Spektrofotometri

Ultraviolet (UV)
Visibel (Vis)
Fakultas Farmasi
Universitas Ahmad Dahlan

Up-date Agustus 200

1

Hari Susanti, M.Si., A

Klasifikasi metode analisis

(Skoog, 1-2)

Table I. Physical Properties Employed for Analysis

Physical property
measured
Mass
Volume
Absorption of radiation
Vis,
NMR
Emission of radiation
ray, UV, Vis);
(x-ray,
Scattering of radiation
spectroscopy
Electrical potential

Analytical methods based

on measurement of property
Gravimetric
Volumetric
Spectrophotometry (x-ray, UV,
IR); colorimetry; atomic abs,
Emission spectroscopy (xflame photometry, fluorescence
UV, Vis)
Turbidimetry, Raman
Potentiometry

Fokus

Spektrofotometri UV-Vis

Satuan

1 = 1 angstrom = 10-10 m = 10-8 cm

1 = 1 mikron
= 10-6 m = 10-4 cm = 104
1 m = 1 milimikron = 10-9 m = 10-7 cm = 10
(Gearien,133)

1 nm = 1 nanometer = 10-9 m = 10-7 cm = 10 = 1

m
(Miller,150;Williams,1)

Panjang gelombang pada daerah UV dan Vis biasanya

dinyatakan dalam satuan nm
(Miller,150)

Daerah UV dan Daerah Vis

Daerah UV (ultraviolet)
200 400 nm (Dyer,1) dapat dideteksi dengan film
(150-72 kcal mol-1)

Sumber sinar

(Settle,485)

fotografik atau sel fotolistrik

(Diktat,5)

(Dyer,4;Settle,489;Pecsok,148;Kellner,530)

lampu hydrogen - discharge

(180 400 nm)
lampu deuterium-discharge

the high-voltage

Daerah Vis (visibel)

400 800 nm
(72-36 kcal mol-1)

Sumber sinar

(Dyer,1)

batas sensitif mata

(Diktat,4)

(Settle,485)
(Dyer,4;Kellner,530;Pecsok,148)

lampu tungsten- filament

(400 800 nm)

Radiasi elektromagnetik (1)

Radiasi elektromagnetik, atau sinar

suatu bentuk energi radiasi,
memperlihatkan sifat partikel dan gelombang
(Pecsok,115;Harvey,369)

Sifat gelombang, tergambar pada sifat optik radiasi

elektromagnetik, yaitu difraksi (Harvey,369)
Sifat partikel, atau foton, tergambar pada proses interaksi
radiasi elektromagnetik dengan zat, yaitu pada proses
penyerapan dan emisi (Harvey,369)

Interaksi antara sinar dan zat

(1)
dipantulkan

sampel

(reflection)

(Kellner dkk,528)

dihamburkan
(Scattering)

sinar dari
sumber

I
Io

menuju detektor

diserap
(absorption)

Io = intensitas sinar sebelum mengenai sampel

I = intensitas sinar yang diteruskan
Perhitungan intensitas pita serapan
menggunakan hukum Lambert dan Beer
(Dyer,5)

Interaksi antara sinar dan zat

(2)

Radiasi adalah suatu bentuk energi. Interaksi antara suatu

molekul dengan radiasi menyebabkan molekul bergerak
dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih
tinggi yaitu ke tingkat energi eksitasi (Miller,152)
Radiasi pada daerah UV dan Vis mempengaruhi transisi
elektronik. Energi yang serap pada transisi elektronik
menyebabkan terjadinya eksitasi elektron yang terdapat
pada orbital molekul ke orbital berikutnya yang
mempunyai tingkat energi yang lebih tinggi; jadi elektron
mengalami eksitasi dari tingkat dasar ke tingkat
tereksitasi (Miller,152)
Keadaan tereksitasi berlangsung sangat singkat (10-9 - 10-7
detik)
(Pecsok,121; Bair,21)
8

Interaksi antara sinar dan zat

(3)

(Miller,152)

Dalam teori : transisi elektronik tunggal

memberikan garis
tunggal yang tajam pada
spektra serapan. Ini hanya berlaku untuk molekul
dalam bentuk gas atau untuk atom dimana transisi
selain elektronik ditekan.
Untuk molekul dalam larutan, terlihat adanya pita
serapan
yang lebar pada spektra UV
yang disebabkan oleh
berbagai jenis
transisi (elektronik, vibrasi, dan rotasi) yang saling
berhubungan, dan karena interaksi solut-pelarut.

