LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

PEMERIKSAAN AIR
Metode Most Probable Number

KELOMPOK
Eki Noerfitriyani

1306368053

Amrina Rosyada

1306368034

Tanggal Praktikum : 09 - 12 November 2015

Asisten Praktikum : Tiara Hadil
Tanggal disetujui

Nilai

Paraf Asisten

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

PROGAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN
DEPARTEMEN TEKNIK SIPIL
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2015

PEMERIKSAAN AIR
A. Tujuan
Tujuan praktikum Pemeriksaan Air adalah untuk mengetahui tingkat
pencemaran koliform terutama oleh kotoran (feaces) di lingkungan perairan Danau
Ulin dengan pengambilan sampel di inlet danau menggunakan metode Most Probable
Number (MPN).
B. Dasar Teori
1. Pemeriksaan Air
Pemeriksaan air dapat diartikan sebagai proses pengecekan kualitas dan
tingkat pencemaran pada suatu perairan yang dilakukan dengan memeriksa jenis
mikroorganisme yang terdapat didalamnya. Pemeriksaan air yang dilakukan
secara mikrobiologis dilakukan untuk menentukan kualitas dari suatu perairan.
Pemeriksaan air penting untuk dilakukan karena air merupakan penopang
kehidupan yang utama untuk semua makhluk hidup. Pencemar biologis yang
terdapat dalam air dapat berupa mikroorganisme pathogen atau penghasil racun.
Pemeriksaan biologis dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui
derajat pencemaran dari suatu perairan. Pencemaran suatu perairan dapat ditandai
dengan kehadiran dari mikroorganisme kelompok koliform. Kelompok mikroba
koliform merupakan semua Gram negatif berbentuk batang yang tidak
membentuk spora serta mampu memfermentasi laktosa dengan pembentukan
asam dan gas pada suhu 37C dalam waktu kurang dari 48 jam. Dalam
pemeriksaan mikroorganisme koliform diklasifikasikan menjadi dua jenis, yaitu
mikroorganisme kelompok koliform fekal dan kelompok non fekal. Koliform non
fekal bersumber dari hewan dan tanaman yang telah mati seperti Enterobacter
aerogenes, dan koliform fekal brasal dari kotoran manusia dan hewan seperti
Escherichia coli. Escherichia coli selain dianggap sebagai Gram negatif, tidak
membentuk spora, dan dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan
asam dan gas pada suhu 44,5C dalam waktu kurang dari 48 jam dan juga
menghasilkan indol di dalam air pepton yang berisi triptofan dan tidak dapat
menggunakan natrium sitrat sebagai sumber karbon.
Untuk mengetahui jumlah kelompok mikroorganisme koliform dalam sampel
air dapat dengen menggunakan metode Most Probable Number (MPN) atau bisa
juga dsebut sebagai Jumlah Perkiraan Terdekat (JPT). Prinsip dari metode tersebut
adalah dengan fermentasi laktosa oleh mikroorganisme koliform dalam waktu 24
jam yang jika positif koliform maka akan menunjukkan tanda keruh yang berarti

mikroorganisme menghasilkan asam dan terdapat gas yang tertangkap oleh tabung
Durham dalam tabung reaksi. Mikroorganisme koliform memiliki kemampuan
untuk menguraikan laktosa sebagai sumber karbon, sedangkan kelompok
mikroorganisme yang terdapat dalam usus lainnya tidak memiliki kemampuan
tersebut. Uji kualitatif koliform terdiri dari tiga tahapan, yaitu uji penduga, uji
penguat, dan uji pelengkap.
a. Uji Penduga (Presumtive Test)
Uji penduga merupakan uji pendahuluan untuk menentukan ada atau
tidaknya kehadiran mikroorganisme koliform yang didasarkan dengan
terbentuknya asam dan gas karena fermentasi laktosa oleh kelompok mikroba
koliform. Terbentuknya asam dapat dilihat dari kekeruhan yang dihasilkan
pada media laktosa, dan terbentuknya gas dapat dilihat dengan adanya
gelembung udara yang tertangkap dalam tabung Durham. Tabung reaksi
dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume
dalam tabung Durham. Jika inkubasi dalam waktu 24 jam dengan temperatur
37C menunjukkan hasil negatif, maka dilanjutkan hingga 24 jam. Jika dengan
waktu inkubasi selama 48 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham maka
tabung reaksi dihitung sebagai hasil negatif.
b. Uji Penguat (Confirmed Test)
Hasil tabung positif yang didapatkan dari uji penduga selanjutnya
dilakukan inolukasi dengan menggunakan jarum ose ke tabung reaksi berisi
media Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGLB). Selanjutnya tabung reaksi
diinkubasikan pada suhu 37C selama 48 jam. Sedangkan untuk pengujian
koliform fekal dilakukan dengan inkubasi pada suhu 44,5C selama 24 jam.
Pembentukan gas dalam tabung Durham menunjukkan hasil positif. Media dan
suhu inkubasi digunakan untuk membiakkan mikroba. Konsentrasi mikroba
koliform dapat dilihat dengan menghitung tabung reaksi yang menunjukkan
reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan membandingkannya dengan
tabel MPN. Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam sampel yang berbentuk cairan. Jumlah tabung positif dihitung dalam
masing-masing seri, dan enumerasi mikroorganisme dapat dilihat dengan
membandingkan hasil pada tabel MPN.
Terbentuknya gas di dalam medium Lactose Broth dan BGLB tidak selalu
menunjukkan jumlah koliform fekal karena ada kemungkinan mikroba lain
yang dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk gas seperti bakteri

