1

BAB I
PENDAHULUAN
A.

LATAR BELAKANG

Perkembangan Kromatografi gas sebagai tekhnik analisis berjalan dengan suatu

ledakan teknologi yang membawa revolusi dalam peralatan ilmiah. Pada akhir tahun1960-an
para analis menjadi terbiasa dengan pemisahan campuran yang sangat rumit dalam beberapa
menit atau bahkan detik dengan hasil yang sangat baik, dengan integrasi elektronik untuk
mendapatkan luasan di bawah pita elusi maupun keluaran komputer dari analisis yang
sempurna. Kuantitas nanogram, gram dan bahkan kadang-kadang pikogram, dapat dideteksi
pada beberapa kasus yang mudah (1 nanogram = 10 -19 gram; pikogram = 10-12 gram). Adalah
bisa bagi penggunaan GC tidaklah tepat, untuk menginginkankemampuan yang serupa dengan
kromatografi cair. Meskipun kromatografi gas memiliki kecepatan dan sensitivitas serta fungsi
yang lebih dibanding teknik kromatografi kolom cair dalam mendeskripsikan pemisahan suatu
senyawa, namun GC hanya proses distribusi satu fasa sajalah yang berperan penting, dimana
hanya terdapat antaraksi cairan stasioner ditambah dengan parameter-parameter operasi
temperatur dan laju reaksi. Dalam GC, perilaku molekul yang terlarut dalam fasa uap tidak
bergantung pada kehadiran gas lainnya. Berbeda dengan LC, zat yang terlarut berinteraksi
kuat dengan dengan cairan fasa bergerak, dimana interaksi fasa stasioner berpengaruh besar
terhadap pengendalian retensi yang tidak terdapat dalam GC.
Perkembangan teknologi yang terus meningkat, menjelaskan bahwa LC kini kurang
efisisen dalam penggunaannya, terutama dalam mendeteksi pemisahan pada sampel yang lebih
kecil. Teknik LC yang sekarang dianggap merupakan kromatografi cair klasikal awalnya
menggunakan pendekatan dengan menggunakan permukaan relatif diantara kolom dan aliran
dasar yang kecil dibawah kebutuhan gravitasi atau tekanan yang rendah. Kekurangan LC yang
lainnya yaitu waktu pemisahan yang memerlukan beberapa jam, pengumpulan fraksi yang
harus dilakukan dengan pemisahan analising, penggunaannya yang belum otomatis, dan
masih belum sesuai dengan sampel yang lebih kecil yang harus ditingkatkan kecepatannya,
serta segala hal yang perlu diubah pada LC dengan pendekatan-pendekatan yang lebih
modern.
Sebagai LC modern, HPLC muncul untuk meminimalisasi pekerjaan, kemampuan
teknolgi, dan teori untuk memandu pengembanagn pada jalur yang rasional. ( Pada beberapa
tulisan HP pada HPLC diartikan tekanan tinggi(high pressure) dan beberapa lainnya yang
menghubungkan dengan masalah biaya bisa berpikir bahwa HP adalah singkatan dari biaya
tinggi(high price) tetapi kebanyakan HP itu berarti penampilan yang tinggi(high
performance).
Dengan kelebihannya, HPLC sendiri diantaranya digunakan pada proses pemisaha
dan pengukuran untuk menghasilkan senyawa atau bahan dengan mudah dalam beberapa
menit. HPLC diharapkan dapat memudahkan pemisahan-pemisahan senyawa yang lebih baik
dalam komponen-komponen pada campuran.
B.

TUJUAN

Pada pembahasan ini diberikan beberapa tujuan, yakni :

Mengetahui latar belakang beralihnya penggunaan LC sebagai pemisahan komponen
cair hingga menjadi HPLC.
2.
Mengetahui prinsip dasar HPLC.
3.
Mengetahui instrumen-instrumen dari HPLC.
4.
Menjelaskan cara kerja instrumen HPLC.
5.
Mengetahui manfaat serta beberapa aplikasi penggunaan HPLC.
C. RUMUSAN MASALAH
Adapun rumusan masalah yang diberikan yaitu :
1.
Bagaimana latar belakang penggunaan HPLC sebagai pengganti LC daalam pemisahan
komponen cair ?
2.
Jelaskan prinsip dasar penggunaan HPLC!
3.
Sebutkan instrumen-instrumen dari HPLC!
4.
Jelaskan cara kerja instrumen HPLC!
5.
Jelaskan beberapa aplikasi penggunaan HPLC!
1.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A.

LATAR BELAKANG PENGGUNAAN HPLC SEBAGAI PENGGANTI LC

HPLC (High Performance liquid Chromatography) merupakan teknik dari aplikasi
LC (Liquid Chromatography) yang efisiensinya tinggi, baik daya pemisahan, dan kecepatan
analisisnya. HPLC memiliki efisiensi yang sepadan dengan GLC (Gas Liquid
Chromatography), dimana fasa bergerak memiliki kecepatan yang tinggi. HPLC juga
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan
tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu.
LC sendiri merupakan bentuk kromatografi kolom dalam biokimia dan analisis
kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan menunjang. Terdapat beberapa
jenis LC (Liquid Chromatography) secara umum yakni:
1.
LSC (Liquid Solid Chromatography)
LSC termasuk kromatografi cair klasik yang kurang efisien terutama karena
memerlukan waktu yang lama dalam menganalisis. Proses dasarnya pada LSC ini adalah
metode adsorbsi murni, sebagai contoh silika maupun alumina dimasukkan kedalam kolom
dan dielusi dengan larutan yang cocok.
2.

LLC (Liquid Liquid Chromatography)

Dengan proses dasarnya adalah partisi. Teknik LLC ini tergantung pada partisi zat
padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak
sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi
cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi
gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak

a.

kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi
partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah
dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert.
Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase
Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari
KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar
dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
Kekurangan LC sendiri sebagai kromatografi cairan kolom klasik yaitu bahwa fasa
cair yang bergerak mengalir secara lambat lewat kolom hanya dengan gravitasi. Metode
maupun teori LC seperti LLC dan LSC memiliki ciri efisiensi kolom yang rendah dan waktu
pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan
hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh
Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 10 7 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam
metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi
(sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali
lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa.
Kelebihan dari HPLC dibandingkan LC konvensional
HPLC menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair
klasik, antara lain:
Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang
dari 5 menit bisa dicapai. Hal ini disebabkan karena HPLC dilengkapi dengan pompa yang
menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan
konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu yang
digunakan lebih sedikit. Pada pompa dikenal dua system dalam teknik pemisahan yaitu
isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masing-masing pompa
mengatur laju alirlarutanyangberbeda.
b.
Waktu retensi dapat ditentukan dengan mudah : yakni waktu yang dibutuhkan
senyawa untuk melalui kolom hingga ke detector dan diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.waktu retensi ini biasanya dipengaruhi oleh : tekanan
yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat,
temperature , dan kolom.
c.
Resolusi : Berbeda dengan GC, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada GC, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan fasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
d.
Daya pisahnya baik

e.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC

dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacammacam zat. HPLC mempunyaibeberapa detektor yakni detektor fluoresensi,
elektrokimia dan fluorometrik yang dapat mendeteksi jumlah sampai picogram
(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC.
f.
Peka : kepekaan sangan bergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan.
g.
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang
bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi
yakni dengan direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang
sesuai.
h.
Keunggulan kolom HPLC: yakni kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil
dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC 4.6 mm sehingga
dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas dan mempengaruhi
kesempurnan pemisahan yang lebih baik. Panjang kolom HPLC sendiri adalah
150-250 mm.
i.
Dapat menganalisis zat dengan molekul besar dan berionik : zat zat yang tidak
bisa dianalisis dengan GC karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk
menganalisis spesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion sangat
cocok untuk mengalisis zat zat tersebut.
j.
Dapat menghitung sampel dengan kadar yang rendah : hal ini bergantung pada
detektor yang digunakan, namun deyektor HPLC dapat mendeteksi zat sampai
dengan kadar ppt (part per trillion)
k.
Mudah rekoveri (memperoleh kembali) sampel : Umumnya detektor yang
digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan
mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
Sebagai gambaran berikut serangkaian instrumen HPLC

Gambar 1. Dionex DX-500 High Performance Liquid Chromatography

B.

