RESUME ARTIKEL Polyphenol Oxidase and Peroxidase Expression in Four Pineapple Varieties (Ananas comosus L.

) after a Chilling Injury

Browning dari daging dalam buah-buahan stres atau terluka dan sayuran adalah umum symptomlinked untuk polifenol oksidase (PPO) atau peroksidase (POD) aktivitas (1). Kuinon produk yang dihasilkan oksidasi fromphenol cenderung polimerisasi menjadi senyawa coklat yang mengikat gugus asam amino dengan protein selular (2). Bawah normal dingin-kondisi penyimpanan, nanas dipertahankan pada temperatur 8? C. Nanas internal kecoklatan (IB), juga dikenal sebagai Blackheart atau bintik-bintik coklat endogen, mengembangkan ke tergantung besar atau lebih kecil luas pada intensitas tegangan dingin dialami oleh buah. IB juga telah ditunjukkan tergantung pada buah kerentanan, yang, pada gilirannya, tergantung di atas panggung thematurity, status gizi, dan varietas (3-5). IB ditemukan diinduksi di atas suhu penyimpanan biasa, namun semakin tinggi suhu, semakin sedikit gejala (5). Tembus Daging adalah gejala yang berhubungan dengan IB dan lainnya dingin cedera. Pada suhu <8? C, tembus luas daging dilaporkan untuk memulai bawah shell dan menyebar seluruh daging buah, terutama bila suhu penyimpanan dekat dengan 0? C (3, 5-7). Pada 8 C,? ketika IB juga diinduksi, bintik tembus diamati pada tahap yang sangat awal IB tetapi dekat dengan buah hati (3, 5, 6, 8). Akhirnya, tembus dari daging juga telah panas reportedwhen dan irigasi tidak teratur atau curah hujan yang terjadi pada saat yang sama ketika buah itu pematangan pada tanaman. Dalam hal ini, kelebihan suplai nitrogen untuk tanaman ditemukan menjadi faktor meningkatkan (9-11). Tembus dari daging dianggap konsekuensi dari disorganisasi sel utama mengakibatkan kebocoran isi sel dan hilangnya antar ruang (7, 8, 10, 12). PPO dan POD secara luas didistribusikan pada tanaman. Mereka hubungan dengan berbagai peristiwa fisiologis telah banyak dibuktikan, dan beberapa fungsi fisiologis mereka tidak benar-benar dijelaskan. PODS, yang ada dalam sel tanaman sebagai larut dan membran protein terikat, terlibat dalam biosintesis lignin, baik untuk normal perkembangan tanaman (13-15) atau untuk pertahanan tanaman melalui penguatan dinding sel di bawah cekaman biotik (16). Di antara fungsi-fungsi lain dalam pertahanan tanaman, PODS berpartisipasi dalam sintesis senyawa beracun seperti kuinon dan dalam peraturan H2O2 tingkat di dalam sel dan di daerah apoplastic (17, 18). H2O2 dapat dihasilkan dengan lainnya spesies oksigen reaktif (ROS) selama pertahanan tanaman (selama reaksi hipersensitif, misalnya, menyebabkan kematian sel), butH2O2 juga dianggap sebagai salah satu molekul sinyal awal yang baik-baik saja tingkat-tuned melalui