asam laktat dan khamir tertentu. Oleh sebab itu, diperlukan pengujian penguat
lainnya dengan menggunakan media agar Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA) atau Endo Agar (EA). Media tersebut berupa media selektif yang
digunakan untuk mengisolasi keberadaan bakteri target. Dengan menggunakan
ose, sampel dari tabung reaksi positif diinokulasikan pada cawan dengan
goresan kuadran (streak). Kemudian cawan diinkubasikan pada suhu 37C
selama 24 jam. Pada media EMBA, sampel yang positif mengandung koliform
fekal ditunjukkan dengan perubahan warna sampel menjadi hijau metalik,
sedangkan pada media NA perubahan warna menjadi merah muda metalik.
c. Uji Pelengkap (Confirmed Test)
Dari pertumbuhan koloni pada cawan agar selanjutnya digunakan
dengan uji pelengkap untuk menentukan koliform fekal. Dari koloni yang
berwarna pada uji penguat diinokulasikan ke medium laktosa dan medium
agar miring Nutrient Agar (NA) dengan menggunakan jarum ose. Kemudian
tabung diinkubasi pada suhu suhu 37C selama 24 jam. Bila hasilnya positif
mengandung koliform fekal maka akan terbentuk asam dan gas pada medium
laktosa, sedangkan dari medum agar miring NA selanjutnya dibuat pewarnaan
Gram dimana koliform fekal yaitu Escherichia coli akan menunjukkan Gram
negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan antara bakteri
kelompok koliform dan koliform fekal maka pekerjaan dibuat duplo, dimana
satu seri diinkubasi pada suhu 37C untuk kelompok koliform, dan satu seri
diinkubasi pada suhu 44,5C untuk kelompok koliform fekal. Bakteri
kelompok koliform tidak dapat berkembang dengan baik pada suhu 44,5C.
2. Uji Indol
Indol, reagen kovaks, dan reagen indol titik digunakan untuk menentukan
reaksi indol dari bakter. Uji indol merupakan pengujian secara kualitatif untuk
menentukan memampuan dari bakteri untuk memproduksi indol dengan
deaminasi triptofan. Dalam penggunaan metode kovaks kombinasi indol, dalam
kehadiran dari media kaya triptofan. Dengan p-Dimethylaminobenzaldehyde pada
pH asam dalam alkohol akan memproduksi senyawa merah violet. Sedangkan
dalam uji titik kombinasi indol, dalam filter matriks kertas, dan pada pH asam
dengan p-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) akan memproduksi senyawa
biru kehijauan. Reagen indol titik (DMACA) diketahui sangat berguna dalam
mendeteksi produksi indol pada anggota dari Enterobacteriaceae dan spesies
anaerobik lainnya.

