Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2003

PENGEMBANGAN STRAIN MUTAN B. ABORTUS RB27 DENGAN

TEKNIK PASASE DALAM RIFAMPISIN
Supartono

Balai Penelitian veteriner, Jl. R.E. Martadinata 30 Bogor, 16114

RINGKASAN
Pengendalian Brucellosis melalui vaksinasi dengan strain S 19 dilaporkan dapat mengakibatkan keguguran pada
sapi bunting dan menimbulkan residu antibodi yang berkepanjangan sehingga mengacaukan diagnosis. Strain mutan
Brucella abortus diketahui dapat mengatasi brucellosis tanpa menimbulkan efek samping tersebut. Pada penelitian
ini telah dikembangkan isolat mutan B. Abortus RB27 dengan teknik pasase dalam rifampisin . RB27 diderivasi dari
isolat lokal B. Abortus S 158 yang patogen dengan teknik pasase berulang pada media trypticase soy agar (TSA)
ditambah suplemen rifampisin. Rifampisin ditambahkan dengan konsentrasi bertingkat mulai dari 2511 sampai 30011
berulang-ulang sehingga diperoleh B. Abortus strain mutan RB27. Koloni strain RB27 berupa koloni rough (kasar)
ditandai dengan adanya reaksi autoaglutinasi pada penambahan acrifavine . Strain RB27 merupakan strain B.
abortus yang mampu beradaptasi pada kondisi aerobik.

Kata kunci: Brucella, abortus, RB27, mutan, rifampisin, pasase

PENDAHULUAN
Brucellosis/ penyakit keluron disebabkan oleh infeksi kuman Brucella abortus yang dapat
mengakibatkan keguguran dan menurunkan tingkat kesuburan pada hewan (Enright, 1990) serta dapat
menginfeksi manusia (YOUNG, 1983). Brucellosis yang menginfeksi sapi (Brucella abortus), domba
(B. ovis), kambing (B. militensis) dan babi (B. suis). Secara biokimia ada 7 biotipe dari kuman brucella,
yaitu biotipe 1-6 dan biotipe 9 (Alton, dkk., 1988). Secara morfologi kuman B. abortus bersifat gram
negatip, tidak bergerak, tidak berspora, berbentuk kokobasilus dengan panjang 0,6 mm -1,5mm. Sel
kuman terlihat sendiri-sendiri, berpasangan atau membentuk rantai pendek. Koloni kuman berbentuk
bulat, halus, permukaan cembung dan licin berkilau clan tembus cahaya .

Brucellosis pada sapi sulit disembuhkan oleh karena itu pengendalian penyakit yang dilakukan
adalah dengan program vaksinasi (Alton 1988). Di Indonesia dan dibeberapa negara lainnya, vaksin
yang biasa digunakan untuk program vaksinasi adalah vaksin aktif B. abortus S 19 (Nicoletti, 1990).
Vaksin B. abortus S 19 dilaporkan mempunyai beberapa kelemahan yaitu keguguran pada sapi bunting
yang divaksin (Nicoletti 1977), infeksi petmanen (CornerAnd Alton, 1981) dan adanya residu antibodi
yang berkepanjangan sehingga mengacaukan diagnosis pada saat potong bersyarat (Morgan, 1977
And Mac Milland, 1990).
Strain mutan koloni kasar (rough) dari B. Abortus RB51(SRB51) telah dikembangkan sebagai altematif
pengganti S 19 (Steven 1995 ; Schurig 1991 Dan Olsen, 2000). Strain B. Abortus mutan tersebut tidak
mengakibatkan keguguran pada hewan bunting (Cheville 1996) dan tidak menimbulkan residu antibodi .
Hanya saja strain RB51 ini belum diijinkan beredar di Indonesia. Berdasarkan pertimbangan tersebut
penelitian ini bertujuan untuk membuat strain B. Abortus mutan RB27 yang derivasi dari isolat lokal
S 158 dengan teknik pasase berulang dengan rifampisin . Diharapkan strain mutan RB27 ini dapat untuk
dikembangkan menjadi kandidat vaksin untuk penanggulangan brucellosis .