PODactivities dalam ketahanan tanaman sistemik (19) PODare terlibat. pertumbuhan tanaman peraturan melalui regulasi hormon dan khususnya IAA dan ethylene (20, 21). Akhirnya, mereka bertanggung jawab untuk browning enzimatik pada buah-buahan dan makanan olahan. PPO juga memamerkan berbagai fungsi fisiologis dalam tanaman. Mereka ditemukan dalam berbagai pecahan subselular dan khususnya kloroplas. Mereka secara fisik terpisah dari fenolik mereka substrat seperti ini ditemukan dalam vakuola (22, 23). PPO adalah juga terlibat dalam pertahanan tanaman systemthrough biosintesis yang dari kuinon beracun dan berbagai phytoalexins (16,24). Mereka juga dapat memperkuat dinding sel melalui polimerisasi kuinon, membentuk melanin larut (16). Langsung modifikasi protein dapat mengakibatkan dari tindakan PPO, mereka mengurangi gizi nilai herbivora serangga (25). PPO juga terlibat dalam perkembangan peraturan karena mereka umumnya ditemukan di lebih tinggi konsentrasi dalam daun muda dan buah belum matang (24). Meningkatkan dalam kegiatan PPO tidak selalu terkait dengan ekspresi gen meningkat. Dalam pemasakan pisang atau daun bayam, diyakini bahwa meningkatnya aktivitas PPO berhubungan dengan aktivasi yang sudah ada laten PPO (26, 27). Akhirnya, keterlibatan PPO di oksidasi fenolik coumpounds menuju kematangan adalah yang paling akrab fungsi (24). Biotik dan abiotik seperti dingin menghasilkan oksidatif meledak dalam sel tanaman (28-30). Pembentukan ofROS yang dihasilkan dari ini meledak oksidatif dicegah oleh sistem antioksidan. Ini mencakup berbagai sistem antioksidan rendah massa molekul (Asam askorbat, glutathione, dan tokoferol) dan enzim regenerasi dengan mengurangi bentuk antioksidan. Ini mencakup juga ROS-berinteraksi enzim seperti SOD, peroksidase, dan catalases (31). PPO dan POD adalah bagian dari suatu sistem nanas buah ketika evolusi dari sistem enzim antioksidan dapat diukur setelah stres panas dan selama penuaan (11). Dalam studi terdahulu tentang SCay andMD2 (sebuah hibrida IB-tahan), disarankan bahwa pengaturan gen PPO memainkan peran kunci dalam pengembangan gejala IB (3, 4). Hal yang sama penulis melaporkan bahwa enzim PPO baru diinduksi oleh stres dingin di nanas, sedangkan enzim POD tidak, meskipun POD telah ditemukan untuk bertanggung jawab atas kecoklatan di lain buah (32, 33). Stewart et al. (34) dijelaskan dua nanas yang berbeda PPOcDNAs, ditunjuk PINPPO1 dan PINPPO2, yang menunjukkan tinggi tingkat homologi untuk PPO tanaman pengkodean gen-gen lain oksidase polifenol, tetapi penulis juga melaporkan bahwa, menurut ke data mereka, gen lagi yang bisa terlibat dalam IB. Lebih

baru-baru ini, menggunakan teknik yang sama pada SCay, Zhou et al. (6) melaporkan bahwa hanya dua PPO terlibat. Oleh karena itu, belum jelas berapa banyak gen PPO dan akibatnya berapa banyak benar-benar terlibat dalam IB dan jika hal ini tergantung dari varietas. Fokus ini studywas onPPOandPODand mungkin mereka keterlibatan dalam gejala kecoklatan. Kami dipisahkan PPO dan POD isoform dalam empat varietas nanas yang berbeda yang menunjukkan ekspresi yang berbeda gejala IB, menggunakan protein sederhana teknik pemisahan berdasarkan elektroforesis pada mini-gel (PhastSystem) diterapkan untuk protein ekstrak buah empat varietas dan hibrida nanas. Hasil ini meningkatkan pemahaman kita tentang mekanisme terlibat dalam IB tetapi juga akan membantu mengembangkan alat-alat sederhana untuk varietas skrining untuk mengidentifikasi orangtua potensial untuk hibridisasi dan dengan cepat mengevaluasi hibrida baru. Peran tembus dan gangguan sel lain yang terlibat dalam pengembangan IB juga dibahas.

BAHAN DAN METODE

Buah Bahan. Empat varietas, Smooth Cayenne (SCay), MD2, dan dua CIRAD hibrida, Flhoran 41 (Flh 41) dan Flhoran 53 (Flh 53), adalah tumbuh di stasiun inMartinique CIRADresearch bawah tropis khas iklim (latitutde 15 N,? bujur 62? W) pada tanah haloisit. Penanaman termasuk praktek-praktek pengapuran (Ca2 , Mg2 ) Dan aplikasi pupuk daun (Urea dan potassiumsulfate, K2O / N = 2.5) dan besi sebagai panen chelate.At, buah kontrol adalah segera beku setelah mengelupas, sedangkan buah dingin disimpan di 8 C selama 1 minggu dan kemudian? satu minggu tambahan di kamar temperatur (24 C?) sebelum mengelupas dan pembekuan. Buah dipanen masak (artinya dapat dimakan dengan penuh rasa dikembangkan tanpa fermentasi). Nanas adalah buah nonclimacteric, terdiri dari 100-120 fruitlets individu dan menunjukkan frombottomto gradien strongmaturity atas. Selain itu, warna eksternal sering tidak mencerminkan aktual tahap kematangan daging. Ciri ini rendering sulit penggunaan indeks tujuan jatuh tempo apabila sebuah varietas perbandingan dibuat. Perlu dicatat bahwa buah-buahan MD2 cenderung menjadi tembus ketika sudah masak. Kecenderungan yang sama diamati dalam Flh 41 saat buah yang sedikit di atas-matang, sedangkan di Flh 53 dan SCay, hanya sangat buah terlalu matang menjadi tembus (data tidak ditampilkan). Panen panggung dipilih untuk mengontrol buah bukan buah-buahan disimpan di 24? C untuk hal yang sama periode, karena dua alasan. Pertama, sulit untuk mengevaluasi waktu yang tepat