Formulasi

penyusun

dari

reagen

kovaks

indol

terdiri

dari

p-

Dimethylaminobenzaldehyde 50 gm, Hydrochloric Acid 37% 250 ml, dan Amyl

Alcohol 750 ml. Sedangkan penyusun reagen indol titik terdiri dari pDimethylaminobenzaldehyde 10 gm, Hydrochloric Acid 37% 100 ml, dan
Deionized Water 900 ml.
Prosedur penggunaan reagen kovaks indol adalah dengan menginokulasi
tripton atau peptone broth dengan organisme yang akan diuji. Selanjutnya adalah
menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35 derajat celsius, kemudian
memasukkan reagen kovaks ke tabung dan dihomogenkan. Jika hasil tabung
positif koliform maka akan terdapat lapisan merah pada atas larutan, jika hasil
negatif maka tidak berwarna atau berwarna kuning cerah.
Prosedur penggunaan reagen indol titik (DMACA) adalah dengan meneteskan
beberapa tetes reagen indol titik ke sebuah lapisan kertas filter. Selanjutnya adalah
menginokulasi koloni yang berasal dari media non selektif dan telah diinkubasi
selama 18-24 jam ke kertas filter. Hasil reaksi positif adalah dengan perubahan
warna dari biru menjadi biru kehijauan atau merah violet untuk jenis Providencia
alcalifaciens dalam waktu 10 detik. Untuk reaksi negatif maka kertas filter akan
tidak berwarna atau merah muda cerah. Untuk pengujian indol jika positif
mikroba Escherichia coli pada reagen kovaks indol akan menunjukan perubahan
warna merah, sedangkan pada reagen indol titik akan menunjukkan perubahan
warna biru.
Uji indol digunakan untuk mengidentifikasi dan membedakan antara
organisme Gram positif dan Gram negatif. Metode kovaks indol adalah metode
yang lebih sensitif dalam mendeteksi indol dibanding dengan uji titik. Namun
pengujian ini terbatas pada media yang digunakan. Media berisi glukosa tidak bisa
digunakan dalam uji indol karena formasi dari produk akhir asam yang dapat
mereduksi produksi indol. Agar Mueller Hinton juga tidak bisa digunakan dalam
pengujian ini karena triptofan akan hancur selama hidrolisis asam oleh kasein.
Media berwarna seperti MacConkey dan EMB merupakan sumber yang tidak
cocok dari inokulum karena potensi terbawanya zat warna dan mengganggu
penampilan dari warna indol.
3. Bioindikator Pencemaran Air
Bioindikator adalah organisme, penanda kimia, atau proses biologis dimana
merubah titik yang bisa digunakan untuk mengobservasi

perubahan kondisi

lingkungan dan digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur efek dari

polutan dalam lingkungan. Bioindikator dapat juga didefinisikan sebagai respons

stimulasi antropogenis dalam efek biomolekul, biokimia, dan fisik dalam satu atau
lebih tingkat organisme, populasi, komunitas, atau ekosistem dari sistem biologis.
a. Mikroorganisme sebagai Bioindikator
yang digunakan sebagai bioindikator adalah total koliform fekal
seperti Klebsiella, Escherichia, Citrobacter, dan Enterobacter. Koliform
merupakan sekelompok bakteri yang digunakan sebagai bioindikator dari
adanya polusi oleh kotoran. Adanya bakteri koliform dalam perairan
menunjukkan adanya bakteri yang bersifat enteropatogenik atau toksigenik
yang umumnya berbahaya bagi kesehatan manusia. Bakteri koliform
dibedakan menjadi kelompok koliform fekal seperti Eschericia coli dan
kelompok non fekal seperti Enterobacter aerogens. Bakteri yang digunakan
sebagai bioindikator sanitasi adalah bakteri Eschericia coli karena bakteri
tersebut merupakan bakteri komensalis pada usus manusia dan hewan
berdarah panas lainnya dan umumnya bukan merupakan pathogen yang dapat
menimbulkan penyakit. Eschericia coli merupakan bakteri Gram negatif
berbentuk batang pendek yang tidak membentuk spora dan merupakan
organisme yang normal berada dalam usus. Namun, beberapa Eschericia coli
ada yang bersifat patogen yaitu serotipe yang masuk ke dalam golongan E.
coli Enterohemoragik, E. coli Enteropatogenik, E. coli Enteroinvansif, dan E.
coli Enterotoksigenik. Oleh karena itu, keberadaan E. coli dalam perairan
dapat menunjukkan bahwa perairan tersebut pernah terkontaminasi oleh
kotoran manusia maupun hewan yang mungkin mengandung patogen usus.
b. Tanaman sebagai Bioindikator
atau ketiadaan dari tanaman atau kehidupan vegetatif dapat memerikan
petunjuk penting tentang kesehatan lingkungan, atau berakumulasi dengan
logam dari hasil metabolisme, sebagai contoh, total biomassa alga dalam
sistem perairan digunakan sebagai ukuran dari polusi organik dan beban
nutrisi seperti nitrogen dan fosfor. Tanaman dapat digunakan sebagai alat yang
tingkat keefektivan dan sensitivitasnya tinggi untuk menentukan atau
memprediksi perubahan lingkungan perairan. Beberapa contoh dari tanaman
air yang dapat digunakan sebagai indikator pencemaran air adalah:
1) Synechococcus leopoliensis (alga hijau-biru) dan Dunaliella dapat
menunjukkan akumulasi polusi logam berat.