Eksitasi elektronik
(1)

Penyerapan sinar (energi) UV dan Vis oleh molekul

suatu zat organik :
disebabkan oleh eksitasi elektronik (Dyer,2)
melibatkan promosi elektron pada orbital , dan n
dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang
lebih
tinggi (Dyer,5)

Transisi elektronik () yang dilibatkan pada daerah UV

dan Vis adalah tipe-tipe berikut (Dyer,6) :
*, n *, n *, dan *

10

Yang paling banyak pada daerah UV : transisi yang

melibatkan elektron orbital n dan * (Miller,153)

Skema tingkat energi orbital molekul

(2)

11

Electronic transitions involving , and n electro

12

Analisis Kualitatif (1)

Serapan sinar UV/Vis ditentukan oleh

(Shimadzu, 4.4.1)

- Kromofor : gugus fungsional yang menyerap sinar

a.l : >C=C<, >C=O, -N=N-, -N=O,
(Shimadzu,4.4.1)

-NO2, -C=C-

mempunyai multiplet
bonding

(Miller,154)

Kromofor biasanya mengandung bond

(Miller,153)

- Ausokrom : gugus fungsional yang tidak mempunyai

serapan
a.l : -OH, -NH2, -SH (dan
derivatnya), dan
beberapa halogen (Dyer,11)

punya pasangan elektron yang tidak

terikat (Shimadzu,4.4.1)

Jika terikat dengan kromofor, gugus ini biasanya

menyebabkan pergeseran serapan ke arah yang lebih
besar dan meningkatkan intensitas puncak serapan
13
(Dyer,10-11)

Analisis Kualitatif (2)

Applikasi spektrofotometri UV-Vis untuk keperluan
analisis kualitatif adalah sangat terbatas karena
pita serapan cenderung lebar dan karenanya
informasi yang diberikan kurang detail. Walaupun
demikian, investigasi terhadap spektra pada
daerah ini seringkali memberikan informasi yang
berguna mengenai ada tidaknya gugus fungsional
(misalnya karbonil, aromatis, nitro, atau diena
terkonyugasi) pada suatu senyawa organik (Skoog,8081)

Spektra serapan UV/Vis sering digunakan pada saat

mengidentifikasi spesies molekuler. Ini sering
dilakukan dengan cara membandingkan spektrum
spesies zat sampel dengan spektrum zat yang
telah diketahui (berasal dari spektra literatur)
(Settle,497)
14

Informasi Analisis pada range UV-Vis (a)

(Kellner,531-532)

In the UV-Vis range from 200-700 nm typical (khas)

cromophores (light absorbing groups) can be
observed; groups with n *, * transitions in
molecular orbitals, d-d transitions in ligand fields
of metal chelates and charge-transfer bonds.
The omnipresent (keberadaan) -bonds in organic
compounds and also the non conjugated (isolated)
double bonds and n * transitions are not
excited in the normal UV-Vis range and thus do not
interfere
15

Informasi Analisis pada range UV-Vis (b)

(Kellner,531-532)

Absorption maxima of some

Absorption maxima of
conjugated chromophores nonconjugated
chromophores
max
Chromophor Transitio
Substances
(nm
e
n
)
-C-C *
CH3-CO-CH=CH2
225
-On *
CH2=CH-CH=CH2 217
-N<
n *

max
(nm)
150
185
195

CH3(CH=CH)3CH3

274

-S-

n *

195

CH3(CH=CH)5CH3

342

>C=O

190

CH3(CH=CH)7CH3

401

n *

C6H6

203

C6H5-CH=CH2

248

300
(weak
)

>C=C<

16

190

Analisis Kualitatif (4)

