Tugas Mikro Hanip Ridho Saputra

TUGAS MIKROBIOLOGI
RANGKUMAN UJI MIKROBIOLOGI DALAM FARMAKOPE

INDONESIA IV
Disusun Oleh:
Nama
: Hanip Ridho Saputra
Nim
: 08061381320033
Kelas
: A
Dosen Pembimbing
: Laida Neti Mulyani, M.Si
PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2015
UJI BATAS MIKROBA
Pengujian batas mikroba dilakukan untuk mengetahui jumlah mikroba aerob

viable pada semua jenis perbekalan farmasi seperti bahan baku hingga sediaan jadi.
Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu bahan atau sediaan memenuhi
spesifikasi mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan Pengerjaannya
harus
secara aseptik. Jika tidak dinyatakan lain, jika disebut inkubasi, maka yang
dimaksud adalah menempatkan wadah didalam ruangan terkendali secara termostatik
pada suhu antara 30 dan 35 C selama 24 jam sampai 48 jam. Istilah tumbuh
ditujukkan untuk pengertian adanya kemungkinan adanya perkrmbangan mikroba
viable.
Uji pendahuluan
Uji pendahuluan dilakukan untuk mengetahui apakah media dan prosedur yang
akan digunakan untuk melakukan uji batas mikroba dapat menumbuhkan mikroba
atau tidak. Uji pendahuluan dilakukan dengan menginokulasi spesimen uji dengan
biakan viable yang terdiri dari Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa dan Salmonella.
Cara pengujian:
1. 1 mL biakan mikroba dari enceran 10-3 biakan umur 24 jam Tambahkan kedalam
2. Enceran pertama spesimen uji (dalam dapar fosfat pH 7,2, Media Fluid SoybeanCasein Digest atau Media Fluid Lactosa Medium
Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba pada media, maka pengujian tersebut
dinyatakan tidak berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan
(1) meningkatkan volume pengencer dengan tetap mempertahankan jumlah bahan uji,
atau
(2) menambahkan zat inaktivator dengan jumlah secukupnya ke dalam pengencer,
atau
(3) suatu kombinasi modifikasi (1) dan (2) sedemikian rupa hingga terdapat
pertumbuhan inokulum.
Contoh zat yang dapat menjadi inaktivator yaitu lesitin kedele 0,5 % dan
polisorbat 20 4,0%. Jika hasil tidak terdapat pertumbuhan mikroba ulangi pengujian
menggunakan Media Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 untuk
menetralisasi pengawet atau bahan antimikroba lainnya. Jika masih tidak dapat
menumbuhkan mikroba viabel maka kegagalan isolasi mikroba dapat disebabkan oleh
daya bakterisida dari sediaan.
Larutan Dapar dan Media
Pada pembuatan media, perlu diperhatikan dengan sangat hati-hati karena media
sangat penting dalam proses pertumbuhan mikroba. Media berisi nutrisi yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba, mikroba juga sangat rentan pertumbuhannya
terhadap pH sehingga pH media perlu dijaga agar media dapat menumbuhkan
mikroba secara optimal
Larutan Dapar Fosfat Ph 7,2

Dilarutkan 34 g kalium fosfat monobasa P dalam +- 500ml air di dalam labu
terukur 1000 ml; tambahkan +- 175 ml natrium hidroksida 1 N ukur pH hingga pH

7,20,1. Tambahkan air sampai tanda dan campur. Masukkan dalam beberapa wadah
dan sterilkan. Simpan dalam
lemari pendingin. Sebelum digunakan, encerkan 1
bagian larutan dengan 800 bagian air, dan sterilkan.
Media
Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam
autoklaf. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan. Berikut ini macammacam media yang biasa digunakan untuk uji mikroba, yaitu:
Media FCDSLP
Digesti pankreatik kasein P
Lesitin kedele
Polisorbat 20 P
Air
Prosedur :
20 g
5g
40 ml
960 ml
Larutkan digesti pankreatik kasein P dan lesitin kedele di dalam 960 ml air, panaskan
dalam tangas air pada suhu 48 sampai 50 selama lebih kurang 30 menit hingga
larut. Tambahkan 40 ml polisorbat 20 P, campur dan masukkan dalam wadah sesuai.
Media SCDA (Soybean-Casein Digest Agar Medium)

Digesti papaik tepung kedele P
Natrium klorida P
Agar P
Air
pH setelah sterilisasi 7,3 0,2
15,0 g
5,0 g
5,0 g
15,0 g
1000 ml
Media FSCD (Fluid Soybean Casein Digest Medium)

Siapkan seperti pembuatan Soybean-Casein Digest Medium seperti yang tertera pada
Uji Sterilitas
Media MSA(Mannitol-Salt Agar Medium)
5,0 g
Digesti peptik jaringan hewan P
5,0 g
Ekstrak Daging P
1,0 g
D-Mannitol P
10,0 g
Natrium klorida P
75,0 g
Agar P
15,0 g
Merah fenol P
0,0025 g
Air
1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,4 0,2.
Prosedur :
Campur dan panaskan sambil sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit hingga
melarut.
Media BPA(Baird-Parker Agar Medium)
10,0 g
Ekstrak daging P
5,0 g
Ekstrak ragi P
1,0 g
Litium klorida P
5,0 g
Agar P
20,0 g
Glisin P
12,0 g
Natrium piruvat P
10,0 g
Air
950,0 ml
Prosedur :
Panaskan sambil sering dikocok dan didihkan selama 1 menit. Sterilkan, dinginkan
sampai suhu antara 45 sampai 50 dan tambahkan 10 ml larutan kalium telurit P steril
(1 dalam 100) dan 50 ml emulsi kuning telur. Campur secara hati-hati, dan tuang ke
dalam cawan.
Media VJA (Vojel-Johnson Agar Medium)
10,0 g
Ekstrak ragi P
5,0 g
Mannitol P
10,0 g
Kalium fosfat dibasa P
5,0 g
Litium klorida P
5,0 g
Glisin P
10,0 g
Agar P
16,0 g
Merah fenol P
25,0
Air
1000 mL
Prosedur :
Didihkan bahan padat yang telah dilarutkan selama 1 menit. Sterilkan, dinginkan
hingga suhu antara 45 dan 50 dan tambahkan 20 ml larutan kalium telurit P steril (1
dalam 100).
Media CETA (Cetrimide Agar Medium)

Digesti pankreatik gelatin
Magnesium klorida P
Kalium sulfat P
Agar P
Steril trimetilamonium bromida P
20,0 g
1,4 g
10,0 g
13,6 g
0,3 g
(setrimida)
Gliserin P
Air
10,0 ml
1000 ml
Prosedur :
Larutkan semua bahan padat di dalam air dan tambahkan gliserin P. Panaskan sambil
sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
Media PAF (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Fluorescin)

Kalium fosfat dibasa anhidrat
Magnesium sulfat P
10,0 g
10,0 g
1,5 g
1,5 g
(MgSO4.7H2O)
Gliserin P
10,0 ml
Agar P
15,0 g
Air
1000 ml
Prosedur :
Larutkan semua bahan padat di dalam air sebelum ditambahkan gliserin P. Panaskan
sambil sering di kocok, dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin)

20,0 g
Magnesium klorida anhidrat
1,4 g
Kalium sulfat anhidrat
10,0 g
Agar P
15,0 g
Gliserin P
10,0 ml
Air
1000 ml
Prosedur :
Larutkan semua bahan padat di dalam air sebelum ditambahkan gliserin P. Panaskan
sambil sering di kocok, dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
Media FLM (Fluid Lactose Medium)
Ekstrak daging P
3,0 g
5,0 g
Laktosa P
5,0 ml
Air
1000 ml
pH setelah sterilisasi 6,9 0,2. Dinginkan sesegera mungkin setelah sterilisasi.
Media FSCM (Fluid Selenite-Cystine Medium)
5,0 g
Laktosa P
Natrium fosfat
Natrium selenit asam
L-sistin P
Air
4,0 g
10,0 g
4,0 g
10,0 g
1000 ml
pH akhir 7,0 0,2
Prosedur :
Campur dan panaskan hingga larut. Panaskan di dalam uap air mengalir selama 15
menit. Tidak boleh disterilkan.
Media FTM (Fluid Tetrathionate Medium)

Digesti peptik jaringan hewan
P
Garam empedu P
Kalium karbonat P
Natrium tiosulfat P
Air
Prosedur :
2,5 g
2,5 g
1,0 g
10,0 g
30,0 g
1000 ml
Didihkan larutan bahan padat. Pada hari penggunaan, tambahkan larutan yang dibuat
dengan melarutkan 5 g kalium iodida P dan 6 g iodium P di dalam berlian P (1 dalam
1000), dan campur. Media tidak boleh dipanaskan sesudah penambahan larutan hijau
berlian.
Media BGA (Brilliant-Green Agar Medium)
Ekstrak ragi P
3,0 g
5,0 g
5,0 g
Laktosa P
10,0 g
Natrium klorida P
5,0 g
Sukrosa P
10,0 g
Merah fenol P
80 mg
Agar P
20,0 g
Hijau berlian P
12,5 mg
Air
1000 ml
Prosedur :
Didihkan larutan bahan padat selama 1 menit. Sterilkan sesaat sebelum digunakan,
lelehkan media, tuang ke dalam cawan petri dan biarkan hingga dingin.
Media XLDA (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar Medium)