penyimpanan di 24? C yang akan mencerminkan sebuah perkembangan penuaan setara dengan buah yang disimpan di 8 C dan? kemudian di 24? C sebagai penundaan penuaan dingin. Kedua, kami mengamati dalam percobaan pada evolusi aktivitas enzimatik selama penuaan yang PPO dan kegiatan POD tidak signifikan berbeda pada panen dan setelah 10-12 hari pada 24? C. Sebenarnya, theywere sangat rendah dalam hal PPO (data yang akan dipublikasikan). IB Skala Browning. Untuk menandai ekspresi gejala IB di varietas yang berbeda, kami menggunakan skala IB disederhanakan dari 1 hingga 3: tingkat 1, tidak gejala sama sekali, tingkat 2, adanya bintik-bintik tembus kecil balik cokelat sepanjang inti buah di dasar fruitlets individu tetapi gejala menyebar hanya sepanjang inti buah; tingkat 3, adanya gejala menyebar lebih luas dalam daging dari core sampai ke tengah fruitlets. Contoh diberikan dengan buah dingin dari Flh 41 pada Gambar 1. Ekstraksi protein. Protein diekstraksi from100 g pulp diambil dari daerah mana IB gejala muncul dalam buah, dekat ke jantung. Daging buah beku hancur dalam blender Waring dengan, di pertama langkah, mL dingin 50 (4 C?) 0.2 M buffer fosfat, pH 6,8, NaCl (0,75 g) untuk meningkatkan daya ionik, dan dengan polyvinylpyrolidone (1 g) dan asam askorbat (0,88 g) dan PI, 150 mg phenylmethanesulfonyl fluorida (PMSF fromSigma) sebagai agen pelindung. Dalam kedua langkah, "jus" diperoleh dalam stepwere pertama disaring onmuslin dan padat lagi residu diekstraksi dengan 20 mL buffer dingin yang sama dan disaring sekali lagi. Para filtrat gabungan telah disentrifugasi selama 25 menit pada 20000g dan residu padat dibuang. Larut protein diendapkan dengan amonium sulfat. Fraksi protein diendapkan antara 30 dan

90% kejenuhan digunakan untuk analisis berikut dua dialyses pada membran (30 kDa) dalam sel Amicon bawah tekanan nitrogen (1 bar). Protein dianalisis dengan menggunakan teknik yang dikembangkan oleh Bradford (35). Aktivitas enzimatik. Tiga buah per varietas yang berbeda dan per tahap pengamatan di 24 C? digunakan sebagai ulangan, dan perbedaan antara DNS dan dingin buah dievaluasi secara independen untuk setiap varietas. Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA sederhana. PPO kegiatan diukur dalam buffer 0.2Mphosphate (pH 6,8), dengan pyrocatechol (50mM) sebagai substrat, reaksi dimulai dengan 0,2 mL protein ekstrak (200 mg protein), dan kemudian peningkatan absorbansi pada 420 nm dipantau selama 4 menit pada 24 C melawan kosong dengan buffer? dan substrat hanya dan pada konsentrasi yang sama (1 unit PPO = 0,1 dDO420/min). Aktivitas POD diukur dalam buffer sitrat 0,2 M (pH 5), dengan 2-methoxyphenol (18 mM), umumnya dikenal sebagai guaiakol, dan H2O2

