PENDAHULUAN Karbohidrat adalah aldehid atau alkohol keton yang mengandung karbon, hidrogen dan oksigen dimana hidrogen

dan oksigen pada umumnya dalam rasio (jumlah) yang sama dalam air. Karbohidrat dapat dipilah menjadi tiga golongan berdasarkan ukuran molekulnya: monosakarida sederhana dan turunannya; oligosakarida, yang terbentuk dengan kondensasi dua satuan monosakarida atau lebih; dan polisakarida, yang terdiri atas satuan monosakarida berantai dan panjang, disambungkan dengan cara kepala ke ekor, berbentuk rantai lurus atau bercabang. Dari segi kimia, karbohidrat atau gula yang berbobot molekul rendah mempunyai sejumlah sifat yang sama. Mereka berupa senyawa polihidroksi alifatik yang aktif optik dan biasanya sangat mudah larut dalam air. Monosakarida Monosakarida atau gula sederhana pada hakikatnya adalah aldehida atau keton polihidroksi, walaupun dapat mencakup pula glikoaldehida yang hanya mempunyai satu gugus hidroksil. Monosakarida merupakan senyawa tanwarna, aktif optik, dan larut dalam air. Sebaian besar berupa rantai lurus. Struktur monosakarida:

Oligosakarida Oligosakarida adalah polimer yang terbentuk dengan menyambungkan beberapa satuan monosakarida melalui ikatan glikosida. Oligosakarida larut dalam air, bersifat aktif optik, paling mudah dibedakan dari monosakarida dengan cara hidrolisis menjadi monomernya. Oligosakarida dapat mereduksi atau tidak mereduksi, bergantung pada apakah gugus karbonil yang berpotensi mereduksi terlibat dalam pembentukan ikatan glukosida atau tidak. Salah satu masalah utama pada identifikasi oligosakarida ialah membedakan berbagai isomer. Dalam hal disakarida yang mengandung glukosa, ada delapan struktur isomer yang mungkin dan semuanya telah diketahui. Isomer yang satu dapat dibedakan dengan yang lain dengan cara kromatografi yang sesuai.

Sifat kimia oligosakarida menyerupai monosakarida dan sebagian besar cara memisahkannya sama. Polisakarida Polisakarida atau glikan didefinisikan sebagai polimer monosakarida dan turunannya mengandung sepuluh satuan atau lebih. Akan tetapi, sebagian besar polisakarida alam mengandung jauh lebih dari sepuluh satuan dan ada yang mengandung beberapa ribu satuan. Polisakarida biasanya diperoleh sebagai senyawa padat yang amorf bukan kristal walaupun derajat kekristalan dapat dideteksi dengan metode difraksi sinar-X. Polisakarida yang paling dikenal, yaitu selulosa dan pati, merupakan polimer dari gula tunggal, glukosa. kerumitan struktur polisakarida disebabkan satuan gula dapat terikat bersama melalui ikatan eter dengan berbagai cara yang berlainan. Struktur Polisakarida:
2

BIOSINTESIS KARBOHIDRAT Produksi monosakarida terjadi melalui fotosintesis yaitu suatu proses biologi yang mengubah energi elektromagnetik menjadi energi kimiawi. Dalam tumbuhan hijau, fotosintesis terdiri dari dua golongan reaksi. Satu golongan terdiri dari reaksi cahaya yang sesungguhnya mengubah energi elektromagnetik menjadi potensi kimiawi. Golongan lain terdiri dari reaksi enzimatik yang menggunakan energi dari reaksi cahaya untuk mengfiksasi karbon dioksida menjadi gula. Reaksi terakhir ini sering disebut reaksi gelap. Hasil dari kedua reaksi tersebut dapat disimpulkan menjadi reaksi sederhana sebagai berikut.

