BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Di era globalisasi ini kita tahu bahwa penyakit semakin hari semakin
bertambah banyak dan ganas. Seiring dengan hal tersebut, kita sebagai manusia
tidak hanya ingin diam saja. Upaya terus dilakukan untuk mencegah suatu
penyakit menyebar luas. Berbagai teknik diagnosis dan pengobatan suatu
penyakit kian hari semakin berkembang.
Para ilmuwan terus mencari dan menemukan berbagai teknik diagnosis yang
cepat dan akurat. Hal yang diteliti pun tidak hanya terbatas organisme dan
lingkungan saja, bahkan saat ini sudah sampai meneliti pada tingkat molekuler.
Teknologi molekuler saat ini merupakan alat yang penting dalam mengidentiikasi
suatu gen baru dengan kepentingan dalam dunia kesehatan, pertanian, industri,
dan lingkungan. Salah satu aplikasi teknik molekuler yang berperan besar dalam
dunia kedokteran yaitu teknik P!".
P!" atau Polymerase Chain Reaction merupakan teknik menggandakan
barisan asam nukleat #D$% atau "$%& in vitro yang bersiat en'imatik. Teknik
P!" telah digunakan secara luas sampai sekarang dan telah dimodiikasi untuk
memenuhi kebutuhan berbagai keperluan seperti biologi molekular secara umum
serta diagnosis patogen tumbuhan secara khusus. (odiikasi teknik P!"
diantaranya adalah Reverse Transcription)P!" #"T)P!"&, Restriction Fragment
Length Polymorphism)P!" #P!")"*+P&, Random Amplified Polymorphism
DNA #"%PD&, multiplex P!", dan P!" untuk perunutan D$%.
Dalam paper ini, kami akan membahas teknik P!" dalam mendiagnosis
penyakit yang disebabkan oleh ineksi. Baik ineksi yang disebabkan oleh jamur,
,irus, maupun bakteri. -ita juga mengetahui bahwa sekarang banyak sekali
ditemukan infectious disease #penyakit yang disebabkan oleh ineksi& baik di
kalangan remaja maupun dewasa. Untuk itu teknik mendiagnosis penyakit ini
sangat diperlukan agar pasien #orang yang terkena ineksi tersebut& mendapatkan
pengobatan yang sesuai dengan penyakitnya.
1
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah yang dapat diajukan
yaitu .
a. %pakah deinisi dari P!" tersebut /
b. Bagaimana sejarah ditemukannya teknik P!" /
c. Bagaimana prinsip kerja dari teknik P!" /
d. Bagaimana aplikasi dari P!" dalam mendiagnosis suatu penyakit/
e. %pa sajakah keunggulan dan kelemahan dari P!" /
1.3 Tujuan Penulsan
Tujuan yang diperoleh dari penulisan ini adalah .
a. Untuk mengetahui deinisi dari P!".
b. Untuk mengetahui sejarah ditemukannya teknik P!".
c. Untuk mengetahui prinsip kerja dari teknik P!".
d. Untuk mengetahui aplikasi dari P!" dalam mendiagnosis suatu penyakit.
e. Untuk mengetahui keunggulan serta kelemahan dari teknik P!"
1.! Man"aat Penulsan
(anaat yang diperoleh dari penulisan ini adalah .
a. Untuk penulis, agar lebih memahami P!" lebih dalam dan lebih jelas.
b. Untuk mahasiswa, khususnya mahasiswa kedokteran, agar mereka
memahami teknik P!" serta dapat mengaplikasikannya dalam
mendiagnosis suatu penyakit.
BAB 2
PEMBAHA#AN
2.1 De"ns
P!" #Polymerase Chain Reaction& atau reaksi berantai polimerase merupakan
suatu metode perbanyakan #replikasi& barisan asam nukleat #D$% dan "$%& melalui
beberapa siklus berulang secara en'imatik #"odr0gue' dan "amire', 1231&.