2) Perubahan dalam keragaman spesies dari fitoplankton dapat digunakan

sebagai indikator pencemaran pada perairan, seperti Euglena clastica,
Phacous tortus, dan Trachelon anas.
3) Charophytes dapat ditimbulkan karena eutrofikasi. Oleh karena itu,
tanaman ini sering digunakan sebagai bioindikator dari kualitas air.
c. Hewan sebagai Bioindikator
Peningkatan atau penurunan dari populasi hewan dapat mengindikasi
kerusakan dari ekosistem. Beberapa conoh dari hewan yang digunakan sebagai
bioindikator pencemaran air adalah zooplankton seperti Alona guttata,
Moscyclopes edex, Cyclips, Aheyella.
4. Media Pertumbuhan Bakteri
Media selektif atau diferensial digunakan

untuk

mengisolasi

atau

mengidentifikasi organisme partikular. Media selektif dapat digunakan oleh

beberapa organisme untuk tumbuh, dan menghalangi dari pertumbuhan organisme
lainnya. Sebagai contoh, organisme yang dapat memanfaatkan gula dapat dengan
mudah dideteksi dengan hanya adanya gula sebagai sumber karbon utama dalam
medium. Sedangkan media diferensial digunakan untuk membedakan organisme
yang saling terkait. Dikarenakan adanya beberapa zat warna atau baham kimia
dalam media, organisme akan memproduksi perubahan karakteristik atau pola
pertumbuhan yang dapat digunakan untuk identifikasi. Media selektif dan
diferensial yang digunakan dalam mendiagnosa pencemaran air adalah:
a. Lactose Broth
Lactose Broth digunakan untuk kultivasi Salmonella dan beberapa
bakteri koliform yang terdapat dalam produk makanan, maupun perairan.
Lactose Broth sering digunakan sebegai media pre-enrichment dalam
pemeriksaan air. Pepton dan ekstrak daging yang terkandung dalam media ini
memberikan nutrisi esensial untuk metabolisme bakteri. Laktosa memberikan
sumber karbohidrat yang dapat difermentasi oleh koliform. Pertumbuhan dari
koliform akan menunjukkan adanya gas dalam uji penduga. Lactose Broth
mengandung ekstrak daging, pepton, dan laktosa. Keberadaan dari koliform
dapat dideteksi dengan adanya gas dan tabung berubah menjadi keruh setelah
inkubasi dalam uji penduga.
b. Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGLB)
BGLB digunakan untuk pengkayaan nutrisi selektif dalam metode
MPN untuk mendeteksi koliform dan fekal koliform. BGLB digunakan untuk
uji penduga dan penguat dari bakteri koliform. Oxbile dan Brilliant green akan
menghambat pertumbuhan dari bakteri Gram positif termasuk yang dapat

memfermentasi laktosa seperti Clostrida. Produksi gelembung gas dari

fermentasi laktosa dideteksi dengan kehadirannya dalam tabung Durham yang
mengindikasi adanya koliform fekal. Selain koliform non fekal juga dapat
tumbuh dalam media laktosa tapi tidak akan menghasilkan gas. BGLB
digunakan dalam uji penguat dari hasil uji penduga yang positif yang
mengghasilkan gas dalam media Lactose Broth. Pertumbuhan positif dari
Escherichia coli dalam media BGLB akan menghasilkan gelembung gas.
c. Endo Agar
Endo agar adalah sedikit media selektif dan media diferensial yang
digunakan untuk isolasi, kultivasi, dan diferensiasi dari mikroorganisme Gram
negatif dan biasanya digunakan untuk mendeteksi koliform. Koliform dapat
memfermentasi laktosa dan memproduksi koloni berwarna merah muda-merah
yang hampir sama dengan warna dari media ini. Sedangkan koloni yang tidak
memfermentasi laktosa tidak akan berubah warna atau berwarna kemerah
mudaan. Untuk pertumbuhan positif dari Escherichia coli dalam media endo
agar akan menghasilkan koloni berwarna merah muda sampai merah dengan
lapisan hijau metalik setelah inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 37 C.
d. Eosin Methylene Blue (EMB) Agar
EMB merupakan media diferensial yang digunakan untuk mendeteksi
dan mengisolasi bakteri Gram negatif. Kombinasi dari eosin dan methylene
blue digunakan sebegai indikator dan mampu membedakan antara organisme
yang memfermentasi laktosa dan yang tidak. Methylene blue digunakan
sebagai penghambat dari pertumbuhan bakteri Gram positif. Fermentasi
laktosa akan menghasilkan asam dengan pH yang rendah, hal tersebut dapat
mempercepat penyerapan warna oleh koloni sehingga menghasilkan warna
ungu gelap. Jika dalam media EMB tumbuh Escherichia coli maka akan
menghasilkan warna lapisan hijau metalik setelah inkubasi selama 24-48 jam
dengan suhu 37 C.
e. Nutrient Agar
Nutrient Agar adalah kultur media yang digunakan untuk pertumbuhan
dari berbagai varietas spesies mikroba. Nutrient Agar mengandung pepton,
ekstrak daging, dan agar yang dapat memberikan nutrien penting untuk
replikasi dari mikroorganisme. Ekstrak daging mengandung substansi larutan
air dengan karbohidrat,