(2 mM) sebagai substrat, reaksi dimulai dengan 0,2 mL protein ekstrak (20 mg protein). Peningkatan absorbansi pada 470 nm dimonitor selama 2 menit pada 24 C melawan kosong? dengan buffer dan substrat hanya dan pada konsentrasi yang sama (1 unit dDO470/min POD = 1). Semua hasil dinyatakan sebagai aktivitas tertentu, unit / mg protein (U / mg prot). Karakterisasi Enzim. Kita telah mempelajari beberapa karakteristik dari PPO nanas dan enzim POD dalam karya sebelumnya (11). Beberapa karakteristik tambahan telah diperoleh dengan menggunakan substrat yang berbeda untuk PPO (Pyrocatechol, 4-methylcatechol, dan DL dopa). Inhibitor diuji pada kedua enzim: tropolone (1 mM), khusus untuk PPO (36-39), dan KCN (17 mM) untuk POD dan PPO (40, 41). Panas inaktivasi diukur untuk kedua enzim, setelah waktu yang berbeda pada 80 dan 90? C. Pemisahan protein pada Native PAGE. Protein dipisahkan dengan menggunakan yang PhastSystem dengan elektroforesis PAGE asli pada mini-gel dengan poliakrilamida gradien sebesar 8-25%. Sebagai tujuan PAGE pribumi untuk mendeteksi isoform dan tidak untuk membedakan tingkat aktivitas antara varietas, ekstrak protein dilusian (0,7-1,5 mg / mL, untuk POD dan PPO) untuk mendapatkan pemisahan protein terbaik pada gel. sisir khusus dirancang untuk PhastSystem tersebut digunakan untuk deposit sekitar 2 uL sampel diencerkan protein pada gel. Elektroforesis kondisi untuk dua gel dijalankan pada waktu yang sama dengan 250 V 5 mA / gel, 3 W, dan 15? C. Pewarnaan gel. The pewarnaan themini-gelswas diperoleh dengan mencelupkan buffered solusi dengan yang sesuai substrat: masing-masing, 0,025 M Buffer maleat Trizma di pH7 dengan 40mMpyrocatechol dan 2mMCuCl2 dan 0,2 M buffer sitrat pada pH 5 dengan 69 guaiakol mM dan 2 mM H2O2. Protein mengalami 1 menit dari prefiksasi dalam larutan fiksasi (Etanol / acid/H2O asetat, 20V: 5v: 75v) sebelum pewarnaan yang sebenarnya, untuk memungkinkan definisi yang lebih baik pada gel dengan mengurangi difusi protein, terutama di kasus PPO, yang membutuhkan waktu yang lebih lama untuk pewarnaan (dari 1 sampai 3 jam tergantung pada kegiatan tersebut). Setelah pewarnaan, gel difiksasi dalam tersebut di atas fiksasi solusi dan segera diamati dan dipindai. Kecuali ditunjukkan dalam teks, buah digunakan untuk membedakan ekspresi enzim antara varietas dengan pemisahan PAGE asli diklasifikasikan sebagai baik tingkat 1 (buah kontrol) atau tingkat 3 dalam skala IB dijelaskan sebelumnya. HASIL DAN PEMBAHASAN
Gejala IB. Gambar 1 menunjukkan apa gejala tampak seperti dan bagaimana skala untuk gejala IB ditentukan. Buah untuk semua varietas tidak menunjukkan gejala pada saat panen dan tidak ada Gejala hanya setelah penyimpanan dingin. Sedikit gejala (kecil tembus dan bintik-bintik coklat) mulai berkembang setelah beberapa hari kembali suhu kamar (24 C?) dalam buah-buahan dari varietas rentan dan kemudian menyebar luas ke dalam daging. Pada saat yang sama, Gambar 1 menunjukkan bagaimana proses degreening terjadi pada kulit

buah setelah panen. Dalam kasus Flh 41, berbagai merah ketika penuh matang, rincian klorofil mengizinkan anthocyanin muncul, memberikan warna merah buah ini seperti terlihat di salah satu kami sebelumnya bekerja pada varietas ini (42). Gejala pertama benar-benar diamati adalah kecil tembus bintik-bintik pada dasar fruitlets sebelum bintik-bintik coklat dikembangkan. pengamatan serupa juga dilaporkan oleh Zhou et al. (6) dan Weerahewa et al. (8). Selanjutnya, pada Flh 41, tembus berkembang lebih cepat dan lebih nyata dari bintik-bintik coklat, menunjukkan bahwa gangguan sel lain terjadi sebelum penuh ekspresi PPO. Hal ini konsisten dengan pengamatan bahwa over-matang dan tembus buah-buahan, nanas penyakit lainnya yang umum karena hydric dan panas tegangan (11, 7), hampir tidak mengembangkan gejala pencoklatan, bahkan mereka spot karena hitam yang dihasilkan dari Penicillium Fusarium / kutu (43). Ia telah mengemukakan bahwa udara di antar ruang menghilang, memberikan aspek tembus ke daging, tingkat oksigen yang diperlukan untuk pencoklatan enzimatik adalah berkurang (9). Dalam penelitian ini, kami juga mengamati peningkatan tajam dalam kebocoran elektrolit dari daging buah dingin untuk IBsusceptible varietas tapi tidak ada kenaikan untuk MD2, hanya tahan varietas (di tekan). Hal ini menunjukkan bahwa pengurangan membran integritas dalam buah dingin varietas rentan adalah bagian dari seluruh mekanisme yang menyebabkan gejala IB. Kerentanan varietas untuk Chilling. gejala IB diinduksi di semua varietas kecuali MD2. Ketiga varietas rentan (Flh 53, SCay, dan Flh 41) menunjukkan pola yang sedikit berbeda IB. Gejala sangat awal adalah serupa pada tiga varietas, dengan bintik-bintik tembus kecil muncul di dasar fruitlets dekat inti buah (6,7,44,45). Selanjutnya, warna coklat klasik muncul dekat dengan sang buah hati, terutama di Flh 53, yang menunjukkan terkuat gejala. Bintik-bintik cokelat yang sama diamati pada SCay, tapi warna itu tidak sekuat itu untuk Flh 53. Flh 41 konsisten menunjukkan bintik-bintik coklat (tapi mereka tidak gelap seperti bintik coklat pada varietas rentan lainnya) dengan luas tembus dari daging (Gambar 1). Tidak IB induksi di semua bisa diamati di MD2.

