PROPOSAL PENELITIAN ENZIMOLOGI UJI KEBERADAAN ENZIM AMILASE

DARI CAIRAN RUMEN SAPI ASAL RUMAH PEMOTONGAN

Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Enzimologi
Oleh :
1. Abdul Rosyid Al Muhammady (4411411025)
2. Nihayatul Milah Usrotuk (4411411032)
3. Novita Hermayani (4411411008)
4. Nunung Eni Elawati (4411411002)





JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2013

A. JUDUL
UJI KEBERADAAN ENZIM AMILASE PADA CAIRAN RUMEN SAPI

B. LATAR BELAKANG MASALAH
Isi rumen sapi yang berasal dari limbah rumah potong hewan (RPH) cukup
melimpah. Jika tidak ditangani dengan baik limbah ini berpotensi mencemari
lingkungan. Limbah rumen ini di sisi lain berpotensi sebagai sumber enzim yang dapat
menggantikan sebagian enzim komersial. Selama ini isi rumen hanya dibuang percuma
dan tidak dimanfaatkan, hanya sebagian kecil saja yang memanfaatkannya sebagai
kompos. Berdasarkan data Statistik Peternakan (2007), jumlah sapi yang dipotong setiap
tahun tidak kurang dari 1,75 juta ekor, sekitar 1,5 juta ekor berasal dari sapi-sapi lokal,
dan sisanya adalah sapi-sapi impor. Jumlah cairan rumen mencapai 31 liter per ekor
(Priego et al., 1977). Berdasarkan sapi-sapi yang dipotong tersebut potensi cairan rumen
sapi mencapai 54,25 juta liter per tahun. Beberapa peneliti melaporkan bahwa cairan
rumen sapi hidup kaya akan selulase, amilase, protease, xilanase dan lain-lain (Lee et al.,
2002; Morgavi et al., 2000). Lee et al. (2002) melaporkan cairan rumen sapi hidup yang
diberi makan ransum berbasis hay alfalfa mengandung selulase sebesar 362,712,8
IU/ml, xilanase sebesar 528,629,03 IU/ml, amilase sebesar 439,016,53 IU/ml, dan
protease sebesar 84,82,52 IU/ml. Aktivitas enzimenzim tersebut cukup tinggi. Berbeda
dengan sapi hidup, sapi yang akan dipotong umumnya dipasakan sehingga jumlah dan
kualitas enzim yang dihasilkan akan berbeda. Berkaitan dengan hal ini, dalam rangka
memanfaatkan cairan rumen sapi asal RPH sebagai sumber enzim amylase.