Proses Fotosintesis Reaksi terang Proses fotosintesis berlangsung dalam 2 proses. Proses pertama merupakan proses

yang tergantung pada cahaya matahari (Reaksi Terang), yaitu reaksi yang membutuhkan energi cahaya matahari Iangsung dan molekul-molekul energi cahaya tersebut belum dapat digunakan untuk proses berikutnya. Oleh karena itu pada reaksi terang ini, energi cahaya
3

matahari yang belum dapat digunakan tersebut akan dikonversi menjadi molekul-molekul energi yang dapat digunakan yaitu dalam bentuk energi kimia. Konversi energi cahaya menjadi energi kimia dilakukan oleh aktvitas pigmen daun (klorofil). Dalam reaksi terang, cahaya yang diserap klorofil khususnya klorofil a akan menggerakkan transfer elektron dan hidrpgen dari air ke akseptor yaitu NADP+. Dalam proses ini, terjadi penguraian air sehingga melepas O2 sebagai produk sampingan. Selanjutnya, NADP+ tereduksi menjadi NADPH dengan cara menambahkan sepasang elektron bersama dengan H+. reaksi terang juga menghasilkan ATP dengan memberi tenaga bagi penambahn gugus fosfat pada ADP, suatu proses yang disebut fotofosforilasi. Oleh karena itu dapat disimpulkan hasil dari reaksi terang yaitu ATP sebagai energi peredaran sel yang serbaguna, NADPH sebagai sumber elektron yang berenergi dan O2 sebagai produk sampingan. Reaksi gelap Proses kedua adalah proses yang tidak membutuhkan cahaya (Reaksi Gelap) yang terjadi ketika produk dari reaksi terang digunakan untuk membentuk ikatan kovalen C-C dari karbohidrat. Pada proses ini, CO2 atmosfer (atau CO2 dari air untuk organisme akuatik/marine) ditangkap dan dimodifikasi oleh penambahan hidrogen menjadi bentuk karbohidrat. Reaksi gelap biasanya dapat terjadi dalam gelap apabila energi carrier dari proses terang tersedia. Reaksi gelap ini berlangsung dalam stroma kloroplas. Ilustrasi terjadinya proses fotosintesis tersebut tertera pada gambar berikut.

Prosesnya dibagi dalam tiga tahap yaitu fiksasi, reduksi dan regenerasi. Tahap fiksasi merupakan tahap pengikatan CO2 oleh enyawa baratom 5 karbon, ribulosa difosfat (RDP), dan dikatalisis oleh enzim RuBP karboksilase atau rubisko. Hasil fiksasi ialah senyawa 6 karbon yang tidak stabil sehingga terurai menjadi asam 3-fosfogliserat (APG). Tahap reduksi diawali dari proses fosforilasi APG menjadi 1,3 difosfogliserat (DPG) yang kemudian direduksi oleh NADPH2 membentuk gliseraldehida-3-fosfat (G3P). G3P melalui sederetan reaksi membentuk ribulosa fosfat (RP0, yang kemudian difosforilasi oleh ATP menjadi ribulosa difosfat (RDP). ISOLASI KARBOHIDRAT Banyak karbohidrat yang larut dalam air. Ekstraksi bahan yang telah dihilangkan lemaknya dengan air didih netral akan menyisakan polisakarida dinding sel dan bahan nonpolisakarida yang tidak larut. Ekstraksi dengan larutan basa dingin akan menghilangkan hemiselulosa dan yang tersisa selulosa. Kekutan basa dapat diubah-ubah jika kita menghendaki ekstraksi hemiselulosa secara selektif. Biasanya yang dipakai adalah larutan KOH 24% atau NaOH 17,5% untuk mengekstraksi seluruh hemiselulosa dan akan meninggalkan sisa yang dikenal sebagi -selulosa yang mengandung 40% polisakarida lain seperti xilan,manan dan sebagainya tergantung pada sumbernya. Pemurnian selulosa yang lebih lanjut dilakukan dengan melarutkannya ke dalam asam fosfat 85% dan mengendapkannya dengan penambahan tiga volume air suling sehingga diperoleh selulosa yang mengalami penguraian hebat. Kita juga dapat memfraksinasi dengan cara penambahan asam (pH sekitar 4,5) sehingga selulosa berbobot molekul tinggi mengendap. Hemiselulosa yang masih tinggal dalam larutan dapat diendapkan dengan penambahan aseton,alkohol dll atau sederet pelarut khas digunakan untuk memfraksinasikannya. Cara lain untuk memfraksinasi campuran hemiselulosa adalah memakai selulosa penukar ion atau Sephadex dan pengendapan dengan ion logam khas. Karbohidrat berbobot molekul rendah dapat diperoleh dari beningan etanol 80% atau dapat diekstraksi langsung dari bahan tumbuh dengan memakai etanol atau 2-propanol. Senyawa ion (garam, asam amino, asam organik) dihilangkan paling baik dengan damar penukar ion walaupun damar basa kuat atau damar asam kuat dapat mempengaruhi gula.
5

Asam gula dan fosfat gula dapat dihilangkan dengan damar penukar anion, tetapi pemisahannya dari komponen nonkarbohidrat dengan cara pengirisan fraksi yang cocok.

