KARYA ILMIAH

EKSPRESI PROTEIN CYCLIN D1 PADA MELANOMA MALIGNA DAN NEVUS MELANOSITIK

Lusiani Tjandra

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA !!"

C#$%in D1 &r'()in )*&r)ssi'n in Ma%i+nan( M)%an',a and M)%an'$#(i$ N)-i

Willy Sandhika*, Tulus Panuwun*, Lusiani Tjandra** *Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran ni!ersitas Airlangga **Departemen Farmasi Kedokteran Fakultas Kedokteran ni!ersitas Wijaya Kusuma Sura"aya A.s(ra/ #a$kground% &elanoma is the 'orm o' skin $an$er that has an aggressi!e "eha!ior and resistan$e to $on!entional therapy( These unusual "eha!iors re'le$ting its uni)ue $ar$inogenesis pro$ess whi$h in!ol!e se!eral mutations in $hromosomes and genome that regulate proli'eration and apoptoti$ pro$ess( The most $ommon mutated genes in malignant tumors $y$lin D*( The o"je$t o' this study is to determine play an important role in melanoma $ar$inogenesis o' the e+pression o' these genes( &ethods% "lo$k para''in o' melanoma patients 'rom Pathologi$ Department were $olle$ted 'rom the period o' ,uly -../ until ,une -..0( Fi!e $ases o' melano$yti$ ne!i were added as a $ontrol groups( The "lo$k then $ut "y mi$rotome, pla$ed on mi$ros$opi$ slides whi$h stained with mono$lonal anti"ody against $y$lin D* respe$ti!ely( 1esults% melanoma spe$imen show 0.2 $ases positi!e 'or $y$lin D*( The data then statisti$ally analy3ed &ann Whitney and the result shows that there were signi'i$an$e di''eren$e in e+pression o' $y$lin D* 4 p 5 .,.*6 7 p 8 .,.9 : in malignant melanoma $ompared with melano$yti$ ne!us( ;on$lusions% $y$lin D* play an important role in melanoma $ar$inogenesis suggesting that there was another tumor suppressor genes that was mutated in melanoma $ells( K)#0'rds1 ,a%i+nan( ,)%an',a2 $#$%in D13 PENDAHULUAN &elanoma maligna merupakan tumor ganas sel melanosit dengan pertum"uhan agresi' dan resisten terhadap terapi( Sel melanosit merupakan sel normal yang terdapat pada lapisan "asal epidermis kulit( Sel ini "er'ungsi untuk melindungi tu"uh dari paparan sinar matahari terutama sinar < yang dapat merusak komposisi D=A sel normal( Paparan sinar ultra!iolet # serta terjadinya mutasi gen yang "erperan dalam proli'erasi dan apoptosis sel, dapat meningkatkan pertum"uhan sel melanosit dan menghasilkan tumor, "aik tumor jinak yang dise"ut ne!us melanositik atau tumor ganas yang dikenal se"agai melanoma maligna( Sampai saat ini peran $y$lin D* pada melanoma maligna "elum dapat dijelaskan( &elanoma maligna merupakan tumor ganas kulit yang paling "anyak menim"ulkan kematian di Amerika Serikat dan >ropa 4 gurel, -..?:( Di Australia, insiden dan mortalitas masih terus meningkat( Di @ndonesia menurut data histopatologis,