C. RUMUSAN MASALAH
Apakah enzim amylase terdapat pada cairan rumen sapi?

D. TUJUAN PENELITIAN
Mengetahui keberadaan enzim amilase pada cairan rumen sapi RPH dan menguji
kandungan enzim amilase

E. KERANGKA TEORITIK DAN HIPOTESIS
1. KERANGKA TEORITIK
Enzim adalah sekelompok protein yang berperan sebagai pengkatalis dalam
reaksi-reaksi biologis. Enzim dapat juga didefenisikan sebagai biokatalisator yang
dihasilkan oleh jaringan yang berfungsi meningkatkan laju reaksi dalam jaringan itu
sendiri. Semua enzim yang diketahui hingga kini hampir seluruhnya adalah protein.
Berat molekul enzim pun sangat beraneka ragam, meliputi rentang yang sangat luas
(Suhtanry & Rubianty, 1985).
Enzim digolongkan menurut reaksi yang diikutinya, sedangkan masingmasing
enzim diberi nama menurut nama substratnya, misalnya urease, arginase dan lain-
lain. Di samping itu ada pula beberapa enzim yang dikenal dengan nama lama
misalnya pepsin, tripsin dan lain-lain. Oleh Commision on Enzymes of the
International Union of Biochemistry, enzim dibagi dalam enam golongan besar.
Penggolongan ini didasarkan atas reaksi kimia di mana enzim memegang peranan.
Enam golongan tersebut ialah (Poedjiadi, 2006):
Oksidoreduktase
Transferase
Hidrolase
Liase
Isomerase
Ligase
Dalam mempelajari mengenai enzim, dikenal beberapa istilah diantaranya
holoenzim, apoenzim, kofaktor, gugus prostetik, koenzim, dan substrat. Apoenzim
adalah suatu enzim yang seluruhnya terdiri dari protein, sedangkan holoenzim dalah
enzim yang mengandung gugus protein dan gugus non protein. Gugus yang bukan
protein tadi dikenal dengan istilah kofaktor. Pada kofaktor ada yang terikat kuat pada
protein dan sukar terurai dalam larutan yang disebut gugus prostetik dan adapula
yang tidak terikat kuat pada protein sehingga mudah terurai yang disebut koenzim.
Baik gugus prostetik maupun koenzim, keduanya merupakan bagian yang
memungkinkan enzim bekerja pada substrat. Substrat merupakan zat-zat yang diubah
atau direaksikan oleh enzim (Poedjadi, 2006).
Enzim meningkatkan laju sehingga terbentuk kesetimbangan kimia antara
produk dan pereaksi. Pada keadaaan kesetimbangan, istilah pereaksi dan produk
tidaklah pasti dan bergantung pada pandangan kita. Dalam keadaan fisiologi yang
normal, suatu enzim tidak mempengaruhi jumlah produk dan pereaksi
yangsebenarnya dicapai tanpa kehadiran enzim. Jadi, jika keadaan kesetimbangan
idak menguntungkan bagi pembentukan senyawa, enzim tidak dapat mengubahnya
(Salisbury, 1995).
Sebagai mana protein pada umumnya, molekul enzim juga mempunyai struktur
tiga dimensi. Diantaranya jenis-jenis struktur tersebut, hanya satu saja yang
mendukung fungsi enzim sebagai biokatalisator, diantaranya jenis-jenis struktur
tersebut, diperlukan suhu dan pH yang sesuai. Apabila kedua faktor tersebut tidak
terpenuhi, enzim akan kehilangan sifat dan kemampuannya (Sadikin, 2002).
Secara dingkat, sifat-sifat enzim tersebut antara lain (Dwidjoseputro, 1992) :
o berfungsi sebagi biokatalisator
o merupakan suatu protein
o bersifat khusus atau spesifik
o merupakan suatu koloid
o jumlah yang dibutuhkan tidak terlalu banyak
o tidak tahan panas
Fungsi enzim sebagai katalis untuk reaksi kimia dapat terjadi baik didalam
maupun diluar sel. Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat tertentu.
Suatu enzim dapat bekerja 108 sampai 1011 kali lebih cepat dibandingkan laju reaksi
tanpa katalis. Enzim bekerja sebagai katalis dengan cara menurunkan energi aktifasi,
sehingga laju reaksi meningkat (Poedjadi, 2006).
Enzim-enzim hingga kini diketahui berupoa molekul-molekul besar yang berat
molekulnya ribuan. Karena enzim tersebut dilarutkandalam air, maka akan menjadi
suatu koloid Beberapa enzim, diketahui memiliki kemampuan untuk mengubah
substrat menjadi hasil akhir dan sebaliknya, yaitu mengubah kembali hasil akhir
menjadi substrat jika kondisi lingkungan berubah. Contohnya adalah enzim-enzim
dari golongan protease dan urase serta beberapa jenis enzim lainnya (Dwidjoseputro,
1992).
Suatu enzim hanya dapat bekerja spesifik pada suatu substrat untuk suatu
perubahan tertentu. Misalnya, sukrase akan menguraikan rafinosa menjadi melibiosa
dan fruktosa, sedangkan oleh emulsin, rafinosa tersebut akan terurai menjadi sukrosa
dan galaktosa (Salisbury, 1995).
Seperti halnya katalisator, enzim juga dipengaruhi oleh temperatur. Hanya saja
enzim ini tidak tahan panas seperti katalisator lainnya. Kebanyakan enzim akan
menjadi non aktif pada suhu 50
o
C (Poedjiadi, 2006).