vitamin, senyawa nitrogen organik, dan garam.

Pepton merupakan sumber dari nitrogen organik, asam amino, dan peptida.
Nutrient Agar digunakan dalam uji pelengkap, setelah inkubasi selama 24 jam

dengan suhu 37 C pertumbuhan Escherichia coli dapat ditandai dengan

perubahan koloni yang berwarba putih keabu-abuan.
5. Baku Mutu Air Bersih
Standar baku mutu diperlukan dalam sistem pengolahan air bersih untuk
sebagai syarat yang mengatur kualitas air supaya sesuai dengan peruntukkannya.
Baku mutu air merupakan batasan konsentrasi makhluk hidup, zat, energi, atau
komponen yang harus ada di dalamnya dan konsentrasi unsur pencemar yang
ditenggang keberadaannya dalam air. Dalam pengadaan air bersih untuk berbagai
keperluan seperti air minum dan keperluan sehari-hari lainnya harus memenuhi
persyaratan yang telah ditentukan. Di Indonesia, kualitas air minum harus
memenuhi persyaratan yang terdapat dalam Peraturan Menteri Kesehatan Nomor
492 / Menkes / Per / IV / 2010 tentang Persyaratan Kualitas Air Minum dimana
parameter mikrobiologi E. Coli dan Total Bakteri Koliform tidak diperbolehkan
berada dalamnya.
Tabel 1. Standar baku mutu air minum

Sumber: Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 492 / Menkes / Per / IV / 2010

Sedangkan berdasarkan Peraturan Pemerintah Nomor 82 Tahun 2001 tentang

Pengelolaan Kualitas Air dan Pengendalian Pencemaran Air, badan air
diklasifikasikan menjadi empat kelas yang didasarkan pada parameter
mikrobiologi sebagai berikut:
a. Kelas I, yaitu air yang dapat digunakan untyk bahan baku air minum atau
peruntukkan lainnya dengan persyaratan mutu air yang sama.
b. Kelas II, yaitu air yang dapat digunakan untuk prasarana dan sarana rekreasi
air, budidaya ikan tawar, peternakan, dan pertanian.
c. Kelas III, yaitu air yang dapat digunakan untuk budidaya ikan tawar,
peternakan, dan pertanian.
d. Kelas IV, yaitu air yang dapat digunakan untuk mengairi pertanian.
Tabel 2. Standar baku mutu air

Sumber: Peraturan Pemerintah Nomor 82 Tahun 2001

6. Aplikasi Pemeriksaan Air pada Bidang Teknik Lingkungan

Pemeriksaan air dalam bidang Teknik Lingkungan dapat dimanfaatkan dalam
pengolahan air bersih dan air limbah. Dalam pengolahan air bersih, pemeriksaan