Isolasi Karbohidrat

Bahan Kasar (ekstraksi dengan air mendidih)

Tak larut Ekstraksi dengan NaOH 17,5 % atau KOH 24%

Larut Tambah etanol sampai 80%

tak larut -selulosa

larut (asamkan dengan asam fosfat 85% atau + pH sekitar 4,5)

tak larut pektin pati gom muscilago fruktan

larut damar penukar ion

endapan hemiselulosa bobot molekul tinggi

larut hemiselulosa bobot molekul rendah ditahan fosfat asam efluen monosakarida oligosakarida

Metode khusus untuk memurnikan gula netral yang tersisa:

Sampel (Polihidroksi) Kolom+borat

senyawa kompleks borat anion

Polihidroksi + borat anion Reagen: pengelusi dapar borat Kolom damar penukar anion

Polihidroksi+ borat kation Kolom damar penukar kation

Polihidroksi+borat Metanol (CH3OH)

borat dan metanol berikatan

Distilasi (metil borat) menguap

Polihidroksi murni

IDENTIFIKASI KUALITATIF a. Monosakarida Identifikasi kualitatif monosakarida dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.

Kromatografi Kertas

totolkan ekstrak pada kertas Whatman no.1

kembangkan dalam 4 pengembang yang berlainan, BAA -BEA - BTPA - PhOH

keringkan

periksa dengan sinar UV, positif monosakarida jika bercak berfluoresensi

Kromatografi Lapis Tipis

panaskan kertas pada suhu 1050C selama 5 menit

celupkan ke dalam pereaksi anilina hidrogen ftalat

Cara ini tidak jauh berbeda dengan kromatografi kertas. Perbedaan hanya terdapat pada plat dan pengembang yang digunakan.

totolkan ekstrak pada plat KLT

kembangkan dalam campuran pengembang butanol - asam asetat - eter - air (9:6:3:1) selama 4 jam

keringkan

semprot plat KLT dengan anilina hidrogen ftalat

panaskan plat pada suhu 1000C selama 10 menit

Jika timbul bercak berwarna merah jambu = ketosa, pentosa = hijau, heksosa = biru. Jika RF(x100) 09 = sukrosa, 22 = glukosa, 27 = fruktosa, 40 = xilosa, 47 = ribose, 55 = ramnosa.

b. Oligosakarida Identifikasi oligosakrida dilakukan dengan menggunakan KLT. Caranya sama saja seperti identifikasi monosakarida dengan menggunakan KLT perbedaan hanya terdapat pada pereaksi semprot yang digunakan. Ada dua pereaksi semprot yang digunakan pada identifikasi oligosakarida, yaitu : Pereaksi semprot trifeniltetrazolium akan menghasilkan warna merah pada oligosakarida yang mempunyai ikatan 1 ke 4 atau 1 ke 6. Pereaksi semprot orsinol HCL 1 M akan menghasilkan warna merah pada oligosakarida yang mengandung satuan ketosa

c. Alcohol gula dan skilitol Untuk mengidentifikasi alcohol gula ada dua pengembang yang digunakan, identifikasi dilakukan dengan menggunakan KLT. Pengembang umum

Totolkan ekstrak pada plat KLT

Kembangkan dalam campuran pengembang propanol - etil asetat - air (7 : 1 : 2)

keringkan

Celupkan kedalam pereaksi celup AgNO3 atau lembayung bromokresol

keringkan

celupkan kedalam larutan NaOH 0,5% dalam etanol

setelah 10 menit pada suhu kamar akan timbul bercak coklat

Pengembang kedua

Totolkan ekstrak pada plat KLT

kembangkan didalam metil etil keton - asam asetat - asam borat (dalam air) (9 : 1 : 1)

keringkan selama 5 - 10 menit pada suhu kamar

timbul bercak coklat - hitam

semprot dengan AgNO3 amonia

keringkan

celupkan kedalam larutan asam hidrofluorida

Siklitol biasanya dipisahkan dan diidentifikasi dengan cara gabungan KKt dan elektroforesis. Caranya sama saja dengan identifikasi monosakarida dengan menggunakan kromatografi kertas perbedaannya hanya pada pengembangnya saja. Pengembang yang dapat digunakan untuk siklitol adalah aseton air (17 : 3), butanol piridina air (10 : 3 : 3). Selain itu dapat juga digunakan pengembang n-propanol etil asetat air (7 : 1 : 2) dan kertas yang digunakan Whatman no.3 d. Polisakarida Uji iodium