kanker kulit merupakan kanker ketiga tersering dan melanoma maligna menye"a"kan *2 sampai -2 dari semua kematian aki"at kanker 4Aarahap, -... 7 Djuanda, *???:( Proses "erkem"angnya sel melanosit menjadi ne!us ataupun melanoma maligna terjadi melalui "anyak tahapan dan meli"atkan "anyak peru"ahan pada gen maupun kromosom( Penelitian dengan teknik ;omparati!e genomi$ Ay"ridi3ation pada melanoma telah mengidenti'ikasi "e"erapa peru"ahan kromosom "aik "erupa penam"ahan maupun pengurangan jumlah nukleotida pada melanoma maligna di"andingkan dengan sel melanosit maupun ne!us melanositik( Peru"ahan terse"ut meli"atkan mutasi "er"agai ma$am gen yang "erperan pada karsinogenesis melanoma maligna 4#astian, *??0:( Pola pertum"uhan melanoma yang agresi' dan resisten terhadap terapi kon!ensional "erkaitan dengan proses karsinogenesis tumor( Proses karsinogenesis melanoma meli"atkan mutasi "e"erapa gen yang "er'ungsi se"agai gen pengatur pertum"uhan sel 4$y$lin D*:( &utasi pada gen terse"ut akan menghasilkan pertum"uhan neoplastik sel melanosit "aik "erupa neoplasma jinak 4ne!us melanositik: maupun neoplasma ganas 4melanoma maligna:( Pemahaman karsinogenesis melanoma diperlukan untuk mengungkap perilaku "iologi tumor serta $ara untuk mengham"at pertum"uhan tumor( Walaupun sudah "anyak diiteliti tetapi karsinogenesis melanoma masih "elum dapat diungkap se$ara menyeluruh( ( Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ada peningkatan yang "ermakna dari ekspresi protein $y$lin D* pada melanoma maligna di"anding dengan ne!us melanositik( Aasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi panduan dalam terapi melanoma maligna( BAHAN DAN CARA KERJA A(Sampel penelitian Kasus melanoma dari * ,uli -../ sampai dengan 6* ,uli -..0 di @nstalasi Patologi Anatomi 1S Dr( Soetomo se"anyak -B kasus, yang memenuhi kriteria inkusi dan eksklusi penelitian se"anyak *. kasus dan 9 kasus ne!us melanositik se"agai pem"anding( 1an$angan penelitian ini adalah eksplanatori dan jenis penelitian adalah o"ser!asional analitik( #(Pemeriksaan @mmunohistokimia >kspresi protein $y$lin D* merupakan jumlah sel tumor dengan sitoplasma "erwarna merah 4pada pemeriksaan imunohistokimia: dan dihitung dari *.. sel tumor( Pada setiap kasus di"erikan skor "erdasarkan hasil penghitungan jumlah sel tumor yang mem"erikan reaksi positi' dan negati' terhadap anti"odi ;y$lin D dengan ketentuan 4#urnworth, -..B: % Skor . 5 inti sel tumor tidak terwarnai atau "erwarna 8 92 Skor C* 5 inti sel tumor terwarnai antara 9 D -. 2 Skor C- 5 inti sel tumor terwarnai antara -. D 9. 2 Skor C6 5 inti sel tumor terwarnai E 9. 2

HASIL DAN ANALISIS PENELITIAN Hasi% &),)ri/saan i,,un'4is('/i,ia s)% (u,'r #an+ ,)n+)/s&r)si/an &r'()in $#$%in D1 &ada ,)%an',a ,a%i+na dan n)-us ,)%an'si(i/3 Pemeriksaan jumlah sel tumor yang mengekspresikan protein $y$lin D* pada melanoma maligna dilakukan dengan teknik immunohistokimia #iotin Strepta!idin Ampli'ied( Satu sampel diamati dan dihitung jumlah sel tumor yang mengekspresikan protein $y$lin D* dengan menggunakan mikroskop $ahaya pem"esaran G..+( diamati pada seluruh lapang pandang dan dihitung jumlah sel tumor yang mem"erikan reaksi positi' dan negati' terhadap anti"odimonoklonal $y$lin D*( Aasil perhitungan kemudian dihitung persentase dan di"eri skor, hasil dapat dilihat pada gam"ar *

Ekspresi cyclin D1 pada Nevus dan Melanoma

6 4 2 0 Nevus Melanoma Negatif Positif 1 Positif 2 Positif 3

Fam"ar *% >kspresi $y$lin D* pada ne!us dan melanoma #erdasarkan gam"ar diatas dapat dilihat *. kasus melanoma maligna didapatkan 0 kasus dengan ekspresi $y$lin D* positi' dan - kasus negati' dengan rin$ian % Positi' -. I 9.2 4skor -: se"anyak % 9 kasus, Positi' J 9.2 4skor 6: % se"anyak %6 kasus( Sedangkan untuk kasus ne!us % tidak didapatkan kasus positi' 4semua negati':(