air dengan parameter koliform digunakan untuk memeriksa sumber air baku yang
digunakan sehingga dapat dipilih pengolahan yang sesuai supaya menghasilkan
air bersih yang memenuhi persyaratan. Sedangkan dalam pengolahan air limbah,
pemeriksaan air dilakukan pemeriksaan pada limbah sehingga dapat ditentukan
instalasi pengolahan air limbah yang tepat terutama dengan pengolahan biologis
yang memanfaatkan mikroorganisme sebagai dekomposer alami, dan juga untuk
memeriksa efluen yang dihasilkan supaya memenuhi standar sehingga tidak
mencemari perairan.
C. Alat dan Bahan
1. Uji Penduga
a. Sampel air inlet Danau Ulin
b. 5 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan media Lactose Broth ganda
sebanyak 5 ml
c. 10 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan media Lactose Broth tunggal
sebanyak 5 ml
d. 1 buah pipet 5 ml, 0.5 ml, dan 0.05 ml steril
e. 2 buah pipet tip 5 ml, 1 buah pipet tip 0.5 ml, 1 buah pipet tip 0.05 ml
f. Pembakar spiritus
g. Alkohol
h. Inkubator dengan suhu 37C
2. Uji Penguat
a. 15 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan medium BGLB sebanyak 5
ml
b. Semua tabung reaksi pada uji penduga yang menunjukkan hasil positif
c. Cawan petri berisi endo agar
d. Cawan petri berisi EMB
e. Inkubator dengan suhu 37 C
f. Jarum ose
g. Pembakar spiritus
h. Alkohol
3. Uji Pelengkap
a. Cawan petri berisi EMB yang menunjukkan adanya koloni berwarna hijau
metalik
b. Cawan petri berisi endo agar yang menunjukkan adanya koloni berwarna
merah muda metalik
c. 2 buah tabung reaksi berisi Nutrien Agar miring
d. Jarum ose
e. Pembakar Spiritus
4. Uji Indol
a. Sampel air inlet Danau Ulin
b. 15 buah tabung reaksi berisi media LMX
c. 1 buah pipet 5 ml, 0.5 ml, dan 0.05 ml steril
d. 2 buah pipet tip 5 ml, 1 buah pipet tip 0.5 ml, 1 buah pipet tip 0.05 ml
e. Inkubator dengan suhu 37 C

f. Larutan Kovaks Indol

D. Cara Kerja
1. Pengenceran Sampel

Membersihkan tangan dan

meja kerja dengan alkohol
70% 2. Uji Penduga

Mengambil 0,5 ml sampel

Menginokulasikan sampel dengan cara:

Memasukkan 0,5 ml sampel

ke dalam erlenmeyer berisi
49,5 ml NaCl dan

Mengingkubasi sampel selama 24 jam suhu

37C

a. 5 ml ke 5 tabung reaksi berisi media

LB Ganda
b. 0,5 ml ke tabung reaksi berisi media
LB tunggal
c. 0,05 ml ke tabung reaksi berisi media
LB tunggal
Positif keruh
dan ada
gelembung gas
pada tabung

Negatif tidak
ada gelembung
gas pada tabung
durham

Mencatat hasil pengamatan

3. Uji Penguat

a. Tahap 1

Mensterilkan jarum ose

yang akan digunakan

Mencatat hasil pengamatan

Mengambil 1 ose dari

tabung LB yang diduga
positif

Menginokulasi ke
dalam tabung berisi
BGLB 5 ml

Positif keruh dan

ada gelembung gas
pada tabung durham

Negatif tidak ada

gelembung gas pada
tabung durham

Mengingkubasi sampel
selama 24 jam suhu
37C

b. Tahap 2

Mensterilkan jarum ose

yang akan digunakan

Mengambil 1 ose dari

tabung BGLB yang
positif dan paling
keruh

Menginokulasikan pada cawan

berisi endo agar dan cawan
berisi EMB

Mencatat hasil pengamatan, jika positif

E. Coli maka akan membentuk koloni
berwarna hijau metalik

Mengingkubasi cawan selama

24 jam suhu 44,5C

4. Uji Pelengkap
Menginokulasi ke
dalam tabung
berisi media NA
miring dengan
pola streak

Mengambil 1 ose
dari biakan
berwarna hijau
metalik

Mensterilkan jarum
ose yang akan
digunakan

Menginkubasi
selama 24 jam
dan mengamati
serta mencatat
bentuk koloni

5. Uji Indol

enginokulasikan sampel dengan cara:

Mengingkubasi sampel selama 24 jam suhu

37C

d. 5 ml ke 5 tabung reaksi berisi media

LMX Ganda
e. 0,5 ml ke tabung reaksi berisi media
LMX tunggal
f. 0,05 ml ke tabung reaksi berisi media
LMX tunggal
Positif koliform
warna sampel
biru kehijauan
Positif Terbentuk
cincin merah di atas

