2/19/2014

By : Lisa Lisdiana, S.Si., M.Si.

17.02.2014

MAIN TOPICS
MIKROSKOP
TEKNIK-TEKNIK LABORATORIUM DI
BIDANG MIKROBIOLOGI

TEKNIK ASEPTIK
STERILISASI
ISOLASI DAN TEKNIK PLATING
KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI
ENUMERASI

2/19/2014

Suatu instrumen yang tersusun dari beberapa lensa, yang

berfungsi untuk memperbesar obyek yang sangat kecil ke
ukuran yang dapat terlihat
Prinsip Kerja :
Semakin pendek panjang gelombang dari sinar yang
digunakan, maka resolusi akan semakin tinggi
Resolusi :
Kemampuan
dari
lensa-lensa
mikroskop
untuk
membedakan dua titik yang berdekatan sebagai dua titik
yang berbeda
Indeks Refraktif :
Suatu unit yang menyatakan kemampuan suatu media
untuk membelokkan sinar

Staining

MACAM MIKROSKOP BERDASARKAN SUMBER ILUMINASI :

Mikroskop Cahaya :
- Mikroskop cahaya biasa / mikroskop medan terang
- Mikroskop bidang gelap
- Mikroskop fase-kontras
- Nomarski Difference Interference Contrast (DIC)

Mikroskop Confocal
Mikroskop Fluoresen
Mikroskop Elektron :
- Transmission Electron Microscope (TEM)
- Scanning Electron Microscope (SEM)

2/19/2014

Mikroskop Medan Terang

(Bright-fields Microscope)
Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 700 nm)
Tidak dapat digunakan untuk mengamati obyek yang
berukuran < 0,2 m
Visualisasi yang diperoleh menunjukkan spesimen
dengan latar belakang terang
Fungsi :
o Untuk mengamati berbagai spesimen yang telah
melalui proses pewarnaan
o Untuk penghitungan jumlah sel mikroorganisme

Mikroskop Bidang Gelap

(Dark-fields Microscope)
Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 700 nm)
Menggunakan kondenser khusus berbentuk opaque
disc yang mencegah cahaya untuk dapat melewati
lensa obyektif secara langsung
Cahaya yang direfleksikan oleh spesimen langsung
melewati lensa obyektif
Spesimen tampak terang dengan latar belakang
gelap
Fungsi :
o Untuk mengamati spesimen hidup yang tidak tampak
pada mikroskop medan terang, ex. Treponema
pallidum

2/19/2014

Mikroskop Fase Kontras

(Phase-contrast Microscope)
Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 700 nm)
Menggunakan kondensor khusus yang tersusun dari
suatu diafragma berbentuk annular (ring-shaped)
Diafragma tersebut berfungsi mengatur supaya
cahaya
dapat
langsung
melewati
kondensor,
memfokuskan cahaya pada spesimen dan diffraction
plate pada lensa obyektif
Cahaya
langsung
dan
cahaya
yang
direfleksikan/didifraksikan tersebut secara bersamasama akan menghasilkan visualisasi dari spesimen
Spesimen tidak perlu diwarna terlebih dahulu
Fungsi:
o Untuk memfasilitasi pengamatan secara mendetail
dari struktur internal spesimen hidup

2/19/2014

Nomarski Difference Interference

Contrast (DIC) Microscope
Sumber iluminasi adalah sinar tampak (400 700 nm)
Mirip dengan Phase-Contrast Microscope
Menggunakan berbagai indeks refraksi untuk
menghasilkan visualisasi spesimen
Menggunakan
dua cahaya yang dipisahkan oleh
prisma
Visualisasi spesimen tampak berwarna sebagai hasil
dari efek prisma
Spesimen tidak perlu diwarna terlebih dahulu
Fungsi :
o Untuk mengamati spesimen dengan visualisasi tiga
dimensi

2/19/2014

Mikroskop Confocal
(Confocal Microscope)
Menggunakan sinar laser untuk mengiluminasi suatu
spesimen pada satu waktu
Fungsi :
o Untuk mendapatkan visualisasi dua dimensi dan tiga
dimensi dari suatu sel untuk aplikasi di bidang
biomedis

2/19/2014

Mikroskop Fluoresen
(Fluorescence Microscope)
Menggunakan sinar ultraviolet atau sinar yang
panjang
gelombangnya
mendekati
panjang
gelombang sinar ultraviolet sebagai sumber iluminasi
Menghasilkan visualisasi spesimen fluoresen yang
memendarkan cahaya
Fungsi :
o Untuk
pengamatan
hasil
teknik
FluorescentAntibiotic (immunofluorescence)
o Untuk mendeteksi dan mengidentifikasi secara
cepat keberadaan mikroorganisme pada spesimen
klinis atau spesimen yang berupa jaringan