Xylosa P
L-Lisina P
Laktosa P
Sukrosa P
Natrium klorida P
Ekstrak ragi P
Merah fenol P
Agar P
Natrium desoksikolat P
Natrium tiosulfat P
Besi (III) amonium sitrat P
Air
3,5 g
5,0 g
7,5 g
7,5 g
5,0 g
3,0 g
80 mg
13,5 g
2,5 g
6,8 g
800 mg
1000 ml
pH akhir 7,4 0,2
Prosedur :
Panaskan campuran bahan padat dan air sambil diaduk, hingga tepat mencapai titik
didih. Tidak boleh dipanaskan berlebihan atau disterilkan. Pindahkan segera ke dalam
tangas air dan biarkan pada suhu lebih kurang 50, dan tuang ke dalam cawan setelah
dingin.
Media BSA (Bismuth Sulfite Agar Medium)
Ekstrak daging P
5,0 g
5,0 g
5,0 g
Dekstrosa P
5,0 g
Natrium fosfat
4,0 g
Besi(II) sulfat P
300 mg
Indikator bismut sulfit
8,0 g
Agar P
20,0 g
Hijau berlian P
25 ml
Air
1000 ml
pH akhir 7,6 0,2
Prosedur :
Panaskan campuran bahan padat dan air sambil diaduk, hingga tepat mencapai titik
didih. Tidak boleh dipanaskan berlebihan atau disterilkan. Pindahkan segera ke dalam
tangas air pada suhu lebih kurang 50, dan tuang ke dalam cawan setelah dingin.
Media TSIA (Triple-Sugar-Iron-Agar Medium)
Digesti peptik jaringan hewan
10,0 g
10,0 g
P
Laktosa P
10,0 g
Sukrosa P
10,0 g
Dekstrosa P
1,0 g
Besi(II) amonium sulfat P
200 mg
Natrium klorida P
5,0 g
Natrium tiosulfat P
200 mg
Indikator bismut sulfit
8,0 g
Agar P
13,0 g
Merah fenol P
25 mg
Air
1000 ml
Media MCA (MacConkey Agar Medium)
17,0 g
1,5 g
1,5 g
Laktosa P
10,0 g
Campuran garam empedu
1,5 g
Natrium klorida P
5,0 g
Agar P
13,5 g
Merah netral P
30 mg
Kristal violet P
1,0 mg
Air
1000 ml
Prosedur :
Didihkan campuran bahan padat dan air selama 1 menit hingga larut.
Media LEMBA (Levine Eosin-Methylen Blue Agar Medium)
Agar P
Laktosa P
10,0 g
2,0 g
15,0 g
10,0 g
Eosin Y P
Biru metilena P
Air
400 mg
65 mg
1000 ml
Prosedur :
Larutkan digesti pankreatik gelatin P, kalium fosfat dibasa P dan agar P di dalam air,
hangatkan dan biarkan hingga dingin. Sesaat sebelum digunakan, cairkan larutan agar
yang berbentuk gel, dan untuk tiap 100 ml larutan agar yang telah meleleh tambahkan
berturut-turut 5 ml larutan laktosa P(1 dalam 5), 2 ml larutan eosin Y P ( 1 dalam 50),
dan 2 ml larutan biru metilena P (1 dalam 300), dan campur. Media yang diperoleh
tidak jernih.
Media SDA (Sabouraud Dextrose Agar Medium)
Dekstrosa P
40,0
Campuran sama banyak Digesti peptik
g
10,0
jaringan hewan dan Digesti pankreatik
kasein p
Agar P
15,0
Air
g
1000
ml
Media PDA (Potato Dextrose Agar Medium)

Kentang
Agar P
Glukosa P
300g
15 g
20 g
Prosedur :
Masak 300 g kentang yang telah dikupas dan dipotong-potong di dalam 500 ml air
suling, saring melalui penyaring katun kasar, tambahkan air suling hingga 1000 ml,
dan tambahkan agar dan glukosa. Sesaat sebelum dituang ke dalam cawan, terhadap
media yang telah mencair dan didinginkan hingga 45 C , pH diatur hingga 3,5 0,1
menggunakan larutan asam tartrat P steril (1 dalam 10). Media dengan pH 3,5 tidak
boleh dipanaskan lagi.
PROSEDUR UJI BATAS MIKROBA
1. Pengambilan Contoh
Siapkan 10 ml atau 10 g contoh untuk setiap uji seperti yang tertera pada
masing-masing monografi.
2. Prosedur uji batas mikroba
Spesimen yang akan diuji disiapkan sesuai dengan sifat fisiknya dan tidak
mengubah jumlah dan jenis mikroba yang semula ada hingga diperoleh larutan
suspensi dari semua atau sebagian spesimen dalam bentuk yang sesuai dengan
prosedur uji yang akan dilaksanakan.

Untuk bahan padat yang tidak semuanya melarut, perkecil ukuran bahan
hingga men jadi serbuk cukup halus, suspensikan dalam pembawa tertentu,
dan lakukan pengujian.

Untuk spesimen cair yang terdiri dari larutan, suspensi dalam air atau suatu
pembawa hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk
bahan padat yang mudah larut dan praktis larut sempurna di dalam 90 ml
dapar fosfat pH 7,2 atau media tertentu dan lakukan pengujian seperti tertera
pada
Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Eschericia coli.

Untuk cairan tidak campur air, salep, krim dan malam dibuat suatu suspensi
dengan menggunakan emulgator steril yang sesuai dalam jumlah yang
minimal, gunakan blender mekanik dan jika perlu hangatkan hingga suhu tidak
lebih dari 45 C dan lanjutkan pengujian. seperti yang tertera pada Angka
Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas
aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Eschericia coli.

Untuk spesimen cair bentuk aerosol, dinginkan wadah dalam campuran
alkohol dan es kering selama lebih kurang 1 jam, buka tutup wadah dan
biarkan hingga mencapai suhu kamar, dan biarkan propelan terbebas, atau
hangatkan wadah untuk mendorong propelan keluar.
Pindahkan sejumlah tertentu bahan uji yang diperlukan untuk pengujian. Jika
10 g atau 10 ml spesimen tidak dapat diperoleh dari 10 wadah dalam bentuk
aerosol, pindahkan seluruh isi dari 10 wadah yang diinginkan ke dalam media
biakan, biarkan propelan terbebas, dan lanjutkanpengujian menggunakan
residu.
Jika hasil pengujian tidak dapat disimpulkan atau meragukan, ulangi pengujian
dengan menggunakan 20 wadah atau lebih.
Angka Mikroba Aerob Total

Untuk spesimen yang cukup melarut dapat diuji dengan metode lempeng, jika
tidak dapat melarut gunakan metode tabung ganda. Untuk spesimen kental yang pada
pengenceran awal (1:10) tidak dapat dipipet, encerkan spesimen hingga diperoleh
suspensi (1:50) atau (1:100), dan seterusnya hingga dapat dipipet. Lakukan pengujian
untuk menetapkan tidak terdapatnya zat penghambat (zat antimikroba). Masukkan
spesimen ke dalam media tidak lebih dari 1 jam setelah membuat enceran yang sesuai
untuk inokulasi.
Metode Lempeng.
Encerkan cairan hingga 1ml cairan dapat menghasilkan 30-300 koloni. Pipet 1
ml enceran akhir masing-masing ke dalam 2 cawan petri steril. Tambahkan 15-20 ml
media SCDA cair. Tutup cawan petri, campur contoh dan agar dengan cara
dimiringkan atau diputar cawan, dan biarkan hingga memadat. Balikkan cawan dan
inkubasi selama 48-72 jam. Amati pertumbuhan dalam lempeng, hitung jumlah koloni
dari kedua lempeng nyatakan rata-rata jumlah mikroba tiap g atau ml spesimen. Jika
tidak ditemukan koloni dalam cawan dengan enceran awal (1:10), nyatakan hasil
pengujian sebagai: kurang dari 10 mikroba per g atau ml spesimen.
Metode Tabung Ganda.
Tambahkan 9 ml media FSCD dalam masing-masing 14 tabung yang
berukuran sama. Pisahkan 12 tabung dan bagi dalam 4 kelompok yang masing-masing
terdiri dari 3 tabung. Satu kelompok sebagai kontrol dan 3 kelompok lain sebagai:
kelompok 1 (100), kelompok 2 (10), kelompok 3 (1), dan 2 tabung lainnya
dinyatakan sebagai tabung A dan tabung B. Masukkan dan campur 1 ml larutan atau
suspensi spesimen pada masing-masing tabung kelompok 1 dan tabung A. Pipet 1 ml
dari tabung A ke tabung B dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing akan
berisi 100 mg dan 10 mg spesimen. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 2
tambahkan 1 ml dari tabung A, dan dalam masing-masing tabung kelompok 3
tambahkan 1 ml dari tabung B. Buang sisa dari tabung A dan B. Tutup semua tabung
dan inkubasi. Amati adanya pertumbuhan dalam tabung, ketiga tabung kontrol akan
tetap jernih, dan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan di kelompok 1, kelompok 2,
dan kelompok 3 menggunakan acuan pada tabel 1, nyatakan Nilai Duga Terdekat
(MPN) mikroba tiap g atau ml spesimen.
Tabel 1 Nilai Duga Terdekat pada Metode Tabung Ganda
Kombinasi tabung yang menunjukkan pertumbuhan pada tiap
kelompok yang diamati
Jumlah spesimen dalam mg atau ml tiap tabung
100 mg
10 mg
1 mg
(0,1 ml)
3
(0,01 ml)
3
(0,001 ml)
3
Nilai Duga Terdekat

(MPN) mikroba tiap g
atau ml
>1100
1100
500
3
3
3
2
0
3
200
290
210
150
3
3
2
1
0
3
90
160
120
70
3
3
1
0
0
`3
40
95
60
40
23
Uji Koagulase
Digunakan untuk menguji Staphylococcus aureus. Dengan sengkelit, koloni

dipindahkan dari media VJA ke dalam masing-masing tabung beri 0,5 ml plasma
mamalia. Inkubasi dalam tangas air suhu 37, amati tabung pada jam ke 3 dan
selanjutnya pada jarak waktu yang sesuai selama 24 jam. Lakukan uji kontrol positif
dan negatif bersamaan dengan uji spesimen. Jika tidak terjadi koagulasi, spesimen
dinyatakan bebas Staphylococcus aureus.
Uji Oksidase Dan Pigmen
Digunakan untuk Pseudomonas aeruginosa. Dengan menggunakan sengkelit,
koloni dipindahkan dari media CETA masing-masing ke permukaan media PAF untuk
deteksi fluoresin dan media PAP untuk deteksi piosiani yang terdapat dalam cawan
petri. Jika koloni yang dipindahkan banyak, bagi permukaan tiap lempeng menjadi 4
bagian, tiap bagian diinokulasi dengan koloni yang terpisah. Tutup dan balikkan
media dan inkubasi pada suhu 352 selama tidak kurang dari 3 hari. Amati
permukaan cawan di bawah cahaya ultraviolet untuk menetapkan adanya sifat khas
dari koloni seperti pada tabel 3.
Lakukan uji oksidase terhadap koloni pada satu atau lebih media. Pindahkan
koloni ke atas potongan kertas saring yang sebelumnya telah diimpregnasi dengan
N,N-dimetil-p-fenilendiamina dihidroklorida. Jika tidak terjadi perubahan warna
merah muda menjadi lembayung, spesimen dinyatakan memenuhi syarat bebas
Pseudomonas aeruginosa, dapat dikonfirmasi dengan uji biakan lain dan uji biokimia
yang sesuai.
Uji Salmonella sp. Dengan sengkelit, pindahkan sebagian media FSCM dan
media FTM masing-masing ke permukaan media BGA, media XLDA, dan media
BSA pada cawan petri. Tutup cawan, balikkan, dan inkubasi. Jika tidak terdapat koloni
dengan pemerian seperti pada tabel 4, spesimen dinyatakan memenuhi syarat bebas
dari Salmonella. Jika terdapat koloni gram negatif berbentuk batang yang sesuai
seperti deskripsi pada tabel 4, identifikasi dilanjutkan dengan memindahkan koloni
yang diperlukan ke media TSIA menggunakan sengkelit jarum dengan menggoreskan
ke media, kemudian tusuk ke dasar media, dan inkubasi. Jika tidak terjadi reaksi alkali
(merah) di permukaan dan asam (kuning) pada tusukan, dengan atau tanpa warna
hitam pada tusukan sebagai penanda adanya hidrogen sulfida, spesimen dinyatakan
bebas dari genus Salmonella.
Uji Escherichia coli. Dengan sengkelit, goreskan sebagian dari sisa media
FLM pada permukaan media MCA, tutup cawan, balikkan, dan inkubasi. Amati, jika
tidak terdapat koloni dengan pemerian pada tabel 5, spesimen memenuhi syarat bebas
Escherichia coli. Jika terdapat koloni, lanjutkan pengujian dengan memindahkan
koloni ke permukaan media LEMBA pada cawan petri. Jika koloni yang dipindahkan
banyak, bagi permukaan tiap lempeng menjadi 4 bagian, tiap bagian diinokulasi
dengan koloni terpisah. Tutup cawan, balikkan, dan inkubasi. Jika tidak terdapat
koloni yang menunjukkan kilauan logam khas di bawah cahaya yang dipantulkan dan
warna biru hitam pada cahaya yang diteruskan, spesimen dinyatakan memenuhi syarat
bebas Escherichia coli, dapat dikonfirmasi dengan uji biakan lain dan uji biokimia
yang sesuai.
Angka kapang dan khamir. Lakukan metode lempeng seperti pada angka
mikroba aerob total, kecuali penggunaan jumlah yang sama Media SDA atau media
PDA sebagai pengganti Media SCDA. Inkubasi cawan dengan tidak dibalik, pada
suhu 20 sampai 25 selama 5-7 hari. Untuk tujuan konfirmasi, dapat dilakukan uji
ulang dengan 25 g spesimen. Lakukan seperti pada prosedur dengan memperhatikan
jumlah spesimen yang lebih besar.
Tabel 2 Ciri khas morfologi Staphylococcus aureus pada Media Agar Selektif
Media Selektif
Ciri khas morfologi koloni
Vogel Johnson
Hitam dikelilingi zona kuning
Agar Medium
Mannitol Salt
Pewarnaan Gram
Positif, berbentuk bulat dalam
tandan
Kuning dengan zona kuning
Agar Medium