Fam"ar - % Fotomikroskopi &elanoma maligna dengan pewarnaan anti"odi anti $y$lin D* 7 G.. H Tampak kelompok sel tumor yang mem"erikan reaksi positi' dengan sitoplasma "erwarna merah

P)n+ujian &)nin+/a(an )/s&r)si &r'()in $#$%in D1 &ada ,)%an',a ,a%i+na di.andin+/an n)-us ,)%an'si(i/3 Dari hasil analisis statistika dengan mengunakan uji &ann Whitney didapatkan peningkatan yang "ermakna pada melanoma maligna di"andingkan dengan ne!us melanositik 4 p 5 .,.*6 7 p 8 .,.9 :( DISKUSI ,umlah kasus melanoma dari * ,uli -../ sampai dengan 6* ,uli -..0 di @nstalasi Patologi Anatomi 1S Dr( Soetomo se"anyak -B kasus( Dari -B kasus, *. kasus yang memenuhi kriteria inklusi dan digunakan dalam penelitian ini, sedangkan untuk ne!us melanositik diam"il 9 kasus se"agai pem"anding( Kriteria pemilihan kasus ne!us adalah proli'erasi sel yang mengandung pigmen melanin dan se$ara jelas menunjukkan perilaku jinak pada gam"aran histologi 4ne!us intradermal:( Sampel penelitian melanoma terdiri dari / orang penderita wanita dan 6 orang penderita pria dengan rentang usia antara -0 I 0. tahun( &enurut literatur melanoma maligna dapat menyerang semua umur dengan insiden paling "anyak pada usia di atas G. tahun, tanpa adanya predileksi jenis kelamin 4Aarahap, -...:( Lokasi melanoma yang sering ditemukan 4/ dari *. kasus: adalah melanoma pada daerah telapak kaki dan jari kaki 4a$ral melanoma:( &elanoma jenis ini 'aktor paparan sinar matahari kurang "erperan dalam proses terjadinya tumor, karena telapak kaki relati' terlindung dari sinar matahari( Dua kasus yang lain adalah penderita wanita dengan melanoma pada daerah perineum K !ul!a dan kulit a"domen yang juga terlindung dari sinar matahari, hanya satu penderita melanoma di kulit regio $ruris dimana paparan sinar matahari ikut "erperan pada proses karsinogenesis( Fam"aran mikroskopis penderita melanoma maligna di 1S Dr( Soetomo Sura"aya adalah semua kasus menunjukkan sel melanosit anaplastik yang menghasilkan pigmen dan tidak didapatkan kasus amelanotik melanoma( Derajad in!asi tumor semuanya tergolong Clark le!el 9 dengan kedalaman in!asi tumor menurut Breslow pada le!el G serta pertum"uhan tumor se$ara !ertikal 4 Vertical Growth Phase:( Tidak ditemukannya kasus melanoma tahap awal dise"a"kan oleh kurangnya pengetahuan tenaga medis dan masyarakat akan gejala melanoma se$ara dini( Fejala melanoma awal serupa dengan lesi kulit lain yang "erpigmen seperti ne!us melanositik, ne!us "iru 4blue nevus: serta pigmented basal cell carcinoma sedangkan melanoma amelanotik dapat mem"erikan gejala yang serupa dengan pyogenic granuloma, hemangioma atau basal cell carcinoma 4Paek, -..0:( Ditemukannya kasus melanoma pada stadium lanjut dise"a"kan oleh jenis pertum"uhan melanoma yang termasuk pola pertum"uhan !ertikal 4 Vertical Growth Phase: sehingga tumor dapat melakukan in!asi pada struktur kulit "agian "awah dalam waktu singkat, tanpa atau "elum melakukan penye"aran se$ara horisontal( Aal ini "er"eda dengan kasus yang ditemukan di negara "arat dimana se"agian "esar "erupa melanoma dengan penye"aran super'isial 4Superficial Spreading Melanoma: yang menunjukkan pola penye"aran se$ara horisontal( #erkem"angnya sel melanosit menjadi ne!us melanositik dan melanoma maligna yang tum"uh se$ara !ertikal melalui "e"erapa tahapan( &utasi paling awal ditemukan pada gen =1AS dan #1AF yang tergolong dalam jalur &AP kinase( &utasi ini