P!"
adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk menperbanyak sekuens asam
nukleat tertentu tanpa perlu dimasukkan ke dalam sel (in vivo #*atimi, 1233&.Dalam
2
proses perbanyakan sekuens asam nukleat, diperlukan dua primer oligonukleotida
yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target D$%. Dengan
teknik ini, D$% dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relati singkat
dan tidak mahal sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
D$%. Teknik ini digunakan secara luas oleh dokter dan peneliti dalam mendiagnosis
suatu patogen, identiikasi ,irus dan bakteri, dan perbanyakan suatu gen. Selain itu
tes P!" digunakan dalam orensik untuk mendeteksi kriminal #4aribyan dan
%,ashia, 1235) -arena pentingnya peranan teknik P!", maka perlu untuk
mempelajari prinsip dasar dari P!" dan bagaimana cara penggunaannya untuk
analisis gen dan genom.
2.2 #ejarah #ngkat Penemuan P$R
Teknik P!" #Polymerase Chain Reaction ditemukan oleh -ary Banks (ullis
pada tahun 3678 pada saat ia bekerja di !etus !orporation, !aliornia. Penemuannya
diawali ketika (ullis pergi dari San *rancisco menuju (endocina dengan
mengendarai mobil Honda !i,icnya. 9a menemukan cara baru untuk mendeteksi
urutan basa yang spesiik dari D$%.
Polimerase D$% awalnya digunakan untuk P!" yang diekstraksi dari bakteri
!scherichia coli. Untuk P!", reaksi harus dipanaskan untuk denaturasi produk D$%
untai ganda setelah setiap putaran sintesis, $amun sayangnya pemanasan membuat
en'im D$% Polimerase bakteri inakti permanen. %gar polimerase D$% tetap stabil
selama proses denaturasi D$% yaitu dilakukan sekitar 68 :!. Solusi ditemukan ketika
Bakteri Thermophilus a"uaticus diisolasi dari sumber air panas, di mana bakteri
tersebut selamat dan berkembang biak pada suhu yang sangat tinggi, dan
menghasilkan polimerase D$% yang tidak akti secara lambat pada suhu tinggi.
4eland dan rekan)rekannya di !etus memurnikan dan kemudian mengklon
polimerase dari bakteri tersebut, memungkinkan ampliikasi P!" lengkap yang akan
dibuat tanpa membuka tabung reaksi. Terlebih lagi, karena en'im diisolasi dari
organisme termoilik, itu berungsi secara optimal pada suhu sekitar ;1 : !. (aka
3
langkah sintesis D$% yang dilakukan di suhu yang tinggi lebih baik menggunakan
en'im dari organisme termoilik dibandingkan dengan dari bakteri !#coli#
Teknik P!" saat ini sangat populer digunakan untuk mendiagnosa suatu
penyakit. Teknik ini juga telah dikembangkan dan digunakan dalam mengin,estigasi
kriminal, studi lingkup ekologi, dan diagnosis kedokteran. Pada tahun 3665 -ary
Bank (ullis mendapatkan hadiah $obel dalam bidang kimia atas penemuan teknik
P!". #Bartlett, ,ol.11<&
2.3 Prns% &erja Polymerase Chain Reaction
(ekanisme perbanyakan sekuens asam nukleat oleh P!" sama dengan proses
replikasi D$% in vivo #"odr0gue'. dan "amire'. 1231&. -omponen)komponen yang
diperlukan pada proses P!" diantaranya sekuens asam nukleat #D$% atau "$%&
cetakan, primer spesiik, Deoxynucleotide Triphosphate #d$TP&, =n'im D$%
Polymerase thermosta$le, larutan penyangga #buer& serta senyawa (g!l1
#"odr0gue' dan "amire', 1231&
Sekuens asam nukleat cetakan dalam proses P!" berungsi sebagai cetakan
untuk membentuk susunan rantai D$% baru yang sama. Sekuens asam nukleat
cetakan dapat berupa D$% kromosom, D$% plasmid, maupun D$% yang
mengandung ragmen D$% asal dalam D$% cetakan. (etode yang digunakan untuk
menyiapkan D$% cetakan tergantung pada tujuan penelitian. (etode penyiapan D$%
cetakan dilakukan dengan metode isolasi D$%, yaitu dimulai dari penghancuran