tandan
Baird Parker
Hitam, berkilau, dikelilingi
Agar Medium
zona jernih 2 sampai 5 mm

tandam
Tabel 3 Ciri khas morfologi Pseudomonas aeruginossa pada Media Agar Selektif
dan diagnostik
Media
Ciri khas
Cetrimide
Umumnya
Agar Medium
kehijauan
Pseudomonas
Umumnya
Agar Medium
tidak berwarna
Untuk deteksi
hingga ke-
Fluoresin
kuningan
Pseudomonas
Umumnya
Agar Medium
kehijauan
Fluoresensi
Uji oksidase
Pewarnaan
morfologi
di bawah cahaya
gram
koloni
Kehijauan
ultra violet
Positif
Negatif, berbentuk
batang
Kekuningan
Positif
Negatif, berbentuk
batang
Biru
Positif
Negatif, berbentuk
batang
Untuk deteksi
piosianin
Tabel 4 Ciri khas morfologi Salmonella sp pada Media Agar Selektif
Media
Pemerian koloni
Brillian Green
Kecil, transparan, tidak berwarna
Agar Medium
atau merah muda hingga putih buram
Xylose-
Merah, dengan atau tanpa pusat
Lysine-
berwarna hitam
Desoxycholat
e
Agar Medium
Bismuth
Hitam atau hijau
Sulfite
Agar Medium
Tabel 5 Ciri khas morfologi Escherichia coli pada MacConkey Agar Medium
Ciri khas morfologi
Merah bata, dapat dikelilingi daerah
koloni
yang terdiri dari endapan empedu
Pewarnaan Gram
Negatif, berbentuk batang atau

batang bulat
UJI EFEKTIVITAS PENGAWET ANTIMIKROBA

Pengawet zat yang ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi sediaan
terhadap kontaminasi mikroba. Pengawet digunakan pada wadah dosis ganda.
Pengawet tidak boleh digunakan semata-mata untuk menurunkan jumlah mikroba
viabel sebagai pengganti cara produksi yang tidak baik. Penggunaan harus diusahakan
kadar yang digunakan serendah mungkin. Pengujian dalam farmakope dimaksudkan
untuk menguji efektivitas pengawet yang ditambahkan pada sediaan dosis ganda yang
dibuat dengan dasar atau bahan pembawa cairan.
Mikroba uji yang digunakan yakni Candida albicans (ATCC No.10231),
Aspergillus
niger
(ATCC
No.16404),
Escherichia
coli
(ATCC
No.8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 6538) dan dapat juga digunakan mikroba lain
jika dianggap dapat merupakan kontaminan selama penggunaan sediaan tersebut.
Media yang digunakan yakni SCDM
Inkubasi biakan bakteri pada suhu 30 hingga 35 selama 18-24 jam, jamur
pada suhu 20 sampai 25 selama 1 minggu. Sebagai alternatif, mikroba dapat
ditumbuhkan dalam media cair dan panenan sel dengan cara sentrifugasi, dicuci dan
disuspensikan dalam larutan natrium klorida P 0,9% hingga angka mikroba atau spora
yang dikehendaki.
Jika wadah sediaan dapat ditembus secara aseptik dengan jarum suntik melalui
sumbat karet, uji dilakukan pada 5 wadah asli sediaan. Jika tidak dapat ditembus,
pindahkan 20 ml sampel ke dalam masing-masing 5 tabung bakteriologik tertutup,
gunakan campuran inokulasi dengan perbandingan 0,10 ml inokula setara dengan 20
ml sediaan. Mikroba uji ditambahkan antara 100.000 dan 1.000.000 per ml. Inkubasi
wadah pada suhu 20 sampai 25, amati tabung hari ke 7, 14, 21, dan 28. Catat
perubahan, tetapkan jumlah mikroba viable dan hitung perubahan kadar dalam persen
tiap mikroba selama pengujian.
Penfsiran hasil. Suatu pengawet dinyatakan efektif jika jumlah bakteri pada
hari ke 14 berkurang hingga tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal, jumlah kapang
dan khamir viable selama 14 hari pertama tetap atau kurang dari jumlah awal, dan
jumlah tiap mikroba uji selama hari tersisa dari 28 hari pengujian adalah tetap atau
kurang dari bilangan yang disebut sebelumnya.
UJI STERILITAS
Pengujian digunakan untuk bahan, sediaan, alat sesuai dengan farmakope yang
dipersyaratkan harus steril.
Hasil yang diterima menunjukkan bahwa tidak ada
kontaminasi mikroba ditemukan dalam sampel di bawah kondisi pengujian.

Media Dan Suhu Inkubasi
Media untuk pengujian dapat dibuat seperti tertera di bawah ini atau setara
dengan media komersil yang memenuhi syarat Uji Fertilitas Aerob, Anaerob dan
Kapang. Media berikut adalah media yang sesuai untuk uji sterilitas. Media Cair
Tioglikolat terutama digunakan untuk pertumbuhan bakteri anaerob, termasuk juga
untuk mendeteksi bakteri aerob. Soybean-Casein Digest Medium sesuai untuk
pertumbuhan kapang dan bakteri aerob.
Media Cair Tioglikolat
L-Sistin P
Natrium klorida P
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P
Agar P
Yeast extract (larut dalam air)
Pancreatic digest of casein
Natrium tioglikolat P atau
Asam tioglikolat P
Larutan natrium resazurin P (1 dalam 1000) dibuat
segar
Air murni
0,5 g
2,5 g
5,5/5,0g
0,75 g
5,0 g
15,0 g
0,5 g
0,3 ml
1,0 ml
1000 ml
Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu 30 - 35.Untuk sediaan yang

mengandung pengawet raksa yang tidak dapat diuji menggunakan metode
Penyaringan membran, Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu 20 - 25 sebagai

pengganti Soybean Casein Digest Medium
Soybean-Casein Digest Medium
Pancreatic digest of casein
17,0 g
Papaic digest of soybean meal
3,0 g
Natrium klorida P
5,0 g
2,5 g
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P
2,5/2,3 g
Air murni
1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,3 0,2 diinkubasi pada 22,5 2,5.
Media untuk Golongan Penisilin dan Sefalosporin

Jika media uji sterilitas akan digunakan pada metode Inokulasi langsung ke
dalam Media Uji seperti tertera pada Uji Sterilitas Sediaan, modifikasi pembuatan
media, baik Media Cair Tioglikolat maupun Soybean Casein Digest Medium
sebagai berikut: Masukkan secara aseptik pada setiap wadah media sejumlah laktamase untuk menginaktifkan sejumlah antibiotic dalam zat uji. Tetapkan jumlah laktamase yang diperlukan untuk menginaktifkan antibiotic menggunakan sediaan laktamase yang sebelumnya sudah diuji inaktivasi daya hambat dari penisilin atau
sefalosporin. Media yang telah mengandung laktamase dapat juga digunakan untuk
pengujian dengan metode penyaringan membran
Galur Mikroba Uji yang sesuai untuk penggunaan Uji Fertilitas dan Uji
kesesuaian metode
Bakteri Aerob
Staphylococcus aureus
:ATCC 6538; CIP 4.83; NCTC 10788; NCIMB 9518; NBRC

13276
Bacillus subtilis
Pseudomona aeruginosa1
Bakteri Anaerob
Clostridium sporogenes2
ATCC 6633; CIP 52.62;NCIMB 8054; NBRC 3134

ATCC 9027; NCIMB 8626;IP 82.118; NBRC 13275
ATCC 19404; CIP 79.3; NCTC 532 atau ATCC 11437;
NBRC 14293
Kapang
Aspergillus brasiliensis
(Aspergillus niger)
ATCC 16404; IP 1431.83 MI 149007; NBRC 9455
Uji Fertilitas untuk Aerob, Anaerob dan Kapang

Inokulasikan sejumlah Media Cair Tioglikolat dengan sejumlah mikroba
berikut (tidak lebih dari 100 koloni), menggunakan sejumlah media terpisah untuk
setiap spesies mikroba: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, dan
Staphylococcus aureus. Inokulasikan sejumlah Media Tioglikolat Alternatif dengan
sejumlah Clostridium sporogenes (tidak lebih dari 100 koloni).
Inokulasikan sejumlah Soybean Casein Digest Medium dengan sejumlah
mikroba berikut (tidak lebih dari 100 koloni) menggunakan sejumlah media terpisah
untuk setiap spesies mikroba: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis dan Candida
albicans. Inkubasi tidak lebih dari 3 hari untuk bakteri dan tidak lebih dari 5 hari untuk
kapang.
Cairan Pengencer Dan Pembilas Untuk Penyaringan Membran