1 tetes larutan karbohidrat + 2 tetes larutan iodium

larutan coklat

10

IDENTIFIKASI KUANTITATIF I. Monosakarida Cara Baku

Totolkan larutan gula pada garis awal kertas dengan mikropipet . Lakukan triplo.

Keringkan dan kembangkan dengan salah satu pengembang baku gula.

Untuk deteksi, celupkan kertas kedalam pereaksi anilina hidrogen ftalat.

Keringkan dan panaskan selama 5 menit dengan suhu 1050C

Gunting bercak yang berwarna dan masingmasing di elusi dengan 3 ml etanol yang mengandung SnCl 1 %

Ukur serapannya pada panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer (glukosa 397 nm, ramnosa 375 nm)

Ambil harga pukul rata dari 3 pembacaan

Selanjutnya hasil dari sampel tersebut dikromatografi dengan larutan gula baku dalam berbagai konsentrasi yang diketahui, selain itu dibandingkan juga dengan blangko yang berisi hasil elusi bercak kosong

11

Digunting pada waktu yang bersamaan dari kromatogram

Diperoleh konsentrasinya

KCKT

Jaringan tumbuhan kering diekstraksi dengan air dan dibersihkan dengan prakolom penukar ion pelindung Aminex HPX-85 H

Pemisahan dilakukan pada kolom Aminex HPX-87

Elusi dengan air pada suhu 850C

II. Oligosakarida KCKT

KCKT dianggapmerupakancara yang lebihbaikuntukpenentuankuanti tatifoligosakrida

III. Alkohol Gula dan Siklitol

Belum ada penjelasan secara terperinci mengenai identifikasi secara kuantitatif untuk alkohol gula dan siklitol

12

IV. Polisakarida
Jaringan daun dipotong-potong, lalu dimasukkan kedalam alkohol mendidih, lalu masukkan kedalam pelumat Waring selama 5 menit

Ekstraksi dilakukan berulang hingga klorofil hilang Jika yang diekstraksikan merupakan dinding sel, ekstraksi dilakukan dengan cara yang sama. Selanjutnya serbuk diekstraksi berturut-turut dengan air panas,NaCl 1% panas, & ammonium oksalat panas untuk menghilangkan semua polisakarida yang larut. Akhirnya sisa yang taklarutdicucidandikeringkan

Sisa dapat dikumpulkan dengan menyaring/memusingkan diantara pengekstrakan

Hasil akhir harus berbentuk serbuk putih yang rapuh

Panaskan serbuk dalam H2SO4 1M pada 1000C selama 8-16 jam

Saring dan dinginkan

Filtrat dinetralkan dengan Ba(OH)2 atau BaCO3

Endapan BaSO4 dipisahkan dengan sentrifugasi

13

Tambahkan sedikit damar penukar asam dan basa kepada beningan untuk menghilangkan sesepora terakhir ion anorganik

Pekatkan larutan jernih dalam hampa udara hingga volumenya tinggal sedikit

Kromatografi sebagian cuplikan pekat pada kertas dengan 2 pengembang gula yang baku

Kromatografi pada waktu yang bersamaan sejumlah larutan pembanding baku yang konsentrasi gula-umumnya diketahui

Keringkan kertas, deteksi dengan anilina hidrogen ftalat dan perkirakan konsentrasi berbagai monosakarida yang dihasilkan pada skala 1-5

Bila dibutuhkan ketepatan lebih lanjut, bercak gula dapat dielusi dan konsentrasinya ditentukan dengan spektrofotometri

14

Daftar Pustaka
Harbone B.J. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB. Sumardjo, damin. 2009. Pengantar Kimia. Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioekstra. Jakarta : EGC.

15