Badan Penelitian clan Pengembangan Pertanian

145

Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2003

BAHAN DAN CARA

A. Isolasi Brucella abortus S158 dari sampel susu
Strain Brucella abortus galur mutan RB27 diderivasi dari isolat lokal S158 yang diisolasi dari
sampel susu sapi penderita brucellosis di Jakarta Selatan. Sebanyak 50 ml susu positip brucella
disentrifugasi dengan kecepatan 3000 RPM selama 30 menit . Supernatan dibuang, pelet dibiakan
pada trypticase soy agar (Oxoid) yang telah ditambah 1,5% bacto agar (Oxoid) (TSBA) dan ditambah
Brucella selective suplemen (Oxoid .) Kultur dinkubasikan pada suhu 37C dalam kondisi aerobic (510% CO) selama 72 jam. Koloni brucella yangtumbuh dimurnikan dan diidentifikasi secara biokimia.
Kuman diperbanyak pada agar miring dan disimpan kering beku (Freeze dried).
B. Derivasi B. abortus mutan RB27 dalam rifampisin
Derivasi kuman B. abortus mutan RB27 dalam rifampisin mengikuti metode Schurig dkk., (1991) .
Isolat B. abortus S158 dipasase pada media TSBA yangtelah ditambah rifampisin dengan konsentrasi
bertingkat dari 2511 sampai 30011 dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu 37C dalam kondisi
aerobic (5-10% CO2) selama 48 jam . Koloni kuman yang tumbuh ditumbuhkan kembali pada media
TSBA secara berulang-ulang sebanyak 27 kali dengan penambahan rifampisin dengan konsentrasi
yang meningkat dan kemudian konsentrasi rifampisin diturunkan kembali sampai diperoleh koloni
kuman B. abortus RB27 yangresisten/mutan terhadap rifampisin. Strain brucella mutan bentuk koloni
adalah koloni kasar (rough) .
C. Pembebasan ketergantungan C02 B. abortus RB27
Strain B. abortus RB27 diadaptasikan pada kondisi tanpa C02 dengan cara kuman B. abortus
mutan RB27 diperbanyak pada TSA dan dibuat konsentrasi yang pekat kemudian sedikit demi sedikit
pada waktu inkubasi konsentrasi C02 diturunkan sampai diperoleh koloni yang bertahan hidup tanpa
penambahan C02 . Koloni inilah yangdiperbanyak sebagai strain mutan B. abortus RB27 dan disimpan
dalam keadaan kering beku.

146

Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan

Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Penefti 2003

HASIL DAN PEMBAHASAN

Strain mutan Brucella abortus RB27 diperoleh dari hasil pasase perulang isolat lokal S158 pada
media TSBA dengan penambahan suplemen rifampisin, dengan proses seperti pada Gambar 1 .
f.B_..abortus
Rifampisin 25N .g/ml .
_ Rifampisin
...___.___._._.........-50N
. .a/ml
B 2a... . . ....._._
Rifampisin 75N.g/ml... j
B 3a
Rifampisin
1001,L /ml
___..
Sr 4a
Rifampi sin 150~Lg%ml
B 5a
Rifampisin 200 . Iml
' Br 5a-R
. ,.,.,..,... .,.Rifampisin ..300N ...1m1.

12B27
RB20

RifampisinL:LOTR-8/M1
.
...g/ml
Rifan' ................................
sin 300j
. ....k~ ..............

Gambar 1 . Derivasi B. abortus mutanRB27 dalam TSBA + rifampisin

Setelah B. abortus isolat lokal S 158 dipasase 5 kali dalam media TSBA dengan suplemen rifampisin
dengan konsentrasi bertingkat mulai dari 251g/ml sampai dengan 300ig/ml maka diperoleh koloni
kuman yang bersifat rough/ kasar dan koloni tersebut didesain sebagai strain Br 5a-R. Kemudian
strain Br 5a-R dipasase lebih lanjut dengan suplemen rifampisin pada konsentrasi 3001g/ml sehingga
diperoleh strain B. abortus RB. Strain RB ini kemudian dipasase lebih lanjut dengan penambahan
rifampisin pada konsentrasi yang tetap yaitu 3001g/ml sampai pasase ke 27 sehingga pada akhirnya
diperoleh B. abortus strain RB 27 yang bersifat mutan.
Penggunaan suplemen rifampisin untuk pembuatan strain mutan B. abortus RB27 padapenelitian
ini untuk mengurangi tingkat patogenitasnya . Strain brucella yang resisten terhadap rifampisin
berkurang tingkat keganasannya dibandingkan dengan kuman yang suseptibel terhadap rifampisin
(MoormanAnd Mandell,1981). Selain rifampisinuntukpembuatan strain mutan dapat pula dikombinasi
dengan penisilin seperti pada pembuatan B. abortus RB51(Schurig 1991) .
Untuk mengetahui koloni kuman brucella adalah rough atau smooth, dilakukan dengan cara
melakukan reaksi autoaglutinasi dengan cara menambahkan acriavine pada suspensi kuman brucella segar (Braun And Bonestell, 1947). Bila tetjadi reaksi aglutinasi maka koloni kuman tersebut
adalah rough . Selain dengan penambahan acriflavine, untuk mengetahui strain mutan dapat pula
dengan pewarnaan crystal violet . Strain mutan akan mengabsorbsi warna dari crystal violet tersebut
(White And Wilson, 1951).
Ketergantungan akan kondisi anaerobik sangat diperlukan untuk tumbuhnya B. abortus . Strain
lapang yang umumnya dikategorikan masih ganas biasanya mutlak memerlukan CO2 5-10% untuk
tumbuh. Strain B. abortus RB 27 pada penelitian ini telah diadaptasikan dalam lingkungan aerobik,

Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian

147

Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2003

sehingga kuman tersebut mampu untuk tumbuh tanpa penambahan CO2 5% . Tujuan dari
dihilangkannya ketergantungan akan CO dengan maksud untuk mengurangi tingkat virulensi strain
RB27, sehingga jikananti strain ini digut~ sebagai kandidat vaksin diharapkan tidak mutasi kembali
menjadi ganas .
KESIMPULAN
1. Telah diperoleh strain mutan Brucella abortus RB27 yang dipasase dari isolat lokal S158.
2. B. abortus RB27 mampu beradaptasi padakondisi aerobik .
TERIMA KASIH
Terima kasih diucapkan kepada Yth . Drh. Susan Maphilindawati Noor, MVSc yangtelah membantu
pembuatan tulisan hingga dapat dipresentasikan .
DAFTAR BACAAN
Alton, G.G., J.M. Jones, R.D . Angus And J.M. Verger. 1988. Techniques for the brucellosis laboratory.
Institute National de la Recherche Agronomique. Paris.
Braun W. And A.E. Bonestell . 1947. Independent variation of charachteristic in Brucella abortus
variants and their detection. Am.J Yet.Res. 8:386- 390.
Cheville, N..F., S.C. Olsen, A.E. Jensen, M.G. Stevens, M.V. PalmerAndA .M. Florence. 1996. Effects of
age at vaccination on efficacy ofBrucella abortus strain RB51 to protect cattle against brucellosis. Am. J. Vet.Res. 57:1153-1156.
Corner, L.A. And G.G. Alton. 1981 . Persistent of Brucella abortus strain 19 infection in adult cattle
vaccinated with reduced doses. Res. Yet. Sci. 31 :342-344.
Enright, F.M. 1990. The pathogenesis and pathobiology ofbrucella infection in domestic animals. In:
Animal Brucellosis. Eds K. Nielson and J.R. Duncan. Boca Raton. Florida, CRC Press . 301-320.
Macmillan, A. 1990. Conventional serological tests. In: K. Nielsen and J.R. Duncan (Editors). Animal
Brucellosis. CRC Press . Boca Raton, FL 301-320.
Moorman, D.R. And G.L. Mandell . 1981 . Characteristics ofrifampin resistant variants obtained from
clinical isolates of Staphylococcus aureus . Antimicrob. Agents Chemother . 20: 709-713 .
Morgan, D.R. And Mandell G.L. 1977. Characteristics of Rifampin Resistant Varians Obtained from
clinical isolates ofStaplylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 20 : 709 - 713.
Nicoletti, P. 1977. A preliminary report on the efficacy of adult cattle vaccination using strain 19 in
selected dairy herds in Florida. Proceedings. 80'Annu . Met. ZISAnimal Health Assoc. 91-100 .
NICOLETTI, P.1990. Prevalence and persistance ofBrucella abortus Strain 19 infections and prevalence ofother biotypes in vaccinated adult dairy cattle J. Am. Vet. Med. Assoc. 178 : 143 -145 .
Schurig, G.G; RM. Roop; T. Bagchi ; S. Boyle; D. BuhrmanAnd N. Sriranganathan . 1991 . Biological
properties of R135 1 ; a stable rough strain ofBrucella abortus. Yet. Microbiol. 28: 171-188 .

148

Pusat Penelitian dan Pengembangan Petemakan

Prosiding Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2003

Steven et. al . 1995 . Monoclonal antibodies to Brucella surface antigens assosiated with the smooth
lipopolysacharide complex . Am . J. Yet. Res . 45 : 967 - 971 .
White, P.G. And J .B . Wilson . 1951 . Differentiation of smooth and non-smooth colonies of brucellae .
JBact. 61 :239-240 .
Young E .J .1983 . Human Brucellosis . Rev. Infect. Dis. 5 :821-824

Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian

149