Cairan A
Cara pembuatan :
Larutkan 1 g peptic digest of animal tissue dalam air hingga 1 liter, jika perlu
saring atau sentrifus hingga jernih, atur pH hingga 7,1 0,2. Bagikan ke dalam
wadah-wadah, dan sterilisasi menggunakan proses yang telah divalidasi.
Cara Pembuatan untuk Penisilin atau Sefalosporin
Jika perlu tambahkan secara aseptik pada larutan diatas, sejumlah -laktamase
steril yang cukup untuk menginaktifkan aktifitas residu antibiotik pada membrane
setelah larutan uji disaring
Cairan D
Cara pembuatan
setiap liter Cairan A tambahkan 1 ml polisorbat 80 P, atur pH hingga 7,1 0,2,

sterilisasi menggunakan proses yang telah divalidasi. Gunakan cairan ini untuk bahan
uji yang mengandung lesitin atau minyak, atau untuk alat kesehatan yang beretiket
lumen steril.
Cairan K
Larutkan 5,0 g peptic digest of animal tissue; 3,0 g beef extract dan 10,0 g
polisorbat 80 P, dalam air hingga 1 liter. Atur pH hingga setelah sterilisasi pH 6,9
0,2. Bagikan ke dalam wadah-wadah, dan sterilisasi menggunakan proses yang telah
divalidasi.
Uji Sterilitas Sediaan
Jumlah Bahan yang Diuji
Jika isi tiap wadah mencukupi (Tabel 2), isi wadah dapat dibagi sama banyak dan
ditambahkan pada media yang sesuai. uji sterilitas menggunakan dua atau lebih media
yang sesuai. Jika isi wadah tidak cukup untuk masing masing media, gunakan jumlah
dua kali dari yang tertera pada Tabel 3. Pengujian terhadap contoh uji dapat dilakukan
menggunakan teknik Penyaringan Membran atau Inokulasi Langsung ke dalam Media
Uji. Gunakan juga kontrol negatif yang sesuai.
Tabel 2 Jumlah Minimum yang Digunakan untuk Tiap Media
Isi per wadah
Jumlah
minimum
yang
digunakan
(Kecuali dinyatakan lain)

Larutan
Kurang dari 1ml
1 40 ml
Seluruh isi tiap wadah

setengah isi tiap wadah, tetapi tidak
Lebih dari 40 ml,

Lebih dari 100 ml
kurang dari 1 ml
tidak lebih dari 100 ml 20 ml
10% isi wadah, tetapi tidak kurang dari
20 ml
Larutan antibiotik
1 ml
Sediaan larut dalam air lainnya atau dalam Seluruh isi tiap wadah, sebanding dengan
isopropyl miristat
tidak kurang dari 200 mg
Sediaan yang tidak larut, krim,dan salep, yang Gunakan isi tiap wadah yang sebanding
tersuspensi atau teremulsi
Zat Padat
Kurang dari 50 mg
50 mg atau lebih, tetapi kurang dari 300mg
dengan tidak kurang dari 200 mg

Seluruh isi tiap wadah
Setengah isi tiap wadah, tetapi tidak
kurang dari 50 mg
300 mg 5 g
150 mg
Lebih besar dari 5 g
500 mg
Benang bedah dan peralatan bedahlainnya untuk 3 potongan untuk helai (panjang tiap
penggunaan dokter hewan
potong 30 cm)
Pembalut/ kapas/perban (dalam kemasan)

100 mg per kemasan
Benang bedah dan bahan sejenis yang dikemas Seluruh alat
untuk penggunaan sekali pakai
Alat Kesehatan lainnya
Seluruh alat, potong kecil kecil atau

diuraikan
Tabel 3 Jumlah Minimum Bahan yang diuji sesuai dengan Jumlah Bahan dalam
Bets
Jumlah wadah dalam Bets*
Jumlah Minimum wadah yang diuji tiap

media (Kecuali dinyatakan lain**)
Sediaan parenteral
Tidak lebih dari 100 wadah
10% atau 4 wadah, diambil yang lebih
Lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 wadah

Lebih dari 500 wadah
besar
10 wadah
Untuk sediaan volume besar
kecil
kecil
Zat Padat antibiotik
Produk ruahan dalam kemasan <5g
20 wadah
Produk ruahan dalam kemasan >5g
6 wadah
Produk ruahan dan campuran
lihat Produk ruahan padat
Sediaan mata dan sediaan lain yang tidak disuntikkan
Tidak lebih dari 200 wadah
Lebih dari 200 wadah
besar
10 wadah
Jika
sediaan
dalam
bentuk
wadah
dosis
tunggal,gunakan
skema diatas untuk sediaan parenteral
Benang bedah dan peralatan bedah lainnya untuk 2% atau 5 kemasan, diambil yang lebih
penggunaan dokter hewan
besar,
sampai
total
maksimum
20
Tidak lebih dari 100 bahan
kemasan
10% atau 4 bahan,diambil yang lebih
Lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 bahan

Lebih dari 500 bahan
besar
10 bahan
2% atau 20 bahan, diambil yang lebih
kecil
Produk ruahan padat

Sampai 4 wadah
Tiap wadah
Lebih dari 4 wadah, tetapi tidak lebih dari 50 20% atau 4 wadah, diambil yang lebih
wadah
Lebih dari 50 wadah
besar
besar
*Jika besarnya bets tidak diketahui, gunakan jumlah maksimum
**Jika isi satu wadah cukup untuk diinokulasikan ke dalam dua media, kolom ini
menyatakan jumlah wadah yang diperlukan untuk kedua media.
PENYARINGAN MEMBRAN
Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 m yang
telah terbukti efektif menahan mikroba. Teknik pengujian di bawah ini menggunakan
membrane berdiameter lebih kurang 50 mm. Peralatan penyaring dan membran
disterilisasi dengan cara yang sesuai. Peralatan dirancang hingga larutan uji dapat
dimasukkan dan disaring pada kondisi aseptik, membrane dapat dipindahkan secara
aseptik ke dalam media, atau dapat dilakukan inkubasi setelah media dimasukkan ke
dalam alat penyaring itu sendiri.
Larutan Dalam Air

pada kasus antibiotik , pengencer dapat mengandung bahan penetral dan/atau
bahan inaktifator yang sesuai. Pindahkan isi wadah atau beberapa wadah yang akan
diuji ke dalam satu membran atau beberapa membrane. Saring segera. Jika sediaan
mempunyai daya antimikroba. Setiap pencucian tidak lebih dari 5 kali 100 ml per
membrane. Pindahkan seluruh membran utuh ke dalam media atau potong menjadi
dua bagian yang sama secara aseptik dan pindahkan masing-masing bagian ke dalam
dua media yang sesuai. Inkubasi media selama tidak kurang dari 14 hari.
Zat Padat Yang Dapat Larut
Larutkan dalam pelarut yang sesuai, air steril untuk injeksi, natrium klorida
steril, atau larutan steril yang sesuai seperti Cairan A dan lakukan uji seperti tertera
pada Larutan dalam Air menggunakan penyaring membran yang sesuai untuk pelarut
yang telah dipilih.
Minyak Dan Larutan Minyak
Minyak dan larutan minyak viskositas rendah dapat disaring melalui membran
kering tanpa pengenceran. Minyak kental dapat diencerkan dengan pengencer steril
seperti isopropil miristat P yang tidak mempunyai daya antimikroba pada kondisi
pengujian.. Cuci membran tidak kurang dari tiga kali dengan cara menyaring, tiap kali
dengan 100 ml larutan steril yang sesuai, misalnya polisorbat 80 P dengan kadar 10 g
per liter (Cairan K ). Pindahkan membran atau beberapa membran ke dalam media
seperti tertera pada Larutan dalam Air, dan inkubasi pada suhu dan waktu yang sama.
Salep Dan Krim
Salep dengan basis lemak dan emulsi air dalam minyak dapat diencerkan
sampai 1% dalam isopropil miristat P seperti metode diatas, jika perlu dengan
pemanasan tidak lebih dari 40. Pada kasus tertentu, mungkin diperlukan pemanasan
tidak lebih dari 44. Saring sesegera mungkin, dan lakukan seperti pada Minyak dan
Larutan minyak.
Alat Suntik Terisi

Untuk alat suntik terisi tanpa jarum steril, keluarkan isi dari tiap alat suntik ke
dalam satu atau dua tabung penyaring membran yang terpisah atau ke dalam tabung
pengumpul yang terpisah untuk dipindahkan lagi. Jika jarum steril menyatu dengan
alat suntik, keluarkan langsung isi tiap alat suntik seperti diatas dan lakukan uji seperti
tertera pada Larutan dalam Air. Uji sterilitas jarum menggunakan prosedur Inokulasi
Langsung
Zat Padat Untuk Injeksi Selain Antibiotik
Konstitusi bahan uji seperti tertera pada etiket dan lakukan pengujian seperti
tertera pada Larutan dalam Air atau Larutan Minyak. Jika perlu, dapat ditambahkan
pengencer berlebih untuk membantu konstitusi dan penyaringan
Zat Padat Antibiotik Untuk Injeksi
Produk ruahan yang dikemas <5 g
Dari 20 wadah, pindahkan secara aseptik masing-masing lebih kurang 300 mg
zat padat ke dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml, larutkan dalam lebih kurang 200 ml
Cairan A; atau konstitusi masing-masing dari 20 wadah, pindahkan sejumlah larutan
atau suspense setara dengan 300 mg zat padat ke dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml,
larutkan dalam lebih kurang 200 ml Cairan A. Lakukan uji seperti tertera pada Larutan
dalam Air atau Minyak dan Larutan Minyak.
Produk ruahan yang dikemas 5 g
Dari 6 wadah pindahkan secara aseptik masing-masing lebih kurang 1 g zat
padat ke dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml, larutkan dalam lebih kurang 200 ml
Cairan A dan campur; atau konstitusi masing-masing dari 6 wadah seperti tertera pada
etiket, pindahkan sejumlah larutan yang setara dengan lebih kurang 1 g zat padat ke
dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml, larutkan dalam lebih kurang 200 ml Cairan A.
Lakukan uji seperti tertera pada Larutan dalam Air.
Sediaan Aerosol Steril