Negatif Tidak
ada perubahan
warna

Menghomogenk
an larutan

Meneteskan 3-4 tetes kovaks indol

Negatif tidak
terjadi perubahan
warna

Mencata hasil pengamatan

E. Data Pengamatan
1. Uji Penduga
Pengamatan
Pertumbuhan bakteri
Pembentukan asam

Ganda

Tunggal 1

Tunggal 2

Pembentukan gas

2. Uji Penguat
Pengamatan
Pertumbuhan bakteri
Pembentukan asam
Pembentukan gas

Ganda

Tunggal 1

Tunggal 2

3. Uji Pelengkap

F. Pengolahan Data
1. Total Koliform berdasarkan Uji MPN
2. Total Koliform berdasarkan Uji Indol
G. Analisis
1. Analisis Percobaan
Praktikum Pemeriksaan Air yang dilakukan pada tanggal 09-12 November
2015 ini bertujuan untuk mengetahui tingkat pencemaran koliform terutama oleh
kotoran (feaces) di lingkungan perairan Danau Ulin dengan menggunakan metode
Most Probable Number (MPN). Pengambilan sampel dilakukan di inlet danau pada 3
hari sebelum praktikum dengan menggunakan botol penyimpan berwarna gelap dan
disimpan di dalam lemari pendingin dengan tujuan supaya sampel tidak terpengaruh
oleh faktor luar seperti cahaya matahari dan suhu sampel dijaga dengan tujuan
mikroorganisme yang terdapat dalam sampel tidak mati dan tidak mengalami
pertumbuhan karena tidak berada di suhu optimumnya. Praktikum ini menggunakan
tiga pengujian yaitu, uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap. Pengujian dengan
metode MPN ini dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri yang masuk ke dalam
golongan koliform yang mampu memfermentasi laktosa dari sampel air. Praktikum
dimulai dengan melakukan pengenceran sampel sampai faktor pengenceran 10-2
dengan cara mengambil 0,5 ml sampel dan melarutkannya pada 49,5 ml larutan NaCl.

Sampel diencerkan terlebih dahulu karena sampel yang digunakan diduga

mengandung banyak mikroorganisme. Untuk uji penduga, pertama praktikan
melakukan pemipetan sampel 5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung
berisi 5 buah tabung dengan media Lactose Broth ganda sebanyak 5 ml dan tabung
Durham, pemipetan 0,5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5
buah tabung dengan media Lactose Broth tunggal sebanyak 5 ml dan tabung Durham,
dan pemipetan 0,05 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah
tabung dengan media Lactose Broth tunggal sebanyak 5 ml dan tabung Durham.
Tabung Durham berfungsi untuk menangkap gelembung gas yang dihasilkan dari
proses metabolisme mikroorganisme. Media Lactose Broth digunakan dalam uji ini
karena mengandung nutrisi dalam bentuk pepton untuk mendukung pertumbuhan
bakteri. Bakteri koliform mampu memfermentasi laktosa sehingga indikasi adanya
bakteri koliform dapat diduga dari pengujian ini dengan adanya gelembung gas dan
larutan berubah menjadi keruh. Dalam proses inokulasi, setelah tutup tabung reaksi
dibuka maka harus selalu didekatkan dengan pembakar spiritus supaya kondisi septis
dan tidak ada bakteri atau kontaminan dari luar yang dapat mempengaruhi sampel.
Setelah diinokulasikan kemudian sampel dihomogenkan dan selanjutnya diinkubasi
ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37C. Suhu 37C merupakan suhu
optimum bakteri koliform untuk dapat bermetabolisme. Setelah 24 jam praktikan
mengamati tabung reaksi yang dinilai positif koliform dengan ciri terbentuk
gelembung gas dan menjadi keruh, jika dalam 24 jam menunjukkan hasil negatif,
maka waktu inkubasi dilanjutkan selama 48 jam dan jika tidak terbentuk gas dalam
tabung Durham maka tabung reaksi dinyatakan negatif. Hasil positif menunjukkan
adanya bakteri dalam sampel yang dapat memfermentasi laktosa dalam media.
Pengujian penguat dilakuakan dengan tujuan untuk memastikan adanya
bakteri koliform dalam sampel. Pertama praktikan mensterilkan jarum ose dengan
cara membakarnya dengan pembakar spiritus sampai membara, kemudian
mencelupkan ke dalam alkohol, dan membakar sebentar untuk menghilangkan
alkohol dan diangin-anginkan. Kemudian praktikan mengambil 1 ose dari tabung
reaksi berisi medium Lactose Broth yang menunjukkan positif koliform dan kemudian
masing-masing diinokulasikan ke dalam tabung berisi media Brilliant Green Bile
Lactose Broth (BGLB). Media BGLB digunakan untuk uji penduga dan penguat dari
bakteri koliform. Oxbile dan Brilliant green akan menghambat pertumbuhan dari
bakteri Gram positif sehingga yang tumbuh adalah bakteri Gram negatif yang mampu

memfermentasi laktosa. Pengerjaan inokulasi harus selalu dilakukan dekat pembakar