PRINSIP DASAR HPLC

Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan

menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat
molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada
bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini,
selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masingmasing komponen tersebut secara kuantitatif.
1.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk
identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan
larutan standar.
2.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
a.
Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
b.
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
c.
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan
larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
d.
Berdasarkan area kromatogram
e.
Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.
C.

INSTRUMEN DARI HPLC

Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC dapat
dilihat pada diagram blok HPLC berikut :

Gambar 2. Diagram Blok HPLC

1.

Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven
yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa
gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari
semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
2.

Pompa
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada
dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan
konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
a.
Pompa reciprocating.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),
oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan

garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.
b.
Pompa syringe
memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Gambar 4. 4 Port Internal Sample Injector

Gambar 3. HPLC Pump

3.

Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a.
Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b.
Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c.
Loop
Valve: TipeColumns
injektor iniumumnya
digunakan
untuk4.6mm
menginjeksi
A. Analytical
50 to 300mm
lengths,
i.d. volume lebih
besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
B. Short Columns 10 or 50mm lengths, 4.6mm i.d.
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
C. Narrow-Bore
Columns
50 to 300mm
lengths,
i.d.bila VALVE
Pada
posisi LOAD, sampel
diisikedalam
loop pada
kinerja3.0mm
atmosfir,
Smaller i.d.maka
significantly
usage. Compatible with
difungsikan,
sampel akanreduces
masuk kesolvent
dalam kolom.

both APCI and ESI.

Berikut digambarkan
sampel and
injektor
pada HPLC
yaitu 50 to 300mm lengths,
D. Capillary
LC/MS
Columns

150m-2.1mm i.d.
Small-bore columns compatible with LC/MS instrumentation.
E. Preparative Columns 50 to 300mm lengths, 7-50mm i.d.
High volume and mass loading capacity.
F. PEEK Columns 50 to 300mm lengths, 2.1, 4.6mm i.d.
Complete Bio-compatibilty and IC applications
G. Guard Cartridges 7.5mm length 2.1, 3.2, 4.6mm i.d.
The Guard System has disposable cartridges for quick and easy
replacement.

4. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
a.
Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah
50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada
yang 5 cm.
b.
Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada
model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid
Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography
(EC).
Berikut beberapa contoh kolom yang digunakan dalam HPLC

pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak
(untuk detektor visibel). Kelebihan dari detektor ultrsviolet yaitu :

sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi

mudah operasinya

digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic.

dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang

gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis
cuplikan yang diukur.

Detektor polarografi dan radioaktif

Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran.
b.

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:

1)Detektorspektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara
luas. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang
sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi.

5. Detektor (Detector)
Adalah suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang
modern. Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).

a.
1)

2)

Berikut detektor yang digunakan pada HPLC

Klasifikasi detektor
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul
sampel maupun fase gerak (bulk property detector) yaitu:
Detektorindeksbias
merupakan detektor yang luas penggunaannya. Dasarnya ialah pengukuran
perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi
komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada
HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan
sangat peka terhadap perubahan suhu.
a) Detektor konduktivitas
b) Detektor tetapan dielektrika
Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (solute
property detector) terdiri atas
a) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,

Detektor-detektor
fotometer
(uv-vis
dan
inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan

Gambar 5. Detektor Spektrofotometri

3)

DetektorFluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis
yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di
sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan
sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang
sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor
sambil menahan radiasi eksitasinya. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan
fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon
aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obatobatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor
pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan
menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian

asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen

fluoresamin (fluorescamin).

Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya
didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :

cukup sensitive

stabilitas dan keterulangan tinggi

respon linear terhadap solute

waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir

relibilitas tinggi dan mudah digunakan

tidak merusak cuplikan

6.