Pergeseran serapan maksimum ke arah yang
lebih panjang pergeseran batokromik
(=pergeseran merah) (Settle,486;Miller,155)
Pergeseran ini dapat disebabkan oleh terikatnya ausokrom
pada kromofor (Miller,155;Williams,7) atau perubahan pelarut (Williams,7)
Pergeseran serapan maksimum ke arah yang
lebih pendek pergeseran hipsokromik
(=pergeseran biru)
(Settle,486;Miller,155)
Pergeseran ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut
(makin polar) atau substituen pada molekul (Miller,155-156), atau
fenomena seperti hilangnya konyugasi (Williams,7)
Kenaikan instensitas serapan, misalnya karena terikatnya
ausokrom pada kromofor atau efek pelarut (makin polar)
efek hiperkromik
(Miller,155-156)
Penurunan instensitas serapan efek hipokromik
(Settle,155,486;Williams,7)

17

Analisis Kuantitatif (1)

Untuk keperluan kuantitatif :
diperlukan maks besar

agar konsentrasi larutan uji encer/kecil

larutan uji biasanya sangat encer (c 0,1 mol/L) (Kellner,528)
1 mg (jika BM 100-200) dilarutkan hingga 100 ml (Williams,2)
Jika pekat yang dipantulkan
yang dihamburkan besar, sedangkan
yang diserap
yang diteruskan : kecil
Yang dibutuhkan,
yang diteruskan : besar
nilai maksimal serapan (A) adalah 1,0
A yang digunakan : 0,2 0,8 [0,2 - 0,650 (Willard,90)]
atau T : 15 75%
Angka ini dipilih untuk meminimalkan errorr dari alat
18

Analisis Kuantitatif (2)

Untuk mengetahui apakah daerah kerja memenuhi
hukum Lambert-Beer,
dibuat kurva baku
Kurva baku digunakan jika r hitung > r tabel
kurva baku jaminan kita bekerja dengan
larutan encer
yang memenuhi hukum LamberBeer

19

Analisis Kuantitatif

(Settle,498)

(3)

Ada beberapa tehnik analisis yang dikembangkan untuk

jenis sampel berlainan. Penentuan secara langsung
dilakukan jika molekul analit memiliki suatu kromofor.
Standar harus digunakan untuk menentukan
absorbsivitas sehingga konsentrasi dapat dihitung
dengan persamaan berikut
A = a.b.c
or by establishing acalibration plot from which the
concentration can be determined by graphic
interpretation or by regretion analysis.
Penentuan secara tidak langsung umumnya dilakukan jika
molekul analit tidak memiliki a suitable chromophore.
Dalam hal ini, analit direaksikan secara kuantitatif dengan
molekul yang memiliki suatu kromofor and correlating the
diminution of absorbance with the concentration of the
analyte, atau dengan mereaksikannya dengan suatu
reagen yang dapat membentuk suatu gugus kromofor.
20

Hukum Lambert-Beer (1)

Cara menyatakan hukum Lambert-Beer :
T = I / Io = transmitan

A = log (Io/I) = absorbansi

(serapan)

- log (I/ Io) = a.b.c

- log T
= a.b.c

log (Io /I) = a.b.c

A = a.b.c

Seringkali a dinyatakan dalam ppm (mg zat/1 L

larutan).
Jika c dinyatakan dalam mol per liter, dan b dalam
cm,
a diganti dengan (koefisien ekstingsi
molar, =
molar absorptivitas = absortivitas molar)
21

(Dyer,5;Settle,487;Fritz,70-71)

Hukum Lambert-Beer (2)

(Kellner,528)

A=.b.c
dimana
A

c
b

: Absorbansi (= serapan)
: molar absorptivitas (L mol-1 cm-1)
: kosentrasi larutan (mol/L)
: tebal sel tebal kuvet tebal larutan (cm)

nilai c biasanya hanya untuk larutan encer (c

0,1 mol/L)
Jadi, Serapan (A) proporsional dengan konsentrasi
larutan
zat (c) dan ketebalan sel (b)
22

Hukum Lambert-Beer (3)

Jika BM suatu zat tidak diketahui, atau jika yang
ditetapkan berupa campuran (Williams,8), intensitas
1%
A 1%
E 1 cmsebagai
serapan dinyatakan
atau
,
1 cm
serapan larutan zat 1% dalam kuvet 1,0 cm.
Hubungannya dengan (Dyer,5):
E 1%
1 cm