spiritus dan jarum ose harus disterilkan setiap penggunaan untuk masing-masing
tabung. Setelah semua tabung Lactose Broth positif selesai diinokulasikan ke dalam
tabung BGLB, kemudian tabung diinkubasi ke dalam inkubator dengan suhu 37C
selama 24 jam. Suhu ini dipilih karena bakteri koliform dapat bermetabolisme.
Setelah 24 jam kemudian praktikan memeriksa tabung yang memberikan reaksi
positif dengan adanya gelembung gas. Selanjutnya jumlah tabung yang positif dari uji
penguat dihitung perkiraan jumlah koloni per 100 ml dengan menggunakan tabel
MPN.
Terbentuknya gas dalam media Lactose Broth dan BGLB tidak selalu
menunjukkan jumlah koliform karena ada kemungkinan terdapat mikroba lainnya
yang mampu memfermentasi laktosa dengan membentuk gas. Oleh karena itu, uji
penguat dilakukan juga dengan media agar Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) dan
Endo Agar (EA). Penggunaan media tersebut dikarenakan mampu mengisolasi
keberadaan bekteri koliform. Dalam uji ini, pertama praktikan mensterilkan jarum
ose, kemudian mengambil 1 ose dari tabung BGLB yang positif dan paling keruh.
Selanjutnya adalah menginokulasikan ose pada cawan berisi media endo agar dan
cawan berisi media EMB dengan pola streak dimana bakteri diinokulasikan dengan
tidak terputus. Selanjutnya kedua cawan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu
44,5C. Penggunaan suhu ini adalah untuk mendeteksi keberadaan bakteri E. coli
dalam sampel karena bakteri tersebut aslinya berada di dalam kolon hewan berdarah
panas. Membedakan antara E. coli dan lainnya dengan menggunakan medium
berwarna adalah warna bakteri E. coli tergantung pada mediumnya karena E. coli
memiliki enzim yang dapat mensubstrat zat warna. Untuk pertumbuhan positif dari
Escherichia coli dalam media endo agar akan menghasilkan koloni berwarna merah
muda sampai merah dengan lapisan hijau metalik. Sedangkan pada media EMB
positif tumbuh Escherichia coli maka akan menghasilkan warna lapisan hijau metalik.
Selanjutnya adalah dilakukan uji pelengkap, yaitu dengan mengisolasi dan
mengkultivasi bakteri di dalam media Nutrient Agar. Dari pertumbuhan yang
dihasilkan cawan kemudian praktikan mengambil dengan jarum ose yang telah
disterilkan pada bagian ujung pola streak dengan tujuan bakteri yang terambil sedikit
dan dapat mudah diamati morfologinya. Kemudian praktikan menginokulasikan ose
ke dalam tabung reaksi berisi NA miring dengan pola streak dan menginkubasi

tabung selama 24 jam. Pertumbuhan Escherichia coli dapat ditandai dengan

perubahan koloni yang berwarba putih keabu-abuan.
Selain menggunakan metode MPN, dalam praktikum ini juga digunakan
metode uji indol untuk menentukan koliform dalam sampel. Uji indol digunakan
untuk mengidentifikasi dan membedakan antara organisme Gram positif dan Gram
negatif.

Pertama

praktikan

melakukan

pemipetan

sampel

ml

dan

menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media

LMX ganda sebanyak 5 ml, pemipetan 0,5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1
seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media LMX tunggal sebanyak 5 ml, dan
pemipetan 0,05 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah
tabung dengan media LMX tunggal sebanyak 5 ml. Kemudian tabung diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37 C. Jika tabung positif koliform maka larutan akan
berubah menjadi biru kehijauan dan jika negatif koliform maka tidak da perubahan
warna. Untuk menguatkan keberadaan koliform dalam sampel, setelah diinkubasi
kemudian praktikan meneteskan reagen kovaks kedalam tabung dan dihomogenkan.
Jika hasil tabung positif koliform maka akan terdapat lapisan merah pada atas larutan,
jika hasil negatif maka tidak berwarna atau berwarna kuning cerah.
2. Analisis Hasil
3. Analisis Kesalahan
H. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
2. Saran
I. Daftar Pustaka
Lane, W. McCoy. Indole Test Reagents. Hardy Diagnostics. Santa Maria, CA.
1998.
Jain, Akanksha et.al. Exploring Biodiversity as Bioindicators for Water
Pollution. Department of Botany Banaras Hindu University. Varanasi. 2010.
J. Lampiran
1. Bagan Salah
2. Bagan Benar
3. Lembar Data Pengamatan