Untuk sediaan cair dalam bentuk aerosol bertekanan, bekukan wadah dalam
campuran etanol P-es kering pada suhu minimal -20 selama lebih kurang 1 jam. Jika
memungkinkan, biarkan propelan menguap sebelum wadah dibuka secara aseptik, dan
pindahkan isinya ke dalam labu pengumpul steril, tambahkan 100 ml Cairan D ke
dalam labu pengumpul, dan campur perlahan-lahan. Lakukan uji seperti tertera pada
Larutan dalam Air atau Minyak dan Larutan Minyak.
Alat Kesehatan Dengan Lumen Beretiket Steril
Secara aseptik alirkan Cairan D sejumlah tidak kurang dari 10 kali volume
lumen alat yang akan diuji. Kumpulkan cairan ke dalam labu steril yang sesuai, dan
lakukan uji seperti tertera pada Larutan dalam Air atau Minyak dan Larutan Minyak.
Pada kasus alat suntik steril kosong, ambil pengencer steril melalui jarum, jika jarum
terpasang pada alat, atau melalui jarum steril yang khusus dipasangkan untuk
pengujian ini, dan tekan isi ke dalam labu pengumpul steril. Lakukan uji seperti diatas
INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA
Pindahkan sejumlah sediaan uji seperti tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3
langsung ke dalam media hingga volume sediaan tidak lebih dari 10% volume media.
Jika sediaan uji mempunyai aktifitas antimikroba, lakukan uji setelah dinetralisasi
dengan bahan penetral yang sesuai atau dengan cara mengencerkan dalam sejumlah
media yang cukup
Larutan Minyak
Gunakan media yang telah ditambahkan bahan pengemulsi yang sesuai dengan
kadar. misalnya polisorbat 80 P dengan kadar 10 g per liter.
Salep Dan Krim
Encerkan dengan bahan pengemulsi yang sudah dipilih ke dalam pengencer
steril yang sesuai, seperti Cairan A. Pindahkan sediaan yang telah diencerkan ke
dalam media yang tidak mengandung bahan pengemulsi. Inkubasi media yang telah
diinokulasi selama tidak kurang dari 14 hari. Amati biakan beberapa kali, selama masa
inkubasi. Pada saat pengamatan, kocok secara perlahan biakan pada sediaan yang
mengandung minyak setiap hari. Jika digunakan Media Cair Tioglikolat untuk
mendeteksi mikroba anaerob, tidak boleh dikocok atau campur perlahan dengan
maksud untuk mempertahankan kondisi anaerob.
Benang Bedah Dan Alat Bedah Lain Untuk Penggunaan Dokter Hewan
Buka kemasan tersegel secara aseptik, dan masukkan tiga bagian helaian pada
tiap media, lakukan seperti tertera pada Larutan dalam Air. Lakukan uji terhadap tiga
bagian, panjang masing-masing 30 cm, yang dipotongm dari awal, tengah dan ujung
helaian. Gunakan seluruh helaian dari kemasan yang baru dibuka. Pindahkan tiap
bagian helaian ke dalam media yang sesuai. Gunakan media yang cukup untuk bahan
yang diuji (20 - 150 ml).
Zat Padat
Ambil sejumlah sediaan dalam bentuk kering padat (atau yang terlebih dahulu
dibuat suspensi dalam pengencer steril dalam kemasan langsung), sesuai dengan
jumlah yang tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Pindahkan bahan yang diperoleh ke
dalam 200 ml Media Cair Tioglikolat, dan campur. Dengan cara sama, pindahkan
sejumlah sama ke dalam 200 ml Soybean Casein Digest Medium, dan campur.
Lakukan uji seperti diatas.
Kapas Murni, Perban, Pembalut Bedah Dan Bahan Sejenisnya
Ambil secara aseptik dua bagian atau lebih masing-masing 100 - 500 mg dari
bagian paling dalam. Untuk bahan dengan kemasan tunggal, ambil secara aseptik
seluruh bahan. Rendam bagian dari bahan ke dalam tiap media, dan lakukan uji seperti
diatas.
Alat Kesehatan Steril
Bahan dapat direndam langsung atau diuraikan. Untuk menjamin bahwa lumen
juga kontak dengan media, rendam sejumlah unit yang sesuai ke dalam sejumlah
volume media yang cukup untuk merendam alat dengan sempurna, dan lakukan uji
seperti diatas. Untuk alat kesehatan yang sangat besar, rendam bagian alat yang kontak
langsung dengan pasien ke dalam sejumlah volume media secukupnya yang dapat
membasahi seluruh bagian tersebut. Untuk kateter yang mempunyai lumen dan bagian
luarnya harus steril, potong menjadi bagian-bagian sehingga media dapat kontak
dengan keseluruhan lumen atau isi lumen dengan media, dan kemudian rendam unit
yang utuh.
Pengamatan dan Penafsiran Hasil Uji
Pada interval waktu tertentu dan akhir periode inkubasi, amati secara visual
adanya pertumbuhan mikroba dalam media. Jika bahan uji menimbulkan kekeruhan
pada media sehingga tidak dapat ditetapkan secara visual ada atau tidaknya
pertumbuhan mikroba, 14 hari sejak mulai inkubasi, pindahkan sejumlah media (tiap
tabung tidak kurang dari 1 ml) ke dalam media segar yang sama, kemudian inkubasi
bersama-sama tabung awal selama tidak kurang dari 4 hari. Jika tidak terjadi
pertumbuhan mikroba, maka bahan uji memenuhi syarat sterilitas. Jika terbukti terjadi
pertumbuhan mikroba, maka bahan uji tidak memenuhi syarat sterilitas, Uji dikatakan
tidak absah jika satu atau lebih kondisi dibawah ini dipenuhi:
a. Data pemantauan mikrobiologi terhadap fasilitas uji sterilitas menunjukkan
ketidaksesuaian
b. Pengkajian prosedur uji yang digunakan selama pengujian menunjukkan
ketidaksesuaian
c. Pertumbuhan mikroba ditemukan pada kontrol negatif
d. Setelah dilakukan identifikasi mikroba yang diisolasi dari hasil uji, pertumbuhan
mikroba (beberapa mikroba) dapat dianggap berasal dari kesalahan pada bahan uji,
atau teknik pengujian yang digunakan pada prosedur uji sterilitas.
Jika pengujian dinyatakan tidak absah, lakukan uji ulang dengan jumlah bahan
yang sama dengan uji awal.
PENETAPAN AKTIVITAS VITAMIN B12

Baku pembanding.
Sianokobalamin BFFI; sebelum digunakan lakukan pengeringan di atas silika

gel P selama 4 jam. Larutan uji dibuat dengan zat uji dimasukkan ke dalam wadah
yang berisi larutan pengekstraksi. Tiap 100ml pengekstraksi mengandung 1,29 g
dinatrium fosfat P, 1,1 g asam sitrat anhidrat P dan 1,0 g dinatrium metabisulfit P
dalam air, di autoklaf pada suhu 121 selama 10 menit. Encerkan sejumlah alikot
jernih dengan air hingga larutan uji akhir mengandung vitamin B12. Pembuatan
larutan baku, timbang seksama Sianokobalamin BPFI, larutkan dalam etanol P 25%
hingga kadar 1,0 g per ml, simpan dalam lemari pendingin. Pembuatan larutan
baku, dengan mengencerkan larutan baku persediaan dengan air, perbedaan
transmitans antara blanko terinokulasi dan aras 5,0 ml larutan baku tidak kurang dari
yang setara dengan perbedaan 1,25 mg bobot sel kering.
Larutan persediaan media basal.
Buat media sesuai formula dengan cara campuran dehidrat ditambahkan
menurut urutan dalam daftar, larutkan secara hati-hati L-sistin P dan L-triptofan P
dalam asam klorida sebelum penambahan delapan larutan berikutnya. Tambahkan
100 ml air, campur, dan larutkan dekstrosa anhidrat P, natrium asetat P dan asam
askorbat P. Saring, tambahkan larutan polisorbat 80, atur pH antara 5,5 dan 60
dengan penambahan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air murni hingga 250
ml.
L-Sistin P
L-triptofan P
Asam klorida 1 N
Larutan adenin-guanin-urasil
Larutan xantin
Larutan vitamin I
Larutan vitamin II
Larutan garam A
Larutan garam B
Larutan asparagin
Larutan kasein terhidrolisis asam
Dekstrosa anhidrat P
Natrium asetat abhidrat P
Asam askorbat P
Larutan polisorbat 80
Media biakan.
0,1 g
0,05 g
10 ml
5 ml
5 ml
10 ml
10 ml
5 ml
5 ml
5 ml
25 ml
10 g
5g
1g
5 ml
Larutkan 0,75 ekstrak ragi P larut-air, 0,75 g pepton kering P, 1 g dekstrosa

anhidrat P dan 0,20 g kalium fosfat monobasa P dalam 60 ml hingga 70 ml air.
Tambahkan 10 ml larutan sari tomat dan 1 ml larutan polisorbat 80. Atur pH larutan
6,8 dengan natrium hidroksida 1 N dan tambahkan air hingga 100 ml. Masukkan 10
ml larutan dalam tabung reaksi dan tutup dengan kapas, sterilkan dengan autoklaf
pada suhu 121 selama 15 menit. Dinginkan secepat mungkin.

Biakan persediaan Lactobacillus leichmannii.
Tambahkan 1 g hingga 1,5 g agar ke dalam 100 ml media biakan, panaskan
sambil di aduk hingga larut. Masukkan 10 ml larutan panas dalam tabung reaksi, tutup
dan sterilkan dalam autoklaf suhu 121 selama 15 menit, biarkan dingin. Inokulasi
tabung dengan biakan murni Lactobacillus leichmannii. Inkubasi selama 16-24 jam
pada suhu antara 30 dan 40, usahakan tetap dalam 0,5, simpan dalam lemari
pendingin.
Inokulum.
Pindahkan sel dari biakan induk Lactobacillus leichmannii, ke dalam 2 tabung
steril yang berisi 10ml media biakan. Inkubasi biakan selama 16-24 jam pada suhu
antara 30 dan 40, pertahankan suhu tetap dalam 0,5. Sentrifus biakan dan
enaptuangkan beningan. Suspensikan sel dari biakan dalam 5 ml media suspensi steril
dan campur. Tepatkan volume dengan media suspensi steril hingga enceran dalam
larutan natrium klorida P 0,9% memberikan transmitans 70% pada panjang
gelombang lebih kurang 530 nm, larutan natrium klorida P 0,9% sebagai blanko. Buat
pengenceran (1 dalam 400) suspensi yang telah diukur dengan larutan persediaan
media basal dan gunakan inokulum uji.
Sebelum membaca setiap pengujian, kalibrasi spektrofotometer untuk
transmitans 0% dan 100% dengan air pada panjang gelombang 530 nm. Bersihkan
semua alat, panaskan pada suhu 250 selama 2 jam untuk tabung reaksi kaca tahan
panas. Tambahkan dalam tiap tabung dari 2 seri tabung reaksi berturut-turut 1 ml, 1,5
ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml dan 5 ml larutan baku. Pada tiap tabung ini dan 4 tabung kosong
yang serupa tambahkan 5 ml larutan persediaan media basal dan air hingga 10 ml. Ke
dalam 2 seri tabung lain, tambahkan berturut-turut 1; 1,5; 2; 3; dan 4 ml larutan uji.
Ke dalam tiap tabung tambah 5 ml larutan persediaan media basal dan air hingga 10
ml. Letakkan 1 seri tabung berisi larutan baku dan larutan uji di dalam satu rak dan
seri kedua dalam rak lain, letakkan urutan taung secara acak. Tutup tabung, lalu
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 selama 5 menit, dinginkan secepat
mungkin.
Secara aseptik tambahkan ke dalam tiap tabung 0,5 ml inokulum kecuali 2 dari
4 tabung yang tidak berisi larutan baku. Inkubasi tabung pada suhu antara 30 dan 40
pertahankan tetap dalam 0,5 selama 16-24 jam. Dengan mengatur transmitans pada
100% untuk blanko tidak terinokulasi, baca transmitans dari blanko terinkulasi. Jika
perbedaan lebih besar dari 5% atau jika terkontaminasi dengan jasad renik lain,
abaikan hasil penetapan. Dengan mengatur transmitans pada 100% untuk blanko tidak
terinokulasi, baca transmitans tiap tabung lain. Abaikan hasil penetapan bila
kemiringan kurva baku menunjukkan masalah sensitivitas.
Buat kurva baku antara konsentrasi dan respon dengan cara periksa dan
abaikan tiap transmitans yang menyimpang. Untuk tiap tingkat kurva baku, hitung
respon dari jumlah harga duplikasi transmitans () sebagai selisih y = 2,00 . Buat
kurva dengan respon pada ordinat kertas grafik terhadap logaritma dari jumlah volume
larutan baku dalam ml tiap tabung pada absis, sehingga diperoleh garis mendekati
lurus yang lebih baik.
Hitung respon y, dengan menambah bersama dua transmitans untuk tiap kadar
larutan uji. Baca dari kurva baku logaritma volume larutan baku yang sesuai untuk
tiap harga y yang terletak dalam rentang titik terendah dan tertinggi dari baku.
Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh dari logaritma volume dalam ml dari
larutan uji untuk memperoleh perbedaan, x, untuk tiap tingkat dosis. Hitung rata-rata
dari x untuk tiap 3 atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh
= M, log potensi
relatif dari larutan uji. Hitung jumlah dalam g, Sianokobalamin BPFI sesuai dengan
sianokobalamin dalam sediaan uji dengan persamaan antilog M = antilog (M + log
R), R adalah jumlah dalam g sianokobalamin dalam tiap mg (kapsul atau tablet)
yang digunakan.
Ulangi seluruh penetapan minimal 1 kali menggunakan larutan uji yang dibuat
terpisah. Jika perbedaan antara dua log potensi M kurang dari 0,08, harga rata-rata M,
adalah log potensi sediaan uji. Namun, jika lebih dari 0,08, dilakukan satu atau lebih
penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda
lebih dari 0,15, hitung potensi rata-rata larutan uji.
PENETAPAN KADAR KALSIUM PANTOTENAT.