Gambar 6. DetektorFluorometrik

Pengolahan Data
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar berikut ini :

3) Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan
untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa
organik maupun anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki
sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang
diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami
reaksi transfer electron.

Gambar 3.2 : Kromatogram Dari Senyawa 5 Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Ini
bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja
dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan
konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif

Gambar 7. Detektor elektrokimia

c.Desaindetector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan
kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa
pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa
mikroliter.
d. Pemilihan detektor

D.

LANGKAH ANALISA INSTRUMEN HPLC

Mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection
hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa
sampel ke kolom dalam tekanan tinggi. Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah

dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron.
Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan
dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di
bawah peak agar dapat mengetahui kadar analit.
Rumus perhitungannya adalah y = b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan
least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC
untuk analit, kita harus membuat kurva terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.
Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai fungsi
dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam. Hal ini sesuai
dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai dengan prinsip tersebut
maka komponen yang hidrofob dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi,
sedangkan komponen yang hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol
rendah. Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruang pembuangan dari HPLC ini
dicuci.
E.

APLIKASI PENGGUNAAN INSTRUMEN HPLC

Berikut beberapa aplikasi pada penggunaan instrumen HPLC yaitu :

Analisis Anion Nitrat (NO3-)
Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau
bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri.
Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu
diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut.
Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode
dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model
pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen
campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat
menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan
sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.
2.
Analisis Vitamin C
Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni
dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933
oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari
USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk
oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi.
Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi
menjadi diketogulonic acid yang inaktif.
1.

Gambar 7. Susunan vitamin C

Keadaan vitamin C inaktif ini sering terjadi pada proses pemanasan (bila sayursayuran dimasak). Di dalam suasana asam vitamin ini lebih stabil daripada dalam basa yang
menjadi inaktif (diketogulonic acid) (Prawirokusumo, 1991).
3.
Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae
Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder
golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat
yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp terdapat
komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol,
heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan
berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan
selektifitas (resolusi) yang tinggi. Dalam hal ini, dibutuhkan cara eluasi gradient dengan
program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada
umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa metabolit
sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip pasangan ion.
Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi Sampel analisis HPLC
dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi dengan pelarut bahan
sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan dengan rotavapor sampai
diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia, diperoleh suatu ekstrak total.
Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam metanol ( 10X), kemudian
dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan
sejumlah 20 ul ke HPLC.

dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber
yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan
Karanganyar.
6.
Uji kemumian sejumlah 277 obat/bahan obat diantaranya
a.
Tablet Asetazolamida
b.
Asetilsistein
c.
Larutan Asetilsistein
d.
Asam Folat
e.
Tablet Asam Folat
f.
Asam Mefenarnat
g.
Kapsul Asam Mefenamat
h.
Asiklovir
i.
Tablet Allopurinol
j.
dll
Gambar 8. Senyawa Curcumin

BAB III
PENUTUP
A.

4.

Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang
menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya menilai
sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian
dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara kimia
basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah ini perlu dilakukan
suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan untuk menentukan
mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.
5.
Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman
Obat
Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain
melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier
Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan
melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan
HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat
diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara
penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri hasil
pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).
Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama
dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin
yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo

KESIMPULAN

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom

yang sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. Ada dua tahap dalam analisis dengan
menggunakan HPLC yaitu proses separasi/pemisahan dan identifikasi. HPL memilki
kelebihan dibanding kromatografi cair konvensional yakni waktu analisis yang cepat, waktu
resensi yang mudah ditentukan,tingkat reolusi yang tinggi, detector yang amat peka serta
kelebihan lainnya yang menyebabkan bergesernya L menjadi HPLC.
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kuantitatif dan penentuan
kualitatif. Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah
jenis kolom, komposisi eluen (jenis dan perbandingan), volume injeksi (volume sampel loop),
kolom, detektor, dan chart speed (bila manual).
HPLC memberikan peranan yang besar dalam kehidupan, antara lain: banyak
digunakan pada industri farmasi dan pestisida, zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara
sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair, asamasam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom
butiran berlapis zat berpori, dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air ;
digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia lainnya.