen, kemudian tumbuh dan membentuk pembuluh darah baru. Tekanan oksigen dapat berfungsi sebagai regulator VEGF. Paparan kondisi hipoksia menginduksi ekspresi VEGF dengan cepat. Sebaliknya, dalam kondisi kadar oksigen normal (normoksia), ekspresi VEGF menurun dan megalami stabilisasi. Tingkat ekspresi VEGF juga bergantung pada jumlah sitokin inflamatori dan hormon pertumbuhan, termasuk di antaranya Epidermal Growth Factor (EGF), Interleukin-1 (IL-1), platelet derived growth factor (PDGF), tumor necrosis factor- (TNF-), dan transforming growth factor- 1 (TGF- 1) (Goren HG. et al., 2002). Kesimpulan Penyembuhan secara genetik bagi penderita ateroskleorsis dengan gen VEGF121 dapat digunakan sebagai alternatif, yakni melalui proses angiogenesis. Proses ini merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang kemudian akan memperbaiki aliran darah yang tersumbat akibat penumpukan atheroma plaque pada arteri. VEGF yang dimasukkan ke dalam tubuh akan menempel pada vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) dan menstimulasi migrasi dan proliferasi sel endotel pada arteri, sehingga memicu proses angiogenesis. VEGF terlibat dalam banyak tahap respon angiogenik, antara lain menstimulasi degradasi matriks ekstraseluler di sekitar sel endotel; meningkatkan proliferasi dan migrasi sel endotel; membantu pembentukan struktur pembuluh darah. VEGF juga bersifat pro-survival factor untuk sel endotel. Metode pengobatan baru selain terapi gen dengan injeksi, membutuhkan kajian lebih lanjut agar dapat menghasilkan suatu terobosan sediaan obat dengan kemampuan gene delivery yang baik serta bentuk sediaan yang diterapkan tepat release pada pembuluh darah yang menjadi target penyembuhan.

Daftar Pustaka Anonymous. Extracellular matrix. (diakses 19 Februari 2014). Dikutip dari http://www.answers.com /topic/extra-cellular-matrix. Carmeliet P, Collen D. (1998). Vascular development and disorders: molecular analysis and pathogenic insights. Kidney Int.; 53 : 1519-9. Fatmawati H, Satuman, Endang SW, Rudijanto A, Indra MR. (2010). Pengaruh likopen terhadap penurunan aktivitas nuclear factor kappa beta (NF-kB) dan ekspresi intraceluller cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) pada kultur HUVECs yang dipapar leptin. J. Ilmu Dasar. 11(2):143-50. Folkman J, Klagsbrun M. (1987). Angiogenic factors. Science; 235: 442-7. Goren HG, Soker S, Vlodavsky I, Neufeld G. (2002). The binding of vascular endothelial growth factor to its receptors is dependent on cell surface-associated heparin-like molecules. J Biol Chem.;267(9): 6093-8. Liekens S, Clercq, Neyts J. Angiogenesis: An introduction. (diakses pada 19 Februari 2014). Dikutip dari http://www.med. unibs.it/~airc/sandra/introduction.html. Perona R. (2006). Cell signalling: growth factors and tyrosine kinase receptors. Clht Transl Oncol.; 8(2): 77-82. Polverini PJ. (2002). Angiogenesis in health and disease: insight into basic mechanisms and therapeutic opportunities. J Dental Edu.; 66: 962-75. Vuster, F. (2007). Cecil Medicine 23rd edition (eds) dalam L Goldmann (et al). Philladelphia: Saunders Elsevier. Zachary, Ian. (2001). Signaling mechanisms mediating vascular protective actions of vascular endothelial growth factor. American Journal of Physiology - Cell Physiology Vol. 280: 625 2634.

Teknologi Obat dan Kosmetik