menye"a"kan sel melanosit "erproli'erasi dan mem"entuk ne!us melanositik( Proli'erasi sel ne!us "ersi'at ter"atas dimana pada suatu titik tertentu akan "erhenti karena sel mengalami senescence( Proses senescence dipengaruhi oleh gen p*B@=KGa yang merupakan tumor supresor gen, yang "erperan dalam jalur gen retino"lastoma 41":( Tahap "erikut dalam terjadinya melanoma adalah Nevus displastik yang memiliki kemampuan menghindar dari proses senes$en$e( Proses terjadinya nevus displatik meli"atkan mutasi pada gen p*B@=KGa dan ;DKG yang "erperan dalam jalur 1"( Kedua gen ini dikenal se"agai gen susceptibilitas melanoma( Akti!asi telomerase pada nevus displastik menghasilkan peru"ahan menjadi melanoma dengan pertum"uhan radial K horisontal yang menghasilkan sel melanosit imortal 4dapat "erproli'erasi terus tanpa mengalami proses senes$en$e: akan tetapi pertum"uhan sel tumor masih "ergantung pada sel keratinosit di sekitarnya( Tahap akhir dari progresi melanoma adalah melanoma dengan pola pertum"uhan !ertikal yang "ersi'at in!asi' dan tidak "ergantung pada keratinosit( Proses ini meli"atkan mutasi pada jalur pengham"at apoptosis( 4Aa Linan, -..07 #ennet ; Dorothy -..6:( E/s&r)si &r'()in $#$%in D1 &ada ,)%an',a ,a%i+na &elanoma maligna kulit dapat terjadi di semua tempat, pada lokasi yang terpapar oleh sinar matahari maupun lokasi yang tertutup( Distri"usi anatomis melanoma kulit dipengaruhi oleh !ariasi etnis 4Pathak, *?0-:( 1as kaukasia dengan warna kulit terang, melanoma didapatkan pada tu"uh dan ekstremitas yang "erhu"ungan dengan paparan sinar matahari 4>lwood, *??0:( Tipe histologis yang paling "anyak adalah melanoma dengan penye"aran super'isial( Se"aliknya pada ras nonDkaukasian insiden melanoma sangat rendah dan se"agian melanoma tim"ul pada tempat yang terlindung dari sinar matahari seperti telapak kaki dan telapak tangan yang tergolong se"agai a$ral melanoma dengan tipe histologis "erupa nodular melanoma 4@shihara, -..*:( Proses perkem"angan awal melanoma meli"atkan jalur &AP kinase, dimana gen yang sering mengalami mutasi adalah =1AS dan #1AF( &utasi kedua gen ini ternyata sedikit ditemukan pada a$ral melanoma( Pada a$ral melanoma peru"ahan gen yang didapatkan adalah ampli'ikasi gen $y$lin D* yang merupakan efektor downstream dari jalur &APK 4Takata, -..9:( Ampli'ikasi gen $y$lin D* didapatkan pada 9.2 kasus a$ral melanoma 4Sauter, -..-:( Pada penelitian ini didapatkan ekspresi protein $y$lin D* pada 0 dari *. kasus melanoma 40.2: sedangkan untuk ne!us melanositik tidak didapatkan satu sampel dengan ekspresi $y$lin D* yang positi'( Deteksi ekspresi protein $y$lin D* pada melanoma maligna menggunakan teknik imunohistokimia dilaporkan oleh #urnwoth yang telah mendapatkan hasil positi' pada -9 dari 6* kasus melanoma maligna 40.,B92: 4#urnwoth, -..B:, tidak "er"eda jauh dengan hasil yang didapatkan pada penelitian ini( Aal ini menunjukkan "ahwa $y$lin D* merupakan gen yang "anyak mengalami mutasi pada a$ral melanoma( Penelitian Takata juga menunjukkan "ahwa pada a$ral melanoma terjadi akti!asi jalur &AP kinase tanpa mutasi =1AS maupun #1AF(seperti yang terjadi pada melanoma u!ea( Penelitian dengan menggunakan tehnik hi"ridisasi genomik komparati' menunjukkan "ahwa se"agian "esar a$ral melanoma menunjukkan ampli'ikasi pada kromsom **)*6 yang sesuai dengan gen $y$lin D* 4#astian, -...:( Analisis statistik menunjukkan peningkatan yang "ermakna ekspresi protein $y$lin D* pada melanoma di"andingkan dengan ne!us 4p 5 .,.*6 7 p 8 .,.9 :( Ste'anaki

mendapatkan peningkatan "ermakna dari ekspresi "er"agai gen yang meliputi $y$lin D*, KiDB/, p96, p-* dan 1" pada melanoma di"andingkan dengan ne!us melanositik( Peningkatan ekspresi $y$lin D* memi$u terjadinya siklus sel, progresi tumor serta menurunkan sur!i!al pada penderita melanoma( &enurut penelitian #a$hmann -..9, ekspresi ;y$lin D* "anyak didapatkan pada a$ral melanoma yang memiliki pertum"uhan !ertikal dan ter"ukti memiliki hu"ungan yang kuat dengan jalur 1" dan p*B( Aal ini menunjukkan "ahwa jalur p*BD1" memainkan peran penting dalam progresi tumor pada melanoma pertum"uhan !ertikal di"andingkan dengan mutasi p96 4#a$hmann -..9:( ;urtin -..9 menunjukkan peru"ahan genetik yang "er"eda pada G kelompok melanoma yang terdiri dari % melanoma kulit dengan kerusakan kronis oleh sinar matahari, melanoma kulit tanpa kerusakan kronis oleh sinar matahari, melanoma kulit dari telapak tangan dan kaki yang tidak terpapar oleh sinar matahari 4a$ral melanoma: serta melanoma pada mukosa( Aasil penelitian menunjukkan "ahwa didapatkan peru"ahan genetik yang "er"eda pada "er"agai kelompok melanoma dengan gen ;DKG dan $y$lin D* se"agai onkogen independen tanpa adanya mutasi dari gen =1AS atau #1AF 4;urtin, -..9:( PENUTUP Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan "ahwa didapatkan peningkatan yang "ermakna ekspresi protein $y$lin D* pada melanoma maligna di"anding dengan ne!us melanositik yang menunjukkan "ahwa $y$lin D* sangat "erperan pada karsinogenesis melanoma( Da5(ar Pus(a/a #a$hmann @&, -..9( &elanoma % 1ole o' $ell $y$le regulator alterations in nodular melanomas determined ( Li'e S$ien$e Weekly -- % *.GBD*.9?( #astian ; #oris, Le#oit > Phillip, Aamm Aenning, #ro$ker >!aD#ettina and Pinkel Dan, *??0( ;hromosomal Fains and Losses in Primary ;utaneous &elanomas Dete$ted "y ;omparati!e Fenomi$ Ay"ridi3ation( ;an$er 1esear$h 90 % -*/.D -*/9( #ennett ; Dorothy, -..6( Auman melano$yte senes$en$e and melanoma sus$epti"ility genes, Ln$ogene --% 6.B6D6.B?( #urnworth #, Popp S, Stark AD,, Steinkraus <, #ro$ker >#, -..B( Fain o' **)K $y$lin D* o!ere+pression is an essential early step in skin $an$er de!elopment and $auses a"normal tissue organi3ation and di''erentiation( Ln$ogene -9(@ss6- % G6??DGG*-( ;urtin ,(A, Fridlyand ,, Kageshita, -..9( Distin$t sets o' geneti$ alterations in melanoma( = >ngl , &ed 696 4-.:% -*69D-*G/( Djarwanto, -../ % Statistik =onparametrik >disi G, Mogyakarta( 6.D69, /9D0.( Djuanda Adhi, Aam3ah &o$htar, Aisah Siti, *??? % @lmu Penyakit Kulit dan kelamin >disi 6, Fakultas Kedokteran ni!ersitas @ndonesia, ,akarta( --*D--6( >lwood ,(&, Fallagher 1(P,*??0, #ody site distri"ution o' $utaneous malignant melanoma in relationship to patterns o' sun e+posure, @nt , ;an$er /0% -/BD-0.