Dalam penelitian ini, kami tidak dapat secara konsisten memperoleh intensitas yang sama gejala IB dalam ulangan yang berbeda dengan varietas rentan. Alasan utama untuk perbedaan ini adalah kesulitan yang biasa dalam menentukan tahap yang sama jatuh tempo dalam nonclimacteric buah-buahan seperti nanas andmoreover di berbagai nanas varietas. Alasan kedua adalah mungkin pupuk

ratioK2O / N (2,5:1), yang tidak terlalu menguntungkan untuk pengembangan IB, sebagai tingkat tinggi kalium dengan pupuk aplikasi meningkatkan keasaman dan terutama askorbat asam isi daging (5). Sebagai antioksidan alami dalam buah-buahan, asam askorbat dapat menurunkan gejala IB atau paling tidak menunda mereka penampilan dengan mengurangi kuinon dihasilkan oleh PPO kembali ke fenol (5,11). Isi asam askorbat buah dari empat varietas berbeda jauh dalam kondisi pertumbuhan kita, tertinggi yang diamati dalam MD2. Kemudian kadar asam askorbat lebih tinggi pada Flh Flh 41 dan 53 daripada di SCay (Tabel 1). Di lain percobaan, kuat IB gejala juga dapat diinduksi dalam rentan berbagai Ratu meskipun berbagai ini biasanya kaya asam askorbat (46). Selain itu, Youryon et al. (47) menunjukkan bahwa dalam berbagai asam askorbat tetap tinggi selama penyimpanan dingin bahkan di bidang daging menunjukkan gejala IB. Pengamatan ini menunjukkan bahwa tidak ada hubungan langsung antara kandungan asam askorbat varietas dan kepekaannya untuk IB bahkan jika kadar tinggi di acidmay askorbat penundaan munculnya gejala. Karakterisasi Enzim. Dalam studi sebelumnya (11), kami menyampaikan karakteristik yang berbeda dari beberapa enzim yang berkaitan dengan stres
dan penuaan perlindungan dalam buah nanas termasuk PPO dan POD. Pada penelitian ini, kami menambahkan beberapa data tambahan untuk nanas PPO dan POD. Pertama, aktivitas PPO adalah pyrocatechol menggunakan kuat sebagai substrat dari dopa 4-methylcatechol dan DL (misalnya, dengan pyrocathecol, 18,0 U / mg prot; dengan 4-methylcatechol, 1,67 U / mg prot, dan dengan DL dopa, 1,0 prot U / mg pada protein ekstrak Flh 53). Kedua, kami mengamati pada protein yang sama ekstrak Flh 53 yang penghambatan oleh tropolone, yang spesifik inhibitor dari PPO, sangat efektif hanya pada aktivitas PPO (0,8 dan 58.1 U / mg prot, masing-masing, untuk PPO dan POD). Kalium sianida hampir sepenuhnya menghambat kedua kegiatan. Ketiga, PPO tidak terpengaruh setelah 10min pada 80? C, menunjukkan amuch kuat panas toleransi dari POD, kegiatan yang berkurang 50% setelah hanya 3 menit. Kedua enzim hampir sepenuhnya hancur setelah periode singkat waktu di 90? C. Hal ini diketahui bahwa tergantung pada jenis tanaman dan varietas, PPOmay pameran besar skala toleransi panas tapi biasanya POD pameran yang lebih kuat panas toleransi dari PPO (24). PPO dan POD Kegiatan. