Penetapan Cemaran Mikroba

a. Penetapan Angka Lempeng Total

Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 mL larutan
pengencer (NaCL fisiologis) kemudian dilakukan pengenceran
hingga 10-6. Sebanyak 1 mL suspensi dari hasil homogenisasi pada
penyiapan sampel dipipet pengenceran 10 -1 ke dalam tabung yang
berisi pengencer PDF pertama hingga diperoleh pengenceran 10 -2
dan dikocok sampai homogen. Dibuat pengenceran selanjutnya
sampai dengan 10-6. Ke dalam setiap cawan petri yang telah diberi
suspensi sampel dituangkan 15-20 mL media PCA. Setelah media
memadat cawan petri diinkubasi pada suhu 35-37C selama 24-48
jam dengan posisi terbalik. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan
dihitung. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat
uji kontrol (blangko).
Perhitungan:
Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan
jumlah koloni antara 30-300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua
cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil
dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram sampel.
Bila ditemua jumlah koloni kurang dari 30 atau lebih dari 300, maka
diikuti petunjuk sebagai berikut:
1) Bila

hanya

salah

satu

di

antara

kedua

cawan

yang

menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, dihitung rata-rata

dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
2) Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang
berurutan menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka
dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran
kemudian

diambil

angka

rata-rata.

Jika

pada

tingkat

pengenceran yang lebih tinggi didapati jumlah koloni lebih

besar dari dua kali jumlah koloni yang seharusnya, maka dipilih
tingkat pengenceran terendah
3) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang
menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dicatat angka
sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung
sebagai Angka Lempeng Total Perkiraan
4) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan
disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka Lempeng Total
dilaporkan

sebagai

kurang

dari

satu

dikalikan

faktor

pengenceran terendah
5) Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 3000, maka cawan
dengan tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa
sektor. Jumlah koloni dikalikan dengan faktor pembagi dan
faktor

pengencerannya,

hasil

dilaporkan

sebagai

Angka

Lempeng Total Perkiraan

6) Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka
jumlah koloni adalah 200 x 8 x faktor pengenceran. Angka
Lempeng Total Perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari
jumlah koloni yang diperoleh.
b. Penetapan Angka Kapang dan Khamir
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 mL larutan
pengencer (ASA 0,05% b/v) kemudian dilakukan pengenceran
hingga 10-4. Dari masing-masing pengenceran diambil sebanyak
0,5 mL kemudian dituang pada permukaan media PDA berantibiotik
yang telah dipadatkan pada cawan petri dan segera diratkan.
Perlakuan setiap pengenceran dilakukan duplo. Cawan petri
diinkubasi pada suhu 20-250C dan diamati pada hari ketiga hingga
hari kelima. Jumlah koloni diamati dan dihitung. Sebagai kontrol
adalah medium PDA dan medium PDA dengan larutan pengencer
tanpa sampel (Anonim, 2000).
Perhitungan:

Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan

jumlah koloni antara 40-60. Jumlah koloni kemudian dikalikan faktor
pengencerannya. Untuk beberapa kemungkinan yang berbeda,
mengikuti petunjuk sebagai berikut:
1) Bila hanya salah satu di antara dua cawan petri dari
pengenceran yang sama menunjukkan jumlah koloni antara 4060, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan dikalikan faktor
pengenceran.
2) Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah
koloni lebih besar dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran
dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah.
3) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang
menunjukkan jumlah koloni antara 40-60, maka dicatat angka
sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung
sebagai Angka Kapang/Khamir perkiraan.
4) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan
disebabakan

karena

faktor

inhibitor,

maka

Angka

Kapang/Khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan

faktor pengenceran terendah.
c. Penetapan Cemaran Aflatoksin dengan Metode HPLC dan IAC
(Immunoaffinity Column)
Sejumlah 5 gram serbuk simplisia ditambah 25 mL metanol 70%
dan 0,5 gram NaCl. Selanjutnya digojog selama 1 jam, kemudian
ditambahkan 25 mL aquabides dan disaring dengan kertas
Whatman. Sebanyak 10 mL filtrat dimasukkan dalam IAC (RBiopharm) dengan laju alir 1 tetes/detik dan ditambahkan 10 mL
PBS (Phosphat Buffer Saline) pH 7,2. Lalu kolom dicuci dengan
PBS 10 mL dan dilakukan flushing udara ke kolom IAC. Sebanyak
0,5 mL metanol dimasukkan ke dalam kolom IAC dan diinkubasi
selama

menit,

selanjutnya

dialirkan

dalam

tampungan.

Penambahan metanol diulang 2 kali, sehingga didapat 1 mL eluate.

Kemudian eluate dikeringkan dengan gas nitrogen hingga kering.
Fase gerak sebanyak 1 mL ditambahkan pada eluate kering dan
divortex selama 1 menit, kemudian sebanyak 100 L eluate
diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC Shimadzu 10 AVP yang
digunakan sebagai berikut:
Kolom

: Lichrospher 100 RP-18e column 5m

Deteksi

: fluoresensi dengan ext = 350 nm, em = 450 nm

Fase gerak

: KBr-HNO3 dalam air : metanol = 60:40

Laju alir

: 1 mL/menit

Volume injeksi

: 100 L

Pembuatan larutan PBS pH 7,2 sebagai berikut: 6,49 gram

NaH2PO4 ditambah 1,31 gram Na2HPO4 dan 0,29 gram NaCl,
dilarutkan dalam 500,0 mL aquabides.
Pembuatan larutan KBr-HNO3 dalam air sebagai berikut: 99,16 mg
KBr ditambah 73 gram HNO3, dilarutkan dalam 500,0 mL
aquabides.