#lisis& dinding sel tanpa merusak D$%, kemudian memisahkan D$% dari komponen)
komponen padat seperti protein, selulosa, dan terakhir pemurnian D$% #Handoyo
dan "udiretna, 1223&. >ika suatu "$% ingin diperbanyak dengan teknik P!", maka
"$% akan diubah terlebih dahulu menjadi D$% dengan bantuan en'im reverse
transcription #dikutip dari . P!" . an outstanding method&
-emurnian dan jumlah D$% sasaran merupakan hal perlu diperhatikan pada
proses P!". %pabila terjadi kontaminasi pada D$% sasaran akan mempengaruhi
proses P!". Seperti adanya kontaminan D$% sasaran dengan =DT% dan detergen
dapat menurunkan eisiensi P!". -emurnian D$% sasaran dapat diketahui melalui
4
spektrootometri dengan menentukan rasio absorbansi pada panjang gelombang 1<2
nm dan 172 nm. $ilai kemurnian D$% berkisar antara 3.7 ? 1.2 #*atchiyah,1233&
dengan cara membagi nilai absorbansi 1<2 nm dengan nilai absorbansi 172 nm. >ika
nilainya melebihi 1.2 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari
protein membrane @ senyawa lainnya sehingga kadar D$% plasmid yang didapatkan
belum murni. >ika nilainya kurang dari 3.7 menunjukkan adanya kontaminasi
#+arasati,1233&
Primer merupakan segmen pendek dari D$% atau "$% #oligonukleotida&
dengan panjang 12)52 basa yang menginisiasi dan membatasi pemanjangan atau
polimerisasi D$% #"odr0gue'. dan "amire'. 1231 A Handoyo dan "udiretna, 1223&.
Pada proses P!" diperlukan sepasang primer, yaitu upstream primer dan do%nstream
primer# Desain primer akan mempengaruhi spesiitas dan eisiensi ampliikasi.
Spesiitas tidak akan meningkat dengan primer lebih panjang dari 52 nukleotida.
Primer dapat dirancang dengan cara menentukan urutan D$% yang telah diketahui
maupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan D$% atau protein bisa diketahui
melalui data$ase &en'an( #Handoyo dan "udiretna, 1223&
d$TP #deoksinukleotida triosat& merupakan campuran yang terdiri dari
d%TP #deoksiadenosin triosat&, d4TP #deoksiguanosin triosat&, d!TP
#deoksisitidin triosat&, dan dTTP #deoksitimidin triosat&, Pada proses P!",
d$TPs berungsi sebagai $uilding $loc( D$% yang diperlukan ketika proses ekstensi
berlangsung dalam menghasilkan produk dari P!" #4aribyan dan %,ashia, 1235&.
-onsentrasi dari d$TPs pada proses P!" perlu diperhatikan untuk menghasilkan
produk ampliikasi yang baik. -onsentrasi dari d$TP harus dalam keadaan yang
seimbang, jangan terlalu rendah maupun terlalu tinggi. -onsentrasi umum yang
digunakan berkisar antara 82 ? 322 mikromolar #*atimi, 1233 A Handoyo dan
"udiretna, 1223&.
Buer P!" diperlukan untuk menjaga PH medium karena P!" akan
berlangsung pada PH tertentu. -onsentrasi dari larutan penyangga harus selalu di
jaga untuk mendapatkan produk ampliikasi yang baik. Selain buer P!", komponen
yang juga diperlukan yaitu ion (g
1B
yang bisa didapat dari senyawa (g!l1. (g!l1
5
bertindak sebagai koaktor yang berungsi merangsang akti,itas en'im D$%
Polimerase #Handoyo dan "udiretna, 1223&.
=n'im D$% Polymerase diperlukan untuk mengkatalis sintesis rantai
polinukleotida yang panjang dari monomer atau reaksi polimerisasi D$%. =n'im
D$% Polymerase yang digunakan didapat dari isolasi bakteri termoilik sehingga
bersiat termostabil, salah satu contohnya yaitu =n'im TaC Polimerase diisolasi dari
bakteri Thermus a"uaticus. >ika tidak menggunakan en'im yang bersiat termostabil,
maka en'im tersebut akan mengalami denaturasi dalam suhu yang tinggi sehingga
tidak dapat dilakukan proses ampliikasi D$% dengan teknik P!". #Handoyo dan
"udiretna, 1223&.