10 =

X mol. berat

Contoh perhitungan
serapan :
E
325 nm = 30
1%
1 cm

Berdasarkan persamaan diatas

(Williams,8)

nilai serapan atau log (Io/I) larutan adalah

30;
dan

diukur terhadap larutan dengan kadar 1%23

ketebalan larutan 1 cm, pada 325 nm

Hukum Lambert-Beer (4)

(Skoog,87)

Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap

spektrum serapan suatu zat :
- pelarut
- pH larutan
- suhu
- konsentrasi elektrolit yang tinggi
- zat asing yang mengganggu

24

Pelarut (1)
Harus dapat melarutkan zat uji dan meneruskan
radiasi pada daerah yang digunakan (Pecsok,153)
Senyawa hidrokarbon jenuh dan senyawa yang
hanya memiliki gugus alkil jenuh, gugus alkohol, dan
gugus eter adalah transparan (tidak memberikan
serapan) pada daerah 200-1000 m

dapat digunakan sebagai pelarut pada penentuan

spektra yang melalui daerah ini (Dyer,8-9)
Pelarut paling umum untuk penentuan spektrum UV
adalah etanol 95% (Dyer,4)
Etanol absolut komersial mengandung residu
benzen
yang memberikan serapan pada daerah UV
(Williams,2)

25

Pelarut (2)
Air dan heksana juga sering digunakan

(Dyer,4)

Perbedaan pelarut dapat menggeser posisi puncak

serapan (Dyer,4). Serapan maksimum dalam larutan
etanol terjadi pada yang lebih panjang
dibandingkan dalam larutan heksana (Diktat, 31)
Pergeseran merah sekitar 10-20 nm,
dari pelarut heksana ke etanol
(Diktat, 31)

Panjang gelombang maksimum ( maks) untuk

senyawa nonpolar umumnya sama dalam pelarut
alkohol dan heksana; maks untuk senyawa polar
biasanya berbeda (bergeser) (Dyer,4)
26

Pelarut

(Kellner,532)

(3)

Solvent can interact strongly with certain

solutes and thus change the observed UV-Vis
spectra, either
by removing vibrational fine structure, or
by shifting absorption band maxima, or
both

27

Pelarut (4)

28

Pelarut (5a)

29

Pelarut (5b)

30

Pelarut (5c)

31

Analisis kuantitatif campuran

(1)

(Pecsok,137)

32

Analisis kuantitatif campuran

(2)

(Pecsok,136)

Jika sistem terdiri lebih dari satu komponen yang

menyerap,
diasumsikan :
- proses penyerapan oleh spesies tidak
tergantung spesies
yang lain
- serapan semua spesies adalah aditif
Pada serapan maksimum untuk komponen I pada 1,
terdapat serapan komponen II
Pada serapan maksimum untuk komponen II pada 2,
terdapat serapan komponen I
Spektrum serapan untuk campuran I dan II
merupakan jumlah kurva kedua komponen

33

Analisis kuantitatif campuran

(3)

(Pecsok,136-137)

Rumus Perhitungan :
Pada At 1

A11 = I1.b.cI dan AII1 = II1.b.cII

A 1 = AI1 + AII1 = I1.b.cI + II1.b.cII

Pada At 2

A12 = I2.b.cI dan AII2 = II2.b.cII

A 2 = AI2 + AII2 = I2.b.cI + II2.b.cII

A 1 = serapan campuran yang diamati pada 1

A 2 = serapan campuran yang diamati pada 2
AI1 = serapan komponen I dalam campuran pada
1
AI2 = serapan komponen I dalam campuran pada 2
I1, I2, II1 dan II2 = absorbsivitas molar
34
komponen I
dan II pada dan

Conto.

Titanium and vanadium form colored complexes with

hydrogen peroxide. Separate solutions containing 5.00
mg of these metals were treated with perchloric acid and
hydrogen peroxide and diluted to 100 ml. A third solution
was prepared by dissolving 1.00g of alloy (containing Ti
and V but no other interfering metals) ang tretig in the
same manner as the standart solution. The absorbance
of three solutions were measured at 410 and 460 nm in
1 cm cells. Calculate the % V and Ti in the alloy
Artinya???

