LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK INSTRUMENT

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

DISUSUN OLEH :
KELOMPOK 2
1) ALIFANTO DHIASTAMA

(061440410790)

2) ASTRI WIDYA SARTIKA

(061440410791)

3) DHEA ISRA ATMIKA KINTANI (061440410792)

4) DINA SAFITRI

(061440410793)

5) KATARINA PUTRI C.M

(061440410795)

6) M. ANJAS ABDUL KHOLIK

(061440410796)

7) M. RIFQI PRAKASA

(061440410797)

KELAS

: 2 EG.B

DOSEN PEMBIMBING

: Ir.KA.Ridwan, M.T.

JURUSAN TEKNIK KIMIA

PROGRAM STUDI TEKNIK ENERGI DIV
POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA
TAHUN 2014-2015

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I.

TUJUAN
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
Menjelaskan teori kromotografi cair kinerja tinggi
Mengoperasikan alat kromotografi cair dengan baik dan benar
Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan
menggunakan alat kromotografi tekanan tinggi.

II.

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Seperangkat alat KCKT/HPLC yang dilengkapi dengan injektor dan pencetak
kromotografi
Kolom Lichosphere milipore
Syringe
Penyaring milipore
Neraca analitik
Labu takar 100 ml dan 1000 ml
Pipet volume 2 ml, 5 ml, 10 ml
Corong gelas
Gelas kimia/gelas piala 100 ml, 250 ml

III.

DASAR TEORI
High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering disebut
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya
paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat
serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC
juga digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu
retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012).
Kegunaan HPLC antara lain:
- Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis
- Analisis ketidakmurnian (impurities)
- Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
- Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
- Isolasi dan pemurnian senyawa
- Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak, dan dalam skala proses industri.
(Gandjar dan Rohman, 2007)
2.3 Parameter HPLC
Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram
adalah Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (), Efisiensi dan jumlah
lempeng teoritis (N).

Resolusi (Rs)
Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu yang
minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan memberikan nilai
pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya:
Selectivity, Effieciency, dan Retention.
Faktor Retensi (k)
Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan sampel
memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar
dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum.
Faktor selektifitas ()
Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawasenyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan
interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila
kedua senyawa memiliki k atau nilai = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan.
akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka pemisahannya
akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak
(misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur
karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan
mengubah bentuk komponen
Efisiensi
Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang
diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel kolom
yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh
kapasitas dari kolom.
Lempeng teoritis (N)
Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan
jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase
gerak selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan memberikan puncak yang
lebih efisien.
(Crawford, 2011)

2.4 Instrumen

Gambar 1. Skema
Alat HPLC
a. Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada
dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi

menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu
membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar
(base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan
utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang
tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).
b. Injektor (Injector)
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan:
1) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
2) Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi
cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
3) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 L dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).
c. Kolom (Column)
Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :
1) Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 - 30
cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).
d.

Detektor
Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut:
1) Detektor spektrofotometri UV-Vis
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan
sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat
mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan
pada adanya penyerapan radiasi UV dan sinar tampak pada kisaran panjang
gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus
kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan
panjang celah optiknya 10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu
menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang
terukur.
2) Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor
universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan indeks biasnya
jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahan utamanya adalah bahwa
indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu suhu fase gerak, kolom, dan

detektor harus dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat

dilakukan pada kepekaan tinggi.
3) Detektor Elektrokimia
Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi
secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus yang dihasilkan pada proses
ini dapat diperkuat untuk menghasilkan tenaga yang sesuai. Meskipun detektor
elektrokimia cukup peka, namun ada pula kelemahannya. Adanya timbrungan
listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.
4) Detektor Photodiode-Array (PDA)
Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan.
Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada
panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses
berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya
antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan banyak
lebih banyak informasi komposisi sampel disbanding dengan detector UV-Vis.
Dengan detektor ini, juga diperoleh spectrum UV tiap puncak yang terpisah
sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang
gelombang maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan
detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan
antara spectra analit dengan spectra senyawa yang sudah diketahui.
Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA ini dapat
ditampilkan sebagai plot 3 dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu
sehingga data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada layar (monitor)
lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari perpustakaan data yang
ada di sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi
(Gandjar dan Rohman, 2007).
IV.

LANGKAH KERJA
a) Prosedur operasional instrument HPLC Thermo-Dionex
1. Terlebih dahulu siapkan fasegerak yang akan digunakan untuk analisa dan masukkan
ke botol fase gerak yang tersedia.
2. Periksa ketersediaan cairan seaiwash pada pompa, bila habis/sudah lama harapdi
tambah/ganti dengan aquabidest baru.
3. Pasang kolom sesuai kebutuhan analisa (posisi panah kolom ke arah bawah)
4. Nyalakan insirument : pompa , detector (tombol power ada dibelakang instruiment)
5. Nyalakan CPU computer dan monitor
6. Aktifkan server monitor pada pojok kanan bawah layar monitor
7. Buka sottware chromeion 6.8
8. Buka panel instrument : ( bila ada warning tekan ok )
9. Lakukan koneksi software dengan instrurnent dengan memberi tanda ceklist pada
pump dan Detektor
10. Lakukan purging pada channel fase gerak yang akan di gunakan :
- buka knob purging pada pompa
- Atur prosentasi pompa
- Klik purge pada software
11. Bila selesai purging jangan lupa tutup kembali knob purge nya
12. Alirkan kolom dgn fase gerak yang diinginkan dengan flow 1 ml/mnt
13. Nyalakan lampu UV/Vis pada detector sesuai kebutuhan analisa
14. Biarkan kolorn teraliri fasegerak selama 30 - 60 menit
15. Pindah window software ke posisi browser
16. Buat sequence,instrument method ( program ) dan prosesing data ( rincian ada pada
bagian Selanjutnya)