"eaksi P!" terdiri dari 5 tahap, yaitu denaturasi, annealing #penempelan&,
ekstensi@elongasi #pemanjangan&.
$ewton and 4raham #366;& dalam "ohmy #1223&, menyatakan denaturasi
merupakan proses pemisahan D$% dari utas ganda #dou$le helix& menjadi utas
tunggal #single helix&. Tahap ini biasanya dilakukan pada suhu 61 ? 68
2
!. Untuk
menyakinkan hasil uji P!" diperlukan denaturasi awal selama 3 ? 5 menit kemudian
dilanjutkan dengan proses elektrooresis. Denaturasi yang tidak sempurna dapat
menyebabkan putusnya rantai D$%. Tahap denaturasi yang terlalu lama akan
menyebakan hilangnya akti,itas en'im D$% Polymerase. #+isdiyanti, 366; dalam
"ohmy, 1223&.
Annealing merupakan tahap penempelan primer. Tahap ini merupakan tahap
terpenting dalam proses P!" karena jika terjadi kesalahan pada tahap ini akan
memengaruhi kemurnian dan hasil akhir dari produk D$% yang diinginkan. Dang
memegang peranan penting pada tahap ini adalah primer dan suhu saat annealing.
Suhu pada tahap annealing berkisar antara 5; ? 88
2
! #Saiki et al., 3677 dalam
"ohmy, 1223&
=kstensi adalah proses pemanjangan D$%. Dalam tahap ekstensi, en'im D$%
polymerase akan bergabung dengan nukleotida untuk pemanjangan primer lengkap
dalam sintesis sebuah D$% utas ganda, reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke
siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi D$%. Proses pemanjangan
6
primer #tahap eEtension& biasanya dilakukan pada suhu ;1
o
!, yaitu suhu optimal
untuk TaCD$% polimerase #Hsu et al., 366< dalam Fahyudi, 1223&.
2.! A%lkas P$R terha'a% Dagn(ss Pen)akt In"eks
Selama 52 tahun terakhir, teknologi molekuler masih terus dalam
pengembangan, namun memiliki kemajuan yang sangat pesat dalam tahun terakhir
ini. Teknik P!" merupakan salah satu teknik yang paling sering digunakan dalam
laboratorium dan institusi penelitian #"odr0gue'. dan "amire'. 1231&. Salah satu
kegunaan teknik Polymerase Chain Reaction #P!"& adalah untuk mendeteksi ineksi
kuman penyebab suatu penyakit, salah satunya yaitu Penyakit Diteri.
Diteri merupakan penyakit ineksi saluran pernapasan bagian atas, yang
disebabkan oleh toksin bakteri Coryne$acterium diptheriae. Toksin yang dihasilkan
bakteri tersebut masuk ke dalam pembuluh darah dan beredar ke seluruh tubuh
termasuk jantung sehingga bisa merusak jantung. Selain itu toksin tersebut dapat
menyebabkan kelumpuhan pada beberapa otot seperti otot mata, otot tungkai, dan
otot saluran pernapasan #Handayani, 1231&
Sintesis toksin diteri diatur oleh protein yang disandi oleh gen kromosom
bakteri. Toksin bakteri dibuat dan disekresi dalam bentuk rantai polipeptida tunggal,
=n'im Protease akan memotongnya menjadi bagian yang lebih kecil, yaitu ragmen %
dan ragmen B. *ragmen % yang bersiat toksik merupakan penghambat sintesis
protein sel inang sehingga menimbulkan kematian sel. *ragmen B tidak bersiat
toksik namun berperan dalam penetrasi atau perlekatan ke sel inang, tanpa penetrasi
ragmen % tidak bisa akti. Pemeriksaan diteri dengan P!" bertujuan untuk
mendeteksi gen toE yang terdapat pada ragmen % yang akti secara biologis.
#Handayani , 1231&
-omponen yang diperlukan untuk pemeriksaan P!" yaitu sampel D$%.