Baku pembanding.
Kalsium Pantotenat BPFI; lakukan pengeringan pada suhu 105 selama 3 jam
sebelum digunakan.
Larutan baku persediaan.
Timbang seksama 50 mg kalsium pentotenat BPFI yang telah dikeringkan dan
disimpan di tempat gelap, di atas fosfor pentoksida P, hindari penyerapan uap air
selama penimbangan. Larutkan dengan 500 ml air dalam labu terukur 1000 ml.
Tambahkan 10 ml asam asetat 0,2 N dan 100 ml larutan natrium asetat P (1
dalam 60), encerkan dengan air sampai tanda. Tiap ml larutan setara dengan 50
g kalsium pentotenat BPFI. Simpan di bawah lapisan toluena P dalam lemari
pendingin.
Larutan baku.
Pada hari pengujian, encerkan larutan baku persediaan yang diukur seksama
dengan air hingga kadar antara 0,01 g dan 0,04 g kalsium pentotenat per ml,
gunakan kadar yang tepat hingga respons yang diperoleh seperti tertera pada
prosedur, 2 ml dan 4 ml larutan bak yang digunakan berada dalam garis lurus
kurva respon log kadar.

Larutan uji.
Buat larutan seperti yang tertera pada masing-masing monografi dengan kalsium
pentotenat dalam larutan baku.
Larutan persediaan media basal
Larutan kasein terhidrolisis asam
Larutan Sistin Triptofan
Larutan polisorbat 80
Dekstrosa anhidrat
Natrium asetat anhidraat
Larutan Adenin-Guanin-Urasil
25 ml
25 ml
0,25 ml
10 g
5g
5 ml
Larutan Riboflavin-Tiamin.Hidroksida
Biotin
Larutan Asam para-aminobenzoatNiasin-piridoksin Hidroksida
5 ml
Larutan garam A
Larutan garam B
5 ml
5 ml
Media biakan.
5 ml
Pada tiap seri tabung berisi 5 ml larutan persediaan media basal tambahkan 5 ml
air yang mengandung 0,2 g kalsium pentotenat. Sumbat tabung dengan kapas,
sterilkan dalam otoklaf pada suhu 121 dan dinginkan.

Inokula.
Pindahkan sel dan biakan persediaan Lactobacillus plantarum ke dalam tabung
steril berisi 10 ml media biakan. Inkubasi biakan selama 16-24 jam pada suhu
yang dipilih antara 30 dan 37 0,5. Suspensi sel yang diperoleh adalah
inokula.
Prosedur.
Pada dua seri tabung reaksi ukuran sama masukkan 1 ml dan atau 1,5 ml; 2 ml; 3 ml;
4 ml dan 5 ml larutan baku. Pada tiap tabung dan 4 tabung sejenis yang tidak berisi
larutan baku tambahkan 5 ml larutan persediaan media basal dan air secukupnya
hingga 10 ml. Pada dua seri tabung reaksi sejenis masukkan sejumlah larutan uji
setara dengan 3 atau lebih kadar larutan baku meliputi tingkat 2 ml; 3 ml dan 4 ml.
Pada masing-masing tabung tambahkan 5 ml larutan persediaan media basal dan air
secukupnya hingga 10 ml. Tempatkan dua seri tabung larutan baku dan larutan uji
bersama-sama dalam rak tabung dan sebaiknya tempatkan tabung secara acak.
Tutup tabung untuk mencegah kontaminasi jasad renik dan panaskan dalam
otoklaf pada suhu 121 selama 5 menit. Dinginkan dan tambahkan 1 tetes inokula
pada tiap tabung kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi larutan baku dan campur.
Inkubasi tabung pada suhu antara 30 dan 37 0,0 selama 16-24 jam hingga tidak
terbentuk kekeruhan dalam waktu 2 jam.
Tentukan transmitans tabung dengan cara campur isi tiap tabung, ukur
transmitans pada panjang gelombang antara 540 nm dan 660 nm, setelah tercapai
keadaan stabil selama 30 detik atau lebih. Gunakan interval waktu yang relatif sama
untuk setiap pembacaan tabung.
Buat kurva baku antara kadar dan respons dengan cara untuk tiap tingkat kadar
larutan baku, hitung respons dari jumlah harga duplikasi transmitans () sebagai
selisih, Y = 2,00 transmitans. Gambarkan kurva dengan respons pada ordinat
kertas grafik terhadap log dari volume larutan baku dalam ml tiap tabung pada absis,
gunakan skala artimatika atau logritmik sehingga diperoleh mendekati garis lurus.
Hitung respons y dengan menambah bersama dua transmitans untuk tiap kadar
larutan uji. Baca dari kurva baku logaritma volume larutan baku yang sesuai untuk
tiap harga y yang terletak dalam rentang titik terendah dan tertinggi dari baku.
Kurangkan dari tiap logaritma yang diperoleh, logaritma dari volume dalam ml larutan
uji untuk memperoleh perbedaan, x untuk tiap tingkat dosis. Harga rata-rata x untuk
masing-masing tiga atau lebih tingkat dosis untuk memperoleh x = M, log-potensi
relatif larutan uji. Hitung jumlah dalam mg kalsium pentotenat dalam sejumlah bahan
yang digunakan untuk pengujian sebagai antilog:
M= antilog (M + log R)
R adalah jumlah mg kalsium pentotenat yang di perkirakan ada dalam tiap mg (kapsul
atau tablet) yang digunakan untuk uji.
Ulangi seluruh penetapan sekurang-kurangnya satu kali, denga larutan uji yang
dibuat terpisah. Jika perbedaan antara dua log-potensi M kurang dari 0,08, harga ratarata M adalah log potensi sediaan uji . Jika lebih dari 0,08, lakukan satu atau lebih
penetapan tambahan. Dari harga rata-rata dua atau lebih harga M yang tidak berbeda
lebih dari 0,15, hitung potensi rata-rata larutan uji.
PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIK SECARA MIKROBIOLOGI
Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi sesuai
dengan efek daya hambatnya terhadap mikroba. Suatu penurunan aktivitas
antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat
ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi
biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan
hilangnya aktivitas.
Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan cara
lempeng-silinder dan cara tabung atau turbidimetri. Metode lempeng berdasarkan
difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam
cawan petri, sehingga mikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada
daerah berupa lingkaran disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik. Metode
turbidimetri berdasarkan atas hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan
antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila
tidak terdapat antibiotik.
Peralatan
Semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan sesudah digunakan.
Peralatan gelas untuk menyimpan dan memindahkan mikroba uji, disterilkan dengan
pemanasan kering atau dengan uap air.
Pengendalian Suhu
Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap penetapan secara
mikrobiologi, waktu membiakan mikroba dan penyimpanan inokulanya, selama
inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan tabung. Suhu pada penetapan dengan
cara lempeng dipertahankan pada lebih kurang 0,5 dari suhu yang dipilih.
Pengendalian suhu yang lebih dekat sangat penting untuk inkubasi pada penetapan
dengan cara tabung, hal ini dapat diperoleh dengan sirkulasi udara atau air, kapasitas
panas dari air yang lebih besar lebih menguntungkan daripada sirkulasi udara.
Spektrofotometer
Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang sempit, menumbuhkan
spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya panjang gelombang
yang dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 580 nm untuk penyiapan inokula
dengan kerapatan tertentu, atau filter 530 nm untuk pengukuran serapan pada
pengujian dengan cara tabung. Atur serapan dengan blanko untuk serapan nol
menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang disiapkan seperti dinyatakan
untuk masing-masing antibiotik, termasuk sejumlah yang sesuai larutan uji dan
formaldehida dalam tiap contoh.
Wadah Untuk Penetapan Secara Lempeng-Silinder
Untuk cara lempeng, gunakan cawan petri kaca atau plastik (lebih kurang 20
mm x 100 mm) yang mempunyai tutup dari bahan yang sesuai. Untuk silinder,
gunakan silinder besi tahan karat dengan toleransi ukuran masing-masing lebih kurang
0,1 mm; diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10 mm. Cara silinder
dengan saksama untuk membersihkan semua residu, kadang-kadang diperlukan suatu
asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat.
Wadah Untuk Penetapan Secara Turbidimetri
Untuk penetapan dengan cara tabung, gunakan tabung reaksi kaca atau plastik
dengan ukuran misalnya 16 mm x 125 mm atau 18 mm x 150 mm yang panjang,
diameter dan ketebalannya relatif seragam serta permukaannya tidak cacat dan tidak
tergores. Tabung yang ditempatkan pada spektofotometer harus sesuai, tanpa goresan
dan tidak cacat. Bersihkan seksama tabung dari semua residu antibiotik dan sisa
larutan pembersih, dan sterilkan sebelum digunakan untuk penetapan berikutnya.
Media dan Pengencer
Media
Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula mikroba uji terbuat dari
bahan-bahan yang tertera di bawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-masing bahan,
atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan dengan syarat media yang
dihasilkan mempunyai daya menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan
memberikan respon kurva baku yang sama.
Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1L, dan atur pH dengan NaOH 1N
atau HCl 1N, hingga sesudah sterilisasi uap air pH media sesuai dengan yang tertera.
Media 1
Pepton P
6g
4g
Ekstrak ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Glukosa P
1g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Media 2
Pepton P
6g
Ekstraks ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Media 3
Pepton P
5g
Ekstrak ragi P
1,5 g
Ekstrak daging P
1,5 g
Natrium klorida P
3,5 g
Glukosa P
1g
3,68 g
Kalium fosfat monobosa P
1,32 g
Air
1000 ml
Media 5
Pepton P
6g
Ekstraks ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Media 8
Pepton P
6g
Ekstraks ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Media 9
17 g
Digesti papaik kedele P
3g
Natrium klorida P
5g
2,5 g
Glukosa P
2,5 g
Agar P
20 g
Air
1000 ml
Media 10
17 g
3g
Natrium klorida P
5g
2,5 g
Glukosa P
2,5 g
Agar P
12 g
Polisorbat 80 P
10 ml
Air
1000 ml
Media 11
Pepton P
6g
4g
Ekstrak ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Glukosa P
1g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Media 13
Glukosa P
20 g
Pepton P
10 g
Air
1000 ml
Media 19
Pepton P
9,4 g
Ekstrak ragi P
4,7 g
Ekstrak daging P
2,4 g
Natrium klorida P
10 g
Glukosa P
10 g
Agar P
23,5 g
Air
1000 m
lpH setelah sterilisasi 6,1 0,1
Media 32
Pepton P
6g
4g
Ekstrak ragi P
3g
Ekstrak daging P
1,5 g
Glukosa P
1g
Agar P
15 g
Mangan sulfat P
300 mg
Air
1000 ml
Media 34
Gliserin P
Pepton P
Ekstrak daging P
Natrium klorida P
Air
10 g
10 g
10 g
3g
1000 g
Media 35
Gliserin P
Pepton P
Ekstrak daging P
Natrium klorida P
Agar P
Air
10 g
10 g
10 g
3g
17 g
1000 g
Media 36
Natrium klorida P
Agar P
Air
pH sterilisasi 7,3 0,1
15 g
5g
5g
15 g
1000 ml
Media 39
Pepton P
5g
Ekstrak ragi P
1,5 g
Ekstrak daging P
1,5 g
Natrium klorida P
3,5 g
Glukosa P
1g
3,68 g
Kalium fosfat monobosa P
1,32 g
Air
1000 ml
Dapar Fosfat Dan Larutan Lain
Dapar nomor 1
1%; pH 6,0. Larutkan 2 g kalium fosfat dibasa P dan 8 g kalium fosfat
monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 0,05 dengan
asam fosfat 18 N atau kalium hidroksida 10 N.