>wanowi$h ;, #rynes K1, &ederiors L,, -..*( ;y$lin D* e+pression in dysplasti$ ne!i % An immunohisto$hemi$al study( Ar$hi!es o' Pathology N La" &ed *-9( @ss(- % -.0 I-*.( Feorgie!a ,, Sinha P, S$hadendor' D, -..*( >+pression o' $y$lins and $y$lin dependent kinases in human "enign and malingnant melano$yti$ lesions( , ;lin Path 9G, @ss( 6 % --? I -69( Foldstein, #eth F, -..*,Pra$ti$al Dermatology, &os"yDMear #ook, *GBD*9G( Aa Linan, &erlino Flenn, and S!iderskaya < >lena, -..0( &elanomagenesis % L!er$oming the #arrier o' &elano$yte Senes$en$e, ;ell ;y$le, ,uli @7 /4*6:7 *?GGD*?G0( Aarahap &, -...( @lmu Penyakit Kulit, Aipokrates( ,akarta, --0D-69 @shihara K, Saida T, Mamamoto A, -..*, pdated statisti$al data 'or malignant melanoma in ,apan( @nt , ;lin Ln$ol B % *.?D**B( Key &ar$, -..B( @mmunohisto$hemi$al Straining &ethods, Fourth >dition, DAKL, * I -6, G/ I 96( Kumar <, A""as AK, Fauston =, -..9( 1o""ins and ;otran % Pathologi$ #asis o' Disease, /th ed( Philadelphia% W(#( Saunders, -B?D6G-7(*--/D*-/*( Paek S;, So"er A,, Tsao A, -..0, ;utaneous melanoma in % Freed"erg @&, >isen AO, Wol'' K editor, Fit3patri$ks Dermatologyin general medi$ine /th ed =ew Mork% &$ Frow Aill, p **6GD**9/( Panka , Da!id, Atkins # &i$hael and &ier W ,ames, -..B% Targeting the &itogenD A$ti!ated Protein Kinase Pathway in the Treatment o' malignant &elanoma, ;lin ;an$er 1es7 *-4/ Suppl:April *,-..B%p -6/*sD-6/9s( Pathak D(1, Samet ,(&, Aoword ;(A, Key ;(1, *?0-,&alignant &elanoma o' the skin in =ew &e+i$o *?B?D*?//( ;an$er 9.7 *GG.D*GGB( 1osai @, -..G( 1osai and A$kermanPs% Surgi$al Pathology, ? th ed St louis, &issouri% &os"y, p *9GD*/B( Sauter >1, Takemoto 1, Litwin S, Aerlyn &, -..-( p96 alone or in $om"ination with antisense $y$lin D* indu$es apoptosis and redu$es tumor si3e in human melanoma( ;an$er Fene Therapy ?% 0./ I0*-( Senderowi$3 & Adrian, -..6( =o!el dire$t and indire$t $y$linDdependent kinase modulators 'or the pre!ention and treatment o' human neoplasms( ;an$er ;hemother Pharma$ol 9- 4Suppl *:7 SB*DS/6( Ste'anaki, -..0, F* $ell $y$le regulators in $ongenital melano$yti$ ne!i( ;omparison with a$)uired ne!i and melanoma(,ournal o' ;utaneous Pathology694?:% /??D0.0( Takata &inoru, Foto Masu'umi, @$hii =ami, Mamaura &aki, &urata Airoshi, Koga Airoshi, Fujimoto Akihide, and Saida Toshiaki, -..9( ;onstituti!e A$ti!ation o' the &itogenDA$ti!ated Protein Kinase Signaling Pathway in A$ralmelanomas, , @n!est!Dermatol *-9% 6*0D6--( Takata &, Saida T, -..9( >arly $an$ers o' the skin % $lini$al, histopathologi$al, and mole$ular $hara$teristi$s( @nt , ;lin Ln$ol *. % 6?* I 6?/( gurel Selma, tikal ,o$hen, and #e$ker ; ,urgen, -..?( Tumor #iomarkers in &elanoma, ;an$er ;ontrol ,uli, *B 46:, -*? I --G(