2. HIPOTESIS
Terdapat kandungan enzim amylase pada cairan rumen sapi

F. TI NJAUAN PUSTAKA
Rumen sapi merupakan organ pencernaan yang berfungsi sebagai tempat
penampungan sementara makanan dalam jumlah banyak (Kamra, 2005). Isi rumen
sapi berisi padatan yang berasal dari bahan yang dimakan, dan cairan yang berisi
mikroba rumen, enzim-enzim dan zat-zat makanan hasil perombakan mikroba rumen
dan enzim, seta vitamin-vitamin dan mineral-mineral yag larut dalam cairan rumen.
Enzim memainkan peranan dalam proses pencernaan yang kompleks dari makanan.
Enzim-enzim disekresikan oleh mikroba-mikroba dalam cairan rumen untuk
mendegradasi partikel makanan (Kamra, 2005).
Enzim adalah sekelompok protein yang berperan sebagai pengkatalis dalam
reaksi-reaksi biologis. Enzim dapat juga didefenisikan sebagai biokatalisator yang
dihasilkan oleh jaringan yang berfungsi meningkatkan laju reaksi dalam jaringan itu
sendiri. Semua enzim yang diketahui hingga kini hampir seluruhnya adalah protein.
Berat molekul enzim pun sangat beraneka ragam, meliputi rentang yang sangat luas
(Suhtanry & Rubianty, 1985).
Fungsi enzim sebagai katalis untuk reaksi kimia dapat terjadi baik didalam
maupun diluar sel. Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat tertentu.
Suatu enzim dapat bekerja 10
8
sampai 10
11
kali lebih cepat dibandingkan laju reaksi
tanpa katalis. Enzim bekerja sebagai katalis dengan cara menurunkan energi aktifasi,
sehingga laju reaksi meningkat (Poedjadi, 2006).
Suatu enzim hanya dapat bekerja spesifik pada suatu substrat untuk suatu
perubahan tertentu. Misalnya, amilase akan menguraikan maltosa menjadi glukosa
dan glukosa.
Enzim amilase dapat memecah ikatan pada amilum hingga terbentuk maltosa.
Ada tiga macam enzim amilase, yaitu a amilase, amilase dan amilase. Yang
terdapat dalam saliva (ludah) dan pankreas adalah a amilase. Enzim ini memecah
ikatan 1-4 yang terdapat dalam amilum dan disebut endo amilase sebab enzim ini
memecah bagian dalam atau bagian tengah molekul amilum (Poedjiadi, 2006).
Enzim amylase yang berfungsi untuk mengubah karbohidrat menjadi gula
sederhana. Enzim amylase juga berfungsi untuk mengubah tepung menjadi gula.
Secara umum enzim memiliki sifat :
*bekerja pada substrat tertentu
*memerlukan suhu tertentu
*keasaman (pH) tertentu pula
Suatu enzim tidak dapat bekerja pada substrat lain. Molekul enzim juga akan
rusak oleh suhu yang terlalu rendah atau terlalu tinggi. Demikian pula enzim yang
bekerja pada keadaan asam tidak akan bekerja pada suasana basa dan sebaliknya.
pada suhu tinggi aktivitasnya tinggi tetapi kemantapan enzyme rendah. Suhu yang
yang membuat aktivitas dan kemantaban suatu enzyme tinggi maka disebut suhu
optimum.Jumlah hasil reaksi juga akan mempengaruhi aktivitas enzim.
Telah disebutkan beberapa factor yang mempengaruhi aktivitas enzim salah
satunya suhu dan pH. Sehubungan dengan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim,
maka semakin meningkat suhu, aktivitas enzim akan semakin meningkat. Pada
pemanasan tinggi enzim yang merupakan suatu protein akan mengalami denaturasi
protein sehingga aktivitas kerjanya menjadi nol. Pada umumnya reaksi kima dengan
naiknya suhu 10 derajat Celcius maka akan meningkatkan kecepatan reaksi sebesar 2
kali. Hal ini akan berlaku pada enzyme dengan suhu maksimum hingga 35 derajat
Celcius. Jika lebih dari suhu tersebut enzim akan mengalami denaturasi sehingga
merusak fungsi katalisatonya. Umumnya enzim mulai kehilangan sifat katalisatornya
pada suhu 35 derajat Celcius dan berakhir pada suhu 60 derajat Celcius.
Oleh sebab itu perlu diketahui nilai suhu dan pH optimum dari enzim amylase
yang ada pada air liur. Agar diketahui seberapa besar efek hidrolisis maka diperlukan
blanko sebagai pembanding. Blanko ini berisi seperti tabung pengujian yang
membedakan hanyalah penambahan air liur. Amilum akan membentuk kompleks
dengan Iodium hingga menghasilkan larutan berwarna biru. Warna ini dapat di pakai
dalam pengukuran absorbansi yang sebanding dengan kosentrasi amilum. Semakin
besar nilai absorbsinya maka semakin besar kosentrasi amilum yang belum
terhidrolisis.Untuk mengetahui besarnya hasil hidrolisis maka nilai A uji dikurangi
dengan nilai Ablanko sehingga di peroleh A yang artinya semakin besar nilai A maka
semakin besar pula amilum yang telah terhidrolisis. Sehingga jika di buatkan sebuah
kurva hubungan antara suhu dan pH ,akan diperoleh nilai pH dan suhu optimum yang
dipakai oleh enzyme.
Amylase Pencernaan makanan secara kimiawi terjadi dengan bantuan zat
kimia tertentu. Enzim pencernaan merupakan zat kimia yang berfungsi memecahkan
molekul bahan makanan yang kompleks dan besar menjadi molekul yang lebih
sederhana dan kecil. Molekul yang sederhana ini memungkinkan darah dan cairan
getah bening (limfe) mengangkut ke seluruh sel yang membutuhkan.
Penelitian ini menggunakan amonium sulfat sebagai reagennya. Penggunaan
amonium sulfat [(NH4)2SO] sebagai salting out karena garam ini dapat berfungsi
merusak mantel air yang terdapat di sekitar enzim (protein) sehingga protein akan
membentuk koagulan. Menurut Darwis dan Sukara (1990) amonium sulfat memiliki
tingkat kelarutan di dalam air yang sangat tinggi, tidak mengandung zat-zat yang
toksik terhadap kebanyakan enzim, harganya relatif murah, dan jika digunakan dalam
jumlah banyak dapat bertindak sebagai stabilisator enzim itu sendiri, sehingga cocok
digunakan dalam proses salting out.