17. Bila sequence, program dan proses method telah dibuat , klik batch start
18. Klik ready cheek untuk memastikan sequence telah siap running , lalu start
19. Lakukan injeksi standard dan sample.
Cat : Bila ingin rneng- injek sample , posisi injector ada pada posisi LOAD { atas } .
Bila sudah ada warning waiting for injection . lalu putar injector ke posisi INJECT
20. Lakukan prosesing Data ( ada pada bagian proses Kuantitasi )
21. Bila analisa telah selesai,cuci terlebih dahulu kolom yang digunakan dengan
kandungan air :MeOH selama 30 - 60 menit
22. Akhiri pencucian kolom dengan di aliri methanol 100 %selama 30 menit
23. Matikan flow pompa dan lampu yang digunakan (lihat no.9 dan 10 )
24. Tutup software chromereon beserta server monitornya ( lihat no. 6 dan 7 )
25. Matikan instrument HpLC dan computernya.
b) Cara membuat program
1. Klik new --> Program File -- > OK
2. Klik My Computer --> HPLC --> Next
3. Masukkan konsentrasi Fasegerak yang diinginkan, dan Flow rate yang digunakan,
Next
4. Masukkan waktu Run time setiap injek --> Next
5. Masukkan panjang gelombang yang diinginkan --> Next
6. Lalu menyimpan , File --> Beri nama --> Save
c) Cara membuat sequence
1. Klik Next --> Sequence --> OK
2. Finish
V.

DATA PENGAMATAN

Fase diam
Fase gerak
Kolom
Panjang gelombang
Volume injeksi
Laju alir
Sampel
Std. Kafein 1
Std. Kafein 2

= Silika
= Methanol 40 % - Air 60 %
= AcclainTM 120
= 272 nm
= 20 L
= 1 mL/menit

Ret. Time (menit)

4,62
4,63

Area
10,946
10,954

VI.

ANALISIS DATA
Berdasarkan pratikum yang telah dilakukan, HPLC merupakan metode pemisahan
komponen dengan fase geraknya adalah liquid yang mana fase geraknya haruslah bersifat
murni, tidak bereaksi dengan wadah (packing), sesuai dengan detektor, melarutkan sampel,
memiliki viskositas rendah, bila diperlukan memudahkan sampel recorvery.
Pada praktikum HPLC atau high performance liquid chromotography dengan dua tipe
sampel yang sama diambil sebanyak lebih dari 20 L dengan menggunakan syringe, metanol
dan air dengan 40 % metanol dan 60 % air. Lalu dimasukkan kedalam injektordan mulai
melakukan injeksi sampel (sampel pada percobaan ini merupakan standard kafein). Llau mulai
melakukan prossesing data setelah dilakukannya injeksi. Adapun waktu yang diperlukan untuk
menghasilkand data yang berupa pergerakan grafik dan data lainnya seperti waktu retensi dan
area adalah waktu yang sebelumnya telah diatur sebelum melakukan percobaan. Pada
percobaan HPLC ini waktunya adalah 7 menit pada pengujian standart kafein 1 dan 5,5 menit
pada pengujian standard kafein 2.
Adapun fase diam yang digunakan pada percobaan ini adalah silika dan fase geraknya
adalah metanol 40 % dan air 60 %. Dengan kolom Acclain TM 120, panjang gelombang 272 nm,
laju alir 1 mL/menit serta volume injeksi adalah 20 L.
Grafik yang dihasilkan dari percobaan ini merupakan grafik dengan bentuk segitiga
sama kaki atau bentuk gauss. Dengan waktu retensi pada percobaan standard kafein pertama
sebesar 4,620 menit dan pada standard kafein dua 4,633 menit. Dengan besar area pada
percobaan standard kafein 1 adalah 10,946, sedangkan pada percobaan standar kafein 2 besar
areanya adalah 10,954.
Waktu yang digunakan atau diatur dalam percobaan HPLC ini merupakan waktu
perkiraan bereaksinya kedua senyawa yaitu metanol dan air. Dan pada HPLC ini sampel
haruslah beerupa liquid. Lalu, pada saat proses injeksi pemasukkan sampel diusahakan sampel
yang dimasukkan tidak disertai dengan adanya gelembung-gelembung (bubble), karena hal ini
(gelembung-gelembung) dapat menyebabkan terjadinya gangguan yang besar didalam detektro
sehingga dapat mengakibatkan data yang diperoleh tidak akurat atau bahkan tidak dapat
digunakan (the data may be useless). Untuk itu pengambilan sampel haruslah lebih banyak dari
yang diperlukan serta tidak memasukkan sempel kedalam injektor.

VII.

KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan antara lain
sebagai berikut.
1. HPLC merupakan metode pemisahan senyawa dari komponen-komponennya dan HPLC
ini merupakan jenis kromotografi yang penggunaannya paling luas yaitu dapat digunakan
dalam bidang farmasi maupun bidang pertanian
2. Terdapat dua macam jenis fasa padu KCKT yaitu, fasa normal dan fasa balik
3. Pengoperasian software HPLC cukup rumit sehingga dalam pengoperasiannya haaruslah
berhati-hati dan teliti

DAFTAR PUSTAKA

Jobsheet Pratikum Kimia Analitik Instrument. 2014-2015. Kromotografi Cair Kinerja Tinggi.
Palembang : Politeknik Negeri Sriwijaya.

GAMBAR ALAT