Dalam hal ini D$% sampel didapat dari pengambilan usap di daerah peradangan
misalnya di sekitar tenggorokan dan nasoaring, dimana sampel D$% akan di
ekstraksi untuk memperoleh D$% template #D$% cetakan&. =kstraksi D$%
dilakukan dengan cara menanam sampel usap yang telah diambil di daerah
7
peradangan ke medium agar hoyle)s tellurite, kemudian diinkubasi pada suhu 5;
2
!
selama 37 ? 12 jam. Selanjutnya pemilihan koloni yang diduga sebagai penyebab
Diteri. -oloni yang dipilih 5 ? 8 koloni kemudian dipindahkan ke dalam tabung
ependro 3,8 m+ yang mengandung 2,8 m+ air destilasi steril. Dilakukan pemanasan
sampel selama 12 menit kemudian disentriugasi pada 7222 kali selama 3 menit,
Dang digunakan sebagai sampel D$% untuk pemeriksaan P!" hanya 5 mikroliter
supernatan #Handayani, 1231&.
-omponen yang kedua yaitu primer #sepasang rangkaian pendek D$% yang
merupakan susunan asam nukleat komplementer dengan asam nukleat D$% target
#pada template&. Primer berungsi untuk memulai sintesis rantai D$% baru. Salah satu
primer yang dapat digunakan untuk deteksi diteri .
8G4TTT4!4T!%%T!TT%T%4445G dengan posisi nukleotida 38 ? 5< dan
8G%!!TT44T4T4%T!T%!T4TTT5G dengan posisi nukleotida 3<11 ? 3<H5.
Dengan primer tersebut akan dihasilkan produk P!" sepanjang 1H7 pb #panjang basa
yang merupakan bukti bahwa sampel posti mengandung diteri&. Selain itu untuk
pemeriksaan P!" juga diperlukan basa %denin, Timin. 4uanin, dan Sitosin, en'im
polymerase dan buer.
Untuk mendeteksi kuman diteri dilakukan teknik P!" dengan tahap sebagai
berikut . (asukkan semua komponen yang diperlukan ke dalam mesin Thermal
Cycle* kemudian D$% pada awalnya didenaturasi pada 68
o
! selama 8 menit,
kemudian dilakukan 58 siklus ampliikasi D$% dimana tiap siklus terdiri dari
denaturasi pada suhu 6H
2
! selama 3 menit, annealing pada suhu 88
2
! selama 3 menit,
dan ekstensi pada suhu ;1
2
! selama 3 menit, diikuti dengan ekstensi akhir ;1
o
!
selama 32 menit.
Hasil penggandaan sampel kemudian dielektrooresis pada gel agarosa 2.7I
dengan ,oltase 382)372 selama 52 menit ? 5 jam. Hingga pada akhirnya didapatkan
1H7 pb #panjang basa& yang merupakan bukti bahwa sampel posti #Handayani, 1231&
8
*am+ar 1 Hasil penggandaan produk D$% #1H7 pb& untuk mendeteksi kuman
bakteri toksigenik dengan teknik P!". Baris %. Penanda yang telah diketahui panjang
basanyaA baris B)>. sampel positi diteriA baris -. kontrol negati #( J akuades &A + J
kontrol positi
2.,. &euntungan 'an &elemahan P$R
a. -euntungan
Teknik P!" sederhana dan mudah untuk dimengerti dan digunakan, dan
menghasilkan produk yang cepat #Kogel et al, 1231 dalam 4aribyan dan
%,ashia, 1235&
P!" memiliki sensiti,itas tinggi, memiliki potensial untuk menghasilkan
salinan sekuens asam nukleat sebanyak jutaan bahkan miliaran.
P!" memiliki spesiitas karena dapat diperbanyak dengan kondisi ketat.
P!" merupakan metode yang cepat bila dibandingkan dengan metode
lain untuk mendeteksi mikroorganisme dimana perlu dilakukan proses
isolasi dan kultur dengan media kultur #4aribyan, +. dan %,ashia, $. 1235&.
b. -elemahan
-arena sensiti,itas dan spesiisitas reaksi P!", sedikit kontaminasi dapat
menyebabkan kesalahan dalam mengampliikasi sekuens asam nukleat.
P!" hanya dapat digunakan untuk mengidentiikasi keberadaan atau
tidak adanya patogen atau gen yang diketahui.