G. METODE PENELITIAN
1. Waktu dan tempat
Penelitian akan dilaksanakan di Laboratoium Biokimia Jurusan Biologi FMIPA Unnes, hari Rabu
tanggal 4 Desember 2013
2. Alat dan bahan
Cairan rumen sapi dari Rumah Potong Hewan (RPH)
Termos es
Saringan dari Kain katun
Frezer/refrigerator
Sentrifuge
Magnetic stirer
Ph meter
Termometer
Air destilat
Amonium sulfat 60%
Buffer fosfat pH 7
Larutan pati

3. Cara Kerja
Tahap persiapan
1. Mengambil cairan rumen sapi dari Rumah Pemotongan Hewan di Semarang
2. Menyaring rumen menggunakan kain katun sebanyak 4 lapis
3. Mensentrifugasi cairan rumen yang telah disaring dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4C
4. Memisahkan supernatan dengan pellet dan memindahkan supernatan ke tube lain
menggunakan mikropipet
5. Supernatan merupakan enzim kasar amylase
Tahap Pengendapan Enzim
1. Mereaksikan supernatan dengan ammonium sulfat pada konsentrasi 60%
2. Mengaduk larutan dengan magnetic stirer selama 1 jam dan mendiamkan semalam
pada suhu 4C
3. Mensentrifugasi supernatan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada
suhu 4 C
4. Mengambil endapan yang diperoleh dan melarutkan dalam buffer phosphate
(konsentrasi 0,05 M) pH 7 dengan perbandingan 10:1