35

Analisis kuantitatif campuran

(4b)
Hasil pengukuran : larutan
Ti
V
Alloy

(Pecsok,137-138)

A410

0,760
0,185
0,715

A460
0,513
0,250
0,657

Dari larutan standar :

ATi410 = aTi410 . b . cTi
aTi410 = 0,760/5 = 0,152
Dengan cara yang sama diperoleh :
aTi460 = 0,103, aV410 =0,037, aV460 =
0,050
Untuk larutan alloy : At 410 nm: 0,715 = 0,132CTi +
0,037CV
At 460 nm: 0,657=0,103CTi + 0,050 36
Cv

H. Tahapan Kerja Analisis (1)

1. Mencari Operating Time (OT)
Tujuan :
mengetahui waktu dimana suatu proses reaksi
berlangsung stabil
Pada saat reaksi berlangsung stabil (=pada saat OT)
diukur serapan larutan uji
Pengukuran pada saat reaksi berlangsung tidak
stabil
data yang diperoleh tidak menentu
Bagaimana mencari dan mengetahui OT ?

37

H. Tahapan Kerja Analisis (2)

2. Mencari maksimum (maks)
Tujuan :
memperoleh serapan maksimum
Serapan maksimum diperoleh jika pengukuran dilakukan pada
maks
Perubahan serapan per unit konsentrasi pada maks adalah
sangat besar (Skoog,87)
semua yang terserap larutan uji idealnya juga terukur
maksimal oleh spektrofotometer sehingga diperoleh hasil
uji yang maksimal.
maks harus dicari walaupun dalam prosedur
aslinya biasanya juga telah disebutkan (petunjuk,14)
Bagaimana mencari dan mengetahui maks ?

38

39

H. Tahapan Kerja Analisis (3)

3. Membuat kurva standar
a. Dibuat dari satu seri larutan standar - menggunakan
zat standar - dalam berbagai kadar
Zat standar = zat yang diuji (terdapat dalam larutan uji)
b. Diukur serapan satu seri larutan standar pada OT dan
maks yang diperoleh pada tahap 1 dan 2.
Serapan tiap-tiap kadar larutan standar dicatat, dicari
persamaan garis lurus dan koefisien korelasinya;
absis (X) untuk konsentrasi (c) larutan standar,
ordinat (Y) untuk serapan (A)

40

Kurva kalibrasi

41

42

H. Tahapan Kerja Analisis (4)

4. Mencari kadar zat dalam larutan uji
a. Larutan uji dalam kuvet yang telah dipersiapkan
diukur serapannya pada OT dan maks yang
telah diketahui.
Dilakukan beberapa kali pengulangan pengujian
(4 replikasi).
b). Dengan bantuan kurva standar atau persamaan
garis linier yang diperoleh dapat diketahui kadar
zat dalam sampel.

43

I. Instrumen (1)
Spektrofotometer
provide a plot of the intensity of transmitted or
absorbed light versus wavelength (Dyer,4;Settle,488)
Penggolongan berdasarkan sistem optik
-- single beam
Sistem optik -- -- single detector
-- double beam --- double detector
Pada double beam,
sumber cahaya utama terbagi menuju 2 beam :
satu menuju kuvet (mengandung larutan sampel) dan
satu menuju kuvet (mengandung pelarut referensi)
(Dyer, 4)

Yang dimiliki Farmasi UAD ?

double beam double detector (UV-1700)

44

I. Instrumen (2)

45

I. Instrumen (3)

46

I. Instrumen

(Settle,489)

(4)

47

Sumber sinar

48

49

 Filter atau monokromator

Ada beberapa cara untuk mengisolasi/mendapatkan
sinar monokromatik yang diinginkan. Salah satunya
adalah dengan menempatkan suatu filter di depan wadah
sampel
filter dapat berupa glass filter atau gelatin filter (Wratten),
yang mempunyai bandwidths yang luas dan puncak emisi
yang rendah (Hicks,26)
[Bandwidth (nm) glass filter : 150+, gelatin filter : 25-50;
Transmisi (%) glass filter : 25-90%, gelatin filter : 5-30
(Beckett,227)]
Beberapa instrumen menggunakan prisma atau diffraction
gratings sebagai monokromator (Settle,490).