9
"eaksi P!" sangat sensiti terhadap kondisi reaksi dan bahkan dalam
duplikasi mungkin tidak bisa memberikan hasil yang identik.
Primer yang digunakan untuk P!" dapat menempel secara nonspesiik
untuk urutan yang sama, tetapi tidak sepenuhnya identik,
untuk menargetkan D$% #Kiljoen et.al. , 1228 A 4aribyan dan %,ashia,
1235&.
10
BAB III
PENUTUP
3.1 #m%ulan
P!" #Polymerase Chain Reaction& merupakan suatu teknik perbanyakan
sekuens asam nukleat in vitro melalui beberapa siklus berulang secara
en'imatik. Teknik P!" ditemukan pertama kali oleh -ary Banks (ullis pada
tahun 3678 serta mendapat nobel dalam bidang kimia tahun 3665. -omponen
yang diperlukan pada P!" diantaranya asam nukleat cetakan, primer, d$TP,
=n'im D$% Polymerase termostabil, buer serta (g!l1. "eaksi P!" terdiri
dari 5 tahap, yaitu denaturasi, annealing* dan ekstensi. Salah satu kegunaan
P!" yaitu dapat mendiagnosis suatu penyakit menular, contohnya Penyakit
Diteri. Prosesnya yaitu, (asukan seluruh komponen ke dalam mesin
Thermal Cycle, dilanjutkan didenaturasi pada 68
o
! 8 menit, kemudian
mengalami 58 siklus ampliikasi D$% #denaturasi pada suhu 6H
2
! 3 menit,
annealing pada suhu 88
2
! 3 menit, dan ekstensi ;1
2
! 3 menit&, diikuti dengan
ekstensi akhir ;1
o
! 32 menit. Hasil penggandaan sampel kemudian
dielektrooresis pada gel agarosa 2.7I dengan ,oltase 382)372 selama 52
menit ? 5 jam. Hingga pada akhirnya didapatkan 1H7 pb yang merupakan
bukti sampel posti. Teknik P!" merupakan teknik yang sensiti, bisa
menghasilkan salinan sekuens asam nukleat yang jumlahnya miliaran namun
bila terkontaminasi sedikit saja bisa memberi hasil yang salah.
11
D%*T%" PUST%-%
%nonym. P!". an outstanding method. http+,, %%%#roche#com, pcr -e#pdf # 37 Lktober
123H #32.37&
%nonym. 1231. 9SL+%S9 D$%. http+,,%%%#generasi$iologi#com,./0.,/1,isolasi2
dna#html. 12 Lktober 123H #33.36&
Bartlett, >. (. S. Stirling, D. 1225. PCR Proto(ol 3olume ..4. 1
nd
ed. Humana Press.
*atimi, H. 1233. MP!"N #Polymerase Chain Reaction&.
http+,,%%%#scri$d#com,doc,54610567,PCR2ami # 37 Lktober 123H #12.21&.
4aribyan, +. and %,ashia, $. 1235. Polymerase !hain "eaction. 8ournal of
9nvestigative Dermatology 355#5& . 3 ? H.
Handayani, S. 1231. Deteksi -uman Diteri dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR# Badan Penelitian dan Pengembangan -esehatan, Departemen -esehatan "9
56#5& . 118 ? 11;.
Handoyo, D. dan "udiretna, %. 1223. P"9$S9P U(U( D%$ P=+%-S%$%%$
PL+D(="%S= !H%9$ "=%!T9L$ (PCR O4eneral Principles and 9mplementation
o Polymerase !hain "eactionP. Pusat Studi Bioteknologi ? Uni,ersitas Surabaya
6#3& . 3; ? 16.
"odr0gue', P.H. dan "amire', %.4. 1231. Polymerase chain reaction . types, utilities
and limitations. http+,,%%%#intechopen#com,do%nload,pdf,7:.45 . 3H Lktober 123H
#3H.8;&
Uni,ersity o !olorado. P!" ? Polymerase !hain "eaction.
http+,,%%%#colorado#edu,outreach,';9,pdfs,PCR#pdf . 31 Lktober 123H #15.53&
Kiljoen, 4. >. , $el, +. H. , !rowther, >. ". 1228. (olecular Diagnostic o P!"
Handbook. Springer. $etherland
12