Pengujian Metode Lugol
1. memberika larutan pati yang sudah dicampur enzim pada plat tetes,
2. meneteskan 2 tetes lugol
3. mengulangi sampai warna menjadi bening

Pengujian Metode Benedict
1. mencampurkan 2 ml larutan pati yang sudah dicampur enzim dengan larutan
benedict 2 ml
2. memanaskan sampai ada perubahan warna

Pengujian Metode Osazon
1. Memasukkan 2 ml larutan kedalam tabung reaksi
2. Menambahkan seujung fenilhidrazin-hidroklorida dan Kristal natrium asetat
3. Memanaskan ke dalam penangas air mendidih selama beberapa menit (30 menit)
4. Mendinginkan perlahan-lahan di bawah air keran
5. Mengamati bentuk Kristal dan mengidentifikasi di bawah mikroskop


H. Hasil dan Pembahasan
Tabel Hasil Pengamatan
Hasil Pengamatan
Data Hasil Uji Lugol
no Waktu () Hasil
1 0 (kontrol) +++++
2 5 ++++
3 10 ++++
4 15 +++
5 20 +++
6 25 +++
7 30 ++
8 35 ++
9 40 ++
10 45 +

Hasil Uji Benedict
Keterangan :
A = kontrol
B = Perlakuan



Hasil Uji Osazon
Terlihat kristal galactosa yang seperti jarum
berpendar



Pembahasan
Pada percobaan ini isolasi enzim amilase dilakukan dengan sentrifuge yang
bertujuan untuk memisahkan dinding sel dengan protein terlarut termasuk enzim, kemudian
diambil supernatannya dan ditambah amonium sulfat, penambahan amonium sulfat 60%
berfungsi untuk mengekstrak enzim enzim rumen sapi dengan mengendapkan enzim
enzim dari supernatan CRS. Saat amonium sulfat dalam jumlah banyak ditambahkan pada
larutan protein, ion-ion garam amonium sulfat menarik molekul air menjauh dari protein. Hal
itu dikarenakan ion pada garam ammonium sulfat memiliki muatan berat jenis lebih besar
dibanding protein, sehingga ketika ammonium ditambahkan dan berikatan dengan molekul
air, memaksa molekul protein berinteraksi dan mengendapkan molekul ion kecil. Sehingga,
ketika penambahan ammonium dalam jumlah cukup, dan kemudian disentrifuge lagi
menyebabkan protein terpresipitasi. Setelah didapatkan pellet dari sentrifuge maka
supernatan dibuang dan ditambah buffer fosfat sebagai larutan penyangga dengan
perbandingan 1:1. Selanjutnya di uji dengan 3 pengujian yaitu uji lugol, uji benedict dan uji
osazon.
a. Uji Iodin/Lugol

Untuk mengidentifikasi adanya kandungan amilum pada sampel dapat
digunakan beberapa pereaksi. Pereaksi tersebut salah satunya adalah larutan iodin. Pada
praktikum kali ini menggunakan sampel CRS yang telah di ambil supernatannya. Hasil
dari reaksi antara CRS dan larutan iodin menghasilkan warna biru kehitaman sampai
warna yang sama dengan lugol. Hal ini menunjukkan bahwa enzim amilase di dalam
sampel bekerja mengkatalisis perubahan amilum menjadi gula pereduksi. Ketika sampel
sudah tidak memperlihatkan perubahan warna hal ini menandakan bahwa semua amilum
telah diubah menjadi gula pereduksi yaitu pada menit ke 45, sehingga ketika ditetesi
iodin tidak ada perubahan lagi karena di dalam larutan sudah tidak ada amilum dan iodin
adalah indikator adanya amilum.