Dapar nomor 3
0,1 M; pH 8,0. Larutkan 16,73 g kalium fosfat dibasa P dan 0,523 g
kalium fosfat monobasa P dalam air 1000 ml. Atur pH hingga 8,0 0,1
dengan asam fosfat 18 N atau NaOH 10 N.

Dapar nomor 4
0,1 M; pH 4,5. Larutkan 13,61 g kalium fosfat monobasa P dalam 1000
ml air. Atur pH hingga 4,5 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau
NaOhH 10 N.
Dapar nomor 6
10%; pH 6,0. Larutkan 20 g kalium fosfat dibasa P dan 80 g kalium
fosfat monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 0,05
dengan asam fosfat 18 N atau NaOH 10 N.

Dapar nomor 10
0,2 M; pH 10,5. Larutkan 35 g kalium fosfat dibasa P dalam 1000 ml
air dan tambahkan 2 ml kalium hidroksida 10 N. Atur pH hingga 10,5
0,1 dengan asam fosfat 18 N atau NaOH 10 N.

Dapar nomor 16
0,1 M; pH 7,0. Larutkan 13,6 g kalium fosfat dibasa P dan 4 g kalium
fosfat monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 7,0 0,2 dengan
asam fosfat 18 N atau NaOH 10 N.
Unit dan Baku Pembanding
Potensi antibiotik dinyatan dalam unit atau g aktivitas. Pengertian g

aktivitas berasal dari sediaan antibiotik yang dipilih sebagai baku pembanding yang
dianggap secara keseluruhan terdiri dari bahan kimia tunggal, dan oleh karena itu
dinyatakan potensi g per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan
metode pembuatan dan pemurnian antibiotik tertentu, aktivitas sediaan dapat lebih
dari 1000 g per mg.
Tabel 1
Penyiapan Larutan Pembanding Persediaan Dan Pengenceran
Antibiotic dan Pengerin
penetapan
gan
[cara lempeng sebelum

(CL)
cara digunaka
Turbidimetri
(T)]
Y = Ya
Larutan persediaan
Pelarut
awal Kadar
Batas
Enceran uji
Pengenc Dosis
(kadar
waktu
eran
tenga
akhir
h (ug
awal persedi
yang
aan
penggun
ditetapkan)
akhir
aan
[pengencer
per ml
aktivi
tas
selanjutnya bila
unit
berbeda]
per
Amfoterisin B Y
Dimetil
1mg
D.10
ml)
1,0 ug
(CL)
Amikasin (T)
T\
T
sulfoksida
Air
Air
1mg
100 ug
14 hari
7 hari
Air
D.3
10 ug
0,1 ug
D16
2U
14 hari
D.16
0,04
90 hari
D.3
U
1,0 ug
T
Tidak
Ampisilin
(CL)
Bleomisin
(CL)
Daktinomisin
Metanol
1mg
(CL)
Demeklosiklin Y
(10mg/ml)
Asam klorida 1mg
4 hari
Air
0,1 ug
(T)
Dihidrostrepto
0,1 N
D3
1mg
30 hari
D.1
1,0 ug
misin (CL)
Dihidrostrepto
Air
1mg
30 hari
Air
30 ug
misin (T)
Diklosasilin
D1
1mg
7 hari
D.3
5,0 ug
(CL)
Doklisiklin
Asam
1mg
5 hari
D.3
0,1 ug
(T)
hidroklorida
Eritromisin
0,1N
Metanol
1mg
14 hari
Air
1,0 ug
(CL)
Gentamisin
(10mg/ml)
D3
1mg
30 hari
D.1
0,1 ug
(CL)
Kanamisn (T)
Karbenisilin
T
T
Air
D1
1mg
1mg
30 hari
14 hari
D.3
D.1
10 ug
20 ug
(CL)
Klindamisin
Air
1mg
30 hari
D.3
1,0 ug
(CL)
Kloksasilin
D1
1mg
7 hari
D.1
5,0 ug
30 hari
Air
2,5 ug
(CL)
Kloramfenikol T
Alcohol
(T)
Klortetrasiklin
mg/ml)
Asam klorida 1mg
4 hari
Air
0,06
(T)
Kolistin (CL)
0,1 N
Air
1mg
14 hari
D.6
ug
1,0 ug
Linkomisin
(10mg/ml)D6
Air
1mg
30 hari
Air
0,5 ug
2 hari
Air
0,085
(10 1mg
(T)
Minosiklin (T) T
Asam
Mitomisin
0,1 N
D1
1mg
14 hari
D.1
ug
1,0 ug
(CL)
Neomisin
D3
100 ug
14 hari
D.3
1,0 ug
(CL)
Neomisin (T)
Nistatin (CL)
Y
Y
D3
Dimetil
1000 U
1mg
14 hari
*
D.3
D.6
1,0 ug
20 U
Oksitetrasiklin T
sulfoksida
Asam klorida 1mg
4 hari
Air
0,24
(T)
Paromomisin
0,1 N
D3
1000 U
21 hari
D.3
ug
1,0 ug
D1
10.000
4 hari
D.1
1,0 U
Air;D.6
U
1mg
14 hari
D.6
10 U
(CL)
Penisilin
G T
(CL)
Polimiksin B Y
klorida 1mg
(CL)
Rifampisn
Methanol
1mg
1 hari
D.1
5,0 ug
(CL)
Sefaleksin
D.1
1mg
7 hari
D.1
20 ug
(CL)
Sefradin (CL)
Steptomisin
T
Y
D.1
Air
1mg
1mg
5 hari
30 hari
D.1
air
10 ug
30 ug
(T)
Tetrasiklin (T)
Asam
1 hari
Air
0,24
Tobramisin
0,1 N
Air
1mg
14 hari
Air
ug
2,5 ug
(T)
Vankomisin
Air
1mg
7 hari
D.4
10 ug
(CL)
Zink
Asam
D.1
1,0 ug
Basitrasin CL
klorida 1mg
klorida 100 U
0,1 N
Keterangan * = hari yang sama

Tabel 2
Mikroba Uji Untuk Penetapan Antibiotik Dengan Prosedur Seperti Yang Tertera
Pada Tabel 1
Antibiotik
Amfoterisin B
Amikasin
Ampisilin
Basitrasin
Bleomisin
Daktinomisin
Demeklosiklin
Dihidrostreptomisin (CL)
Dihidrostreptomisin (T)
Dikloksasilin
Doksisiklin
Eritromisin
Gentamisin
Kanamisin
Karbenisilin
Klindamisin
Kloksasilin
Kloramfenikol
Klortetrasiklin
Mikroba Uji
Saccharomyces cerevisiae
Micrococcus luteus
Micrococcus luteus
Mycobacterium smegmatis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Klebsiella pneuminiae
Micrococcus luteus
Staphylococcus epidermidis
Pseudomonas aeruginosa
Micrococcus luteus
Escherichia coli
Nomor ATCC
9763
29737
9341
10240
607
6633
29737
6633
10031
29737
29737
9341
12228
29737
25619
9341
29737
10536
29737
Kolistrin
Linkomisin
Minosiklin
Mitomisin
Neomisin (CL)
Neomisin (T)
Nistatin
Oksitetrasiklin
Paramomisin
Penisilin G
Polomiksin B
Sefaleksin
Sefradin
Streptomisin (T)
Tetrasiklin
Tobramisin
Vankomisin
Bordetella bronchiseptica
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
Bordetella bronchiseptica
Bacillus subtilis
4617
29737
29737
6633
12228
10031
2601
29737
12228
29737
4617
29737
29737
10031
29737
29737
6633
Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pembanding