2/19/2014

ELECTRON MICROSCOPE
Transmission Electron Microscope (TEM)
Menggunakan elektron sebagai sumber iluminasi
Dapat digunakan untuk mengamati struktur yang
berukuran < 0,2 m
Visualisasi dua dimensi
Spesimen harus memiliki ketebalan tertentu
Fungsi :
o Untuk mempelajari dan mengamati virus atau
ultrastruktur
internal
dari
suatu
sel
(dengan
perbesaran 10.000 100.000 x)

2/19/2014

Scanning Electron Microscope (SEM)

Menggunakan elektron sebagai sumber iluminasi

Dapat digunakan untuk mengamati struktur yang
berukuran < 0,2 m
Visualisasi tiga dimensi
Fungsi :
o Untuk mempelajari struktur permukaan dari suatu
sel atau virus (dengan perbesaran 1000 10.000 x)

2/19/2014

TEKNIK PEWARNAAN
Pewarnaan
Sederhana

Prinsip Dasar
- Pewarna tunggal yang bersifat aqueous (kadang-

(ex. methylene blue,

kadang ditambahkan mordant untuk memperkuat

carbolfuchsin,

warna).

crystal violet,
safranin)

- Dilakukan untuk memperjelas mikroorganisme

yang diamati sehingga dapat ditentukan morfologi
selnya.

10

2/19/2014

Pewarna
Diferensial
/Pembeda

Gram

Acid-fast

Pewarna

Prinsip Dasar
Menggunakan 2 pewarna, yaitu pewarna utama dan
pewarna pembanding. Dua tipe bakteri yang berbeda akan
bereaksi secara berbeda terhadap pewarna sehingga
dapat membedakan keduanya.
- Mengelompokkan bakteri ke dalam 2 kelompok besar,
yaitu : gram positif and gram negatif.
- Bakteri Gram positif mempertahankan pewarna crystal
violet, sehingga berwarna ungu.
- Bakteri Gram negatif tidak mempertahankan pewarna
crystal violet dan tetap tidak berwarna sampai diberikan
pewarna pembanding safranin, sehingga berwarna
merah.
- Digunakan untuk membedakan spesies Mycobacterium
dengan spesies Nocardia.
- Acid fast bacteria akan berwarna merah karena mengikat
pewarna utama (carbol fuchsin).
- Non-acid fast bacteria akan berwarna biru karena
mengikat pewarna pembanding (methylene blue).

Prinsip Dasar

Khusus

Digunakan untuk mewarnai struktur tertentu seperti kapsul,

endospora, dan flagella.

Negatif

Digunakan untuk menunjukkan keberadaan kapsul. Kapsul tidak

dapat menyerap pewarna, sehingga akan tampak sebagai halos di
sekitar sel bakteri dan tampak jelas jika dibandingkan dengan
latar belakang yang berwarna gelap
Digunakan untuk deteksi keberadaan endospora pada bakteri.
Pewarna malachite green akan mewarnai endospora sehingga
berwarna hijau, sedangkan safranin akan mewarna sel sehingga
berwarna merah

Endospora

Flagela

Digunakan untuk menunjukkan keberadaan flagela. Mordant

ditambahkan saat pewarnaan ini untuk meningkatkan visibilitas
flagela saat diwarnai dengan carbol fuchsin

11

2/19/2014

Pewarnaan Sederhana dengan Pewarna Methylene Blue

12

2/19/2014

A
B

Environment

MIKROORGANISME

KULTUR
MURNI

A culture consist of a
single species

HOW ???

Laboratory Technique
in Microbiology

13

2/19/2014

Suatu metode yang dilakukan pada kegiatan mikrobiologi

untuk mencegah kontaminasi dari organisme yang tidak
diinginkan.
Contoh :
Disinfeksi meja kerja menyemprot meja kerja dengan
agen antimikrobial
Bekerja di dekat api (bunsen)
Mensterilkan semua peralatan yang akan digunkan
Menyemprot tangan dengan alkohol 70 % sebelum dan
sesudah bekerja dengan mikroorganisme
etc.