b. Uji Benedict

Pada praktikum kali ini telah didapatkan hasil, yaitu pada tabung kontrol tidak
ada perubahan warna yaitu tetap putih keruh, sedangkan pada tabung perlakuan terjadi
perubahan warna dari hijau ke coklatan menjadi terdapat endapan biru kehijauan. Hal ini
menunjukkan bahwa di dalam CRS terdapat enzim amilase yang mengubah amilum
menjadi gula pereduksi seperti glukosa, laktosa, dan maltosa. Hal ini glukosa mampu
mereduksi senyawa pengoksidasi, dimana ujung pereduksinya adalah ujung yang
mengandung aldehida. Sedangkan pada laktosa yang menghasilkan D-glukosa dan D-
galaktosa dimana laktosa memiliki gugus karbonil yang berpotensi bebas pada residu
glukosa, sehingga laktosa adalah disakarida pereduksi.
Menurut literatur, Pada uji benedict, teori yang mendasarinya adalah gula yang
mengandung gugus aldehida atau keton bebas akan mereduksi ion Cu
2+
dalam suasana
alkalis, menjadi Cu+, yang mengendap sebagai Cu
2
O (kupro oksida) berwarna merah
bata. Uji ini dilakukan untuk membuktikan adanya gula pereduksi. Larutan uji
dicampurkan dengan pereaksi Benedict kemudian dipanaskan. Hasil positif ditunjukkan
dengan terbentuknya endapan berwarna biru kehijauan, merah, atau kuning tergantung
kadar gula pereduksi yang ada. Sedangkan warna yang didapatkan dari percobaan kali ini
adalah warna endapan biru kehijauan yang artinya .terdapat sedikit gula pereduksi.

c. Uji Osazon

Menurut literatur Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan
karbohidrat yang memiliki gugus aldehida atau keton bersama fenilhidrazin berlebihan
akan membentuk hidrazon atao osazon. Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk
kristal dan titik lebur yang spesifik. Pada reaksi antara glukosa dengan fenilhidrazin,
mula - mula terbentuk D-glukosafenilhidrazon, kemudian reaksi berlanjut hingga
terbentuk D-glukosazon. Glukosa, fruktosa dan manosa dengan fenilhidrazin
menghasilkan osazon yang sama. Dari ketiga struktur monosakarida tersebut tampak
bahwa posisi gugus -OH dan atom H pada atom karbon nomor 3, 4 dan 5 sama. Dengan
demikian osazon yang terbentuk mempunyai struktur yang sama.
Pada hasil yang diperoleh, dapat kita ketahui bahwa amilase pada CRS
mengkatalisis pemecahan amilum menjadi gula pereduksi sampai pada disakarida yaitu
galaktosa. Karena kristal yang terbentuk mencirikan kristal dari galaktosa.




DAFTAR PUSTAKA

Kamra, D. N. 2005. Special section microbial diversity: Rumen microbial
ecosystem. Curr. Sci. 89: 124 - 135.
Lee, S. S., J. K. Ha, & K. J. Cheng. 2000. Relative contributions of bacteria,
protozoa and fungi to in vitro degradation of orchard grass cell walls
and their interactions. Appl. Environ. Microbiol. 6: 3807-3813.
Lee, S. S., C. H. Kim, J. K. Ha, Y. H.Moon, N. J. Choi, & K. J. Cheng. 2002.
Distribution and activities of hydrolytic enzymes in the rumen
compartemens of Hereford bulls fed alfalfa based diet. Asian-Australas.
J. Anim. Sci. 15: 1725-1731.
Poedjiadi, Anna, 2006. Dasar-dasar Biokimia, Universitas Indonesia PRESS,
Jakarta.
Priego, A., A. Wilson, & T. M. Sutherland. 1977. The e ect on parameters of
rumen fermentation, rumen volume and uid rate of zebu bulls given
chopped sugar cane supplemented with rice polishings or cassava root
meal. Trop. Anim.Prod. 2: 292-299.