50

Skema
monokromator
prisma (Pecsok,150)

51

Sampel

Sampel (molekul, ion) yang diuji pada daerah

UV atau Vis biasanya berupa gas atau larutan
dan ditempatkan dalam sel atau kuvet
(Pecsok,153,226)

52

Kuvet
Untuk Vis dari gelas atau kuarsa (quartz)
Untuk UV harus dari kuarsa

(Pecsok,153;Kellner,530)

(Fritz, 77; Dyer, 4)

Gelas menyerap sinar UV dengan kuat

(Dyer,4)

Kuvet biasanya mempunyai panjang celah 1,0 cm

(Dyer,4;Skoog,50)

Kuvet dari kuarsa atau gelas dapat dibersihkan dengan dibilas

dengan air; jika perlu, dengan larutan deterjen atau
asam nitrat panas (Pecsok,153)
Dibilas dengan etanol agar cepat kering
Dibilas untuk mencegah terjadinya penumpukan zat yang
mengabsorbsi, pada permukaan kuvet (Settle,497)

53

54

K. Blangko

(Hicks dkk., 22-23; Gearien,139)

Serapan yang terukur oleh spektrofotometer tidak

hanya serapan solut dalam larutan uji melainkan juga
semua molekul yang dilewati sinar. Karenanya dibuat
blangko, untuk mengkoreksi pantulan, hamburan
dan penyerapan oleh kuvet dan konstituen pada
larutan uji.
Blangko dibuat dengan menempatkan konstituen
(pelarut, reagen, dll) yang digunakan pada larutan uji,
ke dalam kuvet. Dengan larutan blangko selanjutnya
rekorder diatur pada posisi T = 100% atau A = 0,
pada pengujian serapan solut. Setelah itu baru
dilakukan pembacaan serapan solut dalam larutan uji.
Dengan demikian, serapan konstituen dalam larutan uji
yang diukur dapat diabaikan.
55

Detektor

56

57

Aplikasi UV/Vis

58

(Harvey, 395-398)

Bidang lingkungan
(misal : analisis berbagai logam dalam air)
Bidang klinik
(misal : analisis barbiturat dalam serum)
Bidang industri
Bidang industri farmasi : analisis antibiotika, hormon,
vitamin, analgesik)
Bidang industri lain : analisis makanan, cat, gelas,
logam
Bidang Forensik
(misal : analisis narkotika, alkohol dalam darah)

Spektrum elektromagnetik dan sinar visibel

59

Panjang gelombang dan warna sinar

60

Literatur (1)
Dyer,J.R., Applications of Absorption Spectroscopy of Organic
Compounds, Prentice-Hall, Inc., USA, 1965
Settle, F.A. (Editor), Handbook of Instrumental Techniques for
Analytical Chemistry, Prentice-Hall PTR, New Jersey, 1997
Miller,J.M dan Growther, J. B (Editors), Analytical Chemistry in a
GMP Environment, A Practical Guide, John Wiley & Sons, Inc.,
Canada, 2000.
Williams, D.H dan Fleming, I., Spectroscopic Methods in Organic
Chemistry, Edisi 5, McGraw-Hill Publishing Company, England, 1995
Bair, E.J., Introduction to Chemical Instrumentation, McGraw-Hill
Book Company, Inc., USA, 1962
Willard, H.H dkk., Instrumental Methods of Analysis, edisi 4, Litton
Educational Publishing, Inc., India, 1965
Kellner, R. dkk (Editor), Analytical Chemistry, The Approved Text to
the FECS Curriculum Analytical Chemistry, Wiley-VCH, Germany,
1998
61

Literatur (2)
Pecsok, R.L. dkk, Modern Methods of Chemical Analysis, edisi
2,John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1976
Skoog, D.A dan West, D.M., Principles of Instrumental
analysis, Holt, Rinehart and Winston, Inc., USA, 1971
Fritz, J.S dan Schenk, G.H., Quantitative Analytical Chemistry,
edisi 2, Allyn and Bacon, Inc., USA, 1969
Harvey, D., Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill
Company, USA, 2000
Gearien, J.E dan grabowski, B.F., Methods of Drug analysis,
Lea & Febiger, Philadelphia, 1969
Hicks, R. dkk., Laboratory Instrumentation, Harper & Row,
Publisher, Inc., USA, 1974
Anonim, Instruction Manual PharmaSpec UV-1700 series,
Users System Guide, Shimadzu Corporation, Japan, 2001
62