Definisi :
Suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media
dari mikroba

Teknik Sterilisasi:
* Mekanik
Berkefeld filter, Chamberland filter, Seitz filter
* Fisika
Pemanasan kering, pemanasan basah, radiasi
* Kimia
Agen antimikrobial

14

2/19/2014

Berdasarkan konsistensi :
- Media cair
- Media padat
- Media setengah padat / semi solid

Berdasarkan komposisi bahan :

- Media sintetik
- Media semi sintetik
- Media alami

Berdasarkan fungsi :
- Media umum / universal
- Media selektif
- Media diferensial
- Media pengaya / penyubur

ISOLASI MIKROORGANISME
1. Menangkap mikroorganisme dari lingkungan
2. Melakukan pemurnian terhadap mikroorganisme yang dikehendaki

Plating Methods :
Streak Plate Method

isolasi mikroorganisme, teknik pemurnian

(kuadrant), peremajaan (sub-kultur), dll

Spread Plate Method

isolasi mikroorganisme, enumerasi, uji

antagonistik, dll

Pour Plate Method

isolasi mikroorganisme, enumerasi,

karakterisasi, uji resistensi,uji antagonistik,
dll

15

2/19/2014

Skema Streak Plate dengan Metode Kuadran

16

2/19/2014

Karakterisasi Fenotipik dan Genomik

Fenotipik

Pengamatan morfologi (koloni dan sel),

Uji Fisiologis dan Biokimia

Genomik

Repetitif sekuen DNA, analisis 16S DNA

ENUMERASI
1. Penghitungan Langsung
Haemocytometer
2. PenghitunganTidak Langsung Menghitung Kekeruhan Sel
(Spektrofotometri)
Menghitung Berat Kering Sel
Hitungan Cawan (Total Plate Count)

Pengenceran Berseri

17

2/19/2014

18

2/19/2014

STANDART PLATE COUNT

Syarat :
Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang memiliki jumlah koloni
antara 30 sampai 300
Peraturan pelaporan data :

Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, angka pertama
di depan koma dan angka kedua di belakang koma.

Jumlah koloni per pengenceran

10-2

10-3

10-4

Standart
Plate Count

223

28

10

2,2 x 104

28 dan 10 < 30

350

115

29

1,2 x 105

350 > 300; 29 < 30

198

106

TBUD

TBUD

2,0 X

Keterangan

TBUD > 300

19

2/19/2014

Jika

hasil

penghitungan

koloni

pada

semua

cawan

petri

menghasilkan jumlah koloni kurang dari 30 koloni, hanya jumlah

koloni

pada

pengenceran

terendah

yang

dihitung.

Hasilnya

dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya

pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran

10-2

10-3

23

Jika

10-4

17

hasil

penghitungan

Standart
Plate Count

Keterangan

< 30 x 102
(2,3 x 103)

Hasil
penghitungan
pada pengenceran 10-2
yang digunakan untuk
pelaporan data

koloni

pada

semua

cawan

petri

menghasilkan jumlah koloni lebih dari 300 koloni, hanya jumlah

koloni

pada

pengenceran tertinggi

yang

dihitung.

Hasilnya

dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya

pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per

pengenceran
10-2
10-3
10-4
TBUD

TBUD

375

350

415

29

Standart
Plate Count

Keterangan

Hasil
penghitungan
pada
> 30 x 107
-4
pengenceran
10
yang
(3,8 x 106)
digunakan untuk pelaporan data
Hasil
penghitungan
pada
> 30 x 106
-3
pengenceran
10
yang
(4,2 x 105)
digunakan untuk pelaporan data

20

2/19/2014

Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni

dengan jumlah antara 30 sampai 300, dan perbandingan antara hasil
tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil
atau sama dengan 2, tentukanlah rata-rata dari kedua nilai tersebut
dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan
antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang
dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

Jumlah koloni per

pengenceran
10-2
10-3
10-4
275
51
25
136
53
21

Standart Plate
Count
3,9 x 104
1,4 x 104

Keterangan
51000/27500 = 1,85 (<2)
53000/13600 = 3,9 ( >2)

JIka digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data

yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh
diambil salah satu, meskipun salah satu cawan duplo tersebut
tidak memenuhi syarat jumlah koloni di antara 30 sampai 300
koloni.
Jumlah koloni
Standart
per pengenceran Plate Count
10-2 10-3 10-4
175 16
3
1,9 x 104
208 17
2
138

42

3
1,5 x 104

162

42

Keterangan

Rata-rata dari pengenceran 10-2

Rata-rata dari pengenceran 10-2

karena
perbandingan
antara
pengenceran 10-2 dan 10-3 adalah
2,4

21

2/19/2014

290

36

280

32

291

25

3,1 x 104

3,0 x
305

27

104

Rata-rata dari pengenceran 10-2

dan 10-3 karena perbandingan
antara
kedua
pengenceran
adalah 1,2

Rata-rata dari pengenceran 10-2

meskipun 305 > 300 (angka
yang lain < 30)

22