antibiotik yang ditimbang saksama dan sebelumnya telah dikeringkan seperti pada
tabel 1, atau seluruh isi satu vial, jika diperlukan, dalam pelarut seperti yang tertera
pada tabel tersebut, kemudian encerkan hingga kadar yang dikehendaki. Simpan
dalam lemari pendingin dan gunakan dalam waktu yang ditentukan. Pada hari
penetapan, buatlah pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih larutan untuk
pengujian dengan kadar bertahap, umumnya dengan perbandingan 1:1,25 untuk
penetapan dengan cara lempeng silinder atau lebih kecil untuk penetapan turbidimetri.
Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan dan urutan kadar dengan dosis tengah yang
ditentukan.
Penyiapan Contoh
Untuk penyiapan sediaan yang akan diuji (contoh), berikan potensi perkiraan
tiap satuan; bobot atau volume dan berdasarkan perkiraan ini, pada hari penetapan
buat larutan persediaan serta enceran larutan uji seperti yang tertera untuk setiap
antibiotik
dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding.
Penetapan menggunakan 5 tingkat dosis contoh pada kadar perkiraan sama dengan
aras dosis tengah baku.
Mikroba dan Inokula
Mikroba Uji
Mikroba uji untuk tiap antibiotik tertera pada tabel 2 beserta nomor identifikasi
Americans Type Culture Collection (ATCC) yang bersangkutan. Metode penetapan
dengan mikroba uji tersebut tertera pada tabel 1. Pelihara biakan pada biakan agar
miring dengan kondisi inkubasi seperti yang tertera pada tabel 3 dan pindahkan setiap
minggu pada agar miring yang baru. Untuk Klebsiella pneumoniae gunakan biakan
tidak berkapsul.
Penyiapan Inokula
Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segar mikroba dari agar
miring atau biakan lain ke permukaan 250 ml media agar yang tertera pada tabel 3
dalam sebuah botol Roux, kecuali untuk Streptococcus faecium dibiakkan media cair.
Sebarkan suspensi secara merata ke atas permukaan agar dengan bantuan butiran kaca
steril dan inkubasikan pada suhu yang ditetapkan selama waktu tertentu. Pada akhir
periode inkubasi, buat suspensi persediaan dengan mengumpulkan biakan permukaan
ke dalam 50 ml larutan natrium klorida P 0,9% steril kecuali untuk Bleomisin
(gunakan 50 ml Media 34).
Untuk penetapan, encerkan sebagian suspensi persediaan dengan penambahan
sejumlah volume air steril atau larutan atau larutan natrium klorida P 0,9% steril
seperti tertera pada tabel 3 dan ukur transmitansnya pada 580 nm. Atur perbandingan
hingga inokula mempunyai transmitans 25% terhadap larutan natrium klorida P 0,9%
sebagai blanko. Untuk penetapan secara turbidimetri.
Untuk penetapan dengan cara lempeng-silinder tetapkan dengan percobaan
untuk mengatur jumlah suspensi persediaan yang dimasukkan untuk inokula, dimulai
dengan volume yang tertera pada tabel 3 hingga menghasilkan batas daerah hambatan
yang memuaskan dengan diameter lebih kurang 14 mm sampai 16 mm dan
memberikan suatu hubungan dosis yang reprodusibel. Buat inokula dengan
menambahkan sejumlah suspensi persediaan ke dalam media agar yang telah
dicairkan dan didinginkan hingga suhu 45 sampai 50, putar hingga diperoleh
suspensi homogen.
Tabel 3
PENYIAPAN INOKULA
Mikroba uji &

nomor ATCC
Kondisi inkubasi
Pengenc
Komposisi
eran
inokula yang
suspense
dianjurkan
Antibiotic
persediaa
n hingga
diperoleh
25% T
medi Suhu
Waktu
media
a
Bacillus subtilis
(6633)
32
Jumlah
(ml per
32-35
5 hari
100 ml)
**
Daktinomisin
Dihidrostreptomisin
Rifampisin
24
1:20
0,5
Mitomisin
8
10
**
0,1
vankomisin
Kolistin
Bordetella
bronciseptica
(4617)
Escherichia coli
(10536)
Klebsiella
pneumonia
(10031)
Micrococcus
luteus (9341)
Micrococcus
luteus (10240)
Mycobacterium
smegmatis 607)
32-35
24
1:35
11
1
1,5
0,3
36
36-
48
35
1,0
Pseudomonas
Aeruginosa
(25619)
Saccharomyces
cerevisiae
(9763)
Saccharomyces
32-35
Polimiksin B
1
32-35
24
1:20
0,7
Kloramfenikol
36-
24
1:25
0,1
Streptomisin
37,5
32-35
Dihidrostreptomisin
24
1:40
39
11
2
0,5
Neomisin
Ampisilin
Klindamisin
eritromisin
Basitrasin
37,5
1
36-
24
1:25
10
0,5
Bleomisin
karbenisilin
37,5
19
29-31
48
19
1,0
Amfoterisin B
19
29-31
48
1:30
19
1,0
Nistatin
cerevisiae
(2601)
Staphylococcus
aureus (29737)
32-35
24
1:20
0,05
Sefaleksin, sefradin
0,1
Kloksasilin,
1,0
Dikloksasilin
0,1
Penisilin G
Amikasin,
Klortetrasiklin
Demeklosiklin,
0,2
DoksisiklLin,
0,15
Linkomisin,
Oksitetrasiklin,
Tetrasiklin
Kanamisin,
Minosiklin
Staphylococcus
epidermidis
(12228)
32-35
24
1:14
11
0,03
Tobramisin
Gentamisin
1:25
11
0,4
Neomisin
11
2,0
Paromomisin
Keterangan : * seperti yang ditetapkan

** seperti yang disyaratkan
Cara Pengujian
Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi yang meyakinkan melaui
pemisahan sumber sumber penyebab kesalahan potensial serta bias yang relative besar
dengan menggunakan desain penetapan yang sesuai. Pada penetapan dengan metode
lempeng silinder, perbandingan pokok dibatasi pada hubungan pengukuran diameter
hambatan antar lempeng. Dan pada penetapan dengan metode tabung diamati
perbedaan kekeruhan yang menggambarkan perbedaan kadar antibiotic, diperlukan
keseragaman suhu tabung pada incubator. Dianjurkan menggunakan desain penetapan
dengan suatu kurva baku, dengan dibuat pengenceran sebanyak 5 , 6 atau lebih.
Penetapan potensi secara mikrobiologi dipengaruhi oleh variabel-variabel

antar penetapan dan intra penetapan sehingga diperlukan dua atau lebih penetapan
sehingga potensi antibiotic dapat dipercaya. Jika potensi perkiraan pada penetapan
kedua berbeda secara signifikan dari percobaan pertama, maka lakukan satu atau lebih
penetapan tambahan.
Metode Lempeng silinder

Pada penyiapan lempeng, tuang 21 ml media 2 pada cawan petri dari sejumlah
cawan yang diperlukan dan biarkan memadat sebagai lapisan dasar . Untuk Ampisilin,
klindamisin, eritromisin, gentamisin, linkomisin, neomisin, gunakan media 11. Untuk
bleomisin gunakan 10 ml media 35. Untuk dihidrostreptomisin gunakan media 5.
Tambahkan 4 ml lapisan inokula seperti yang tertera pada tabel 3, putar lempeng
membentuk angka 8 agar inokula menyebar merata pada lempeng, dan biarkan
memadat. Letakkan 6 silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari ketinggian
12 mm menggunakan alat mekanik, lalu tutup lempeng agar tidak terjadi kontaminasi.
Kemudian silinder diberi larutan antibiotik dan inkubasi lempeng pada inkubator.
Metode turbidimetri
Pada hari penetapan siapkan dosis yang diperlukan dengan mengencerkan
larutan persediaan baku dan tiap larutan uji seperti pada tabel 1. Tambah 1ml tiap
dosis pada masing-masing 3 tabung reaksi yang telah dipersiapkan dan tempatkan 3
replika tabung dengan posisi acak pada rak tabung. Lalu buat tabung untuk kontrol
berisi 1 ml pengencer tanpa antibiotik. Lalu tambah inokula 9 ml kedalam tiap tabung
pada rak dan letakkan pada incubator dengan suhu yang telah ditentukan sebelumnya.
Selama 2-4 jam setelah inkubasi tambah larutan formaldehid 0,5 ml kedalam tiap
tabung dan ukur transmitan pada serapan 530 nm
Cara Perhitungan
Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh dengan metode lempeng
silinder atau turbidimetri lakukan seperti yang tertera pada potensi hasil interpolasi
dari kurva baku dan pada desain dan analisis penetapan hayati dengan metode garis
lurus transformasi log. Jika lebih dari satu penetapan dilakukan untuk bahan uji yang
sama dengan kurva baku berbeda, buat rata2 dari dua atau lebih nilai potensi

Tugas Mikro Hanip Ridho Saputra

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Tugas Mikro Hanip Ridho Saputra

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TUGAS MIKROBIOLOGI

RANGKUMAN UJI MIKROBIOLOGI DALAM FARMAKOPE

: Hanip Ridho Saputra

: Laida Neti Mulyani, M.Si

PROGRAM STUDI FARMASI

UJI BATAS MIKROBA

Pengujian batas mikroba dilakukan untuk mengetahui jumlah mikroba aerob

Larutan Dapar Fosfat Ph 7,2

terukur 1000 ml; tambahkan +- 175 ml natrium hidroksida 1 N ukur pH hingga pH

lemari pendingin. Sebelum digunakan, encerkan 1

bagian larutan dengan 800 bagian air, dan sterilkan.

Media SCDA (Soybean-Casein Digest Agar Medium)

Digesti pankreatik kasein P

Media FSCD (Fluid Soybean Casein Digest Medium)

Media CETA (Cetrimide Agar Medium)

Digesti pankreatik kasein P

Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin)

Media FTM (Fluid Tetrathionate Medium)

Media XLDA (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar Medium)

Campuran sama banyak Digesti peptik

jaringan hewan dan Digesti pankreatik

pH setelah sterilisasi 5,6 0,2

Media PDA (Potato Dextrose Agar Medium)

prosedur uji yang akan dilaksanakan.

dan lakukan pengujian.

Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcus aureus dan

Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Eschericia coli.

aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Eschericia coli.

Angka Mikroba Aerob Total

Nilai Duga Terdekat

Digunakan untuk menguji Staphylococcus aureus. Dengan sengkelit, koloni

Ciri khas morfologi koloni

Hitam dikelilingi zona kuning

Kuning dengan zona kuning

Positif, berbentuk bulat dalam

Hitam, berkilau, dikelilingi

zona jernih 2 sampai 5 mm

Positif, berbentuk bulat dalam

Kecil, transparan, tidak berwarna

atau merah muda hingga putih buram

Merah, dengan atau tanpa pusat

Hitam atau hijau

Ciri khas morfologi

Merah bata, dapat dikelilingi daerah

yang terdiri dari endapan empedu

Negatif, berbentuk batang atau

UJI EFEKTIVITAS PENGAWET ANTIMIKROBA

Hasil yang diterima menunjukkan bahwa tidak ada

kontaminasi mikroba ditemukan dalam sampel di bawah kondisi pengujian.

Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu 30 - 35.Untuk sediaan yang

Penyaringan membran, Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu 20 - 25 sebagai

Media untuk Golongan Penisilin dan Sefalosporin

:ATCC 6538; CIP 4.83; NCTC 10788; NCIMB 9518; NBRC

ATCC 6633; CIP 52.62;NCIMB 8054; NBRC 3134

ATCC 16404; IP 1431.83 MI 149007; NBRC 9455

Uji Fertilitas untuk Aerob, Anaerob dan Kapang

Cairan Pengencer Dan Pembilas Untuk Penyaringan Membran

setiap liter Cairan A tambahkan 1 ml polisorbat 80 P, atur pH hingga 7,1 0,2,

(Kecuali dinyatakan lain)

Seluruh isi tiap wadah

Lebih dari 40 ml,

tidak kurang dari 200 mg

dengan tidak kurang dari 200 mg

Pembalut/ kapas/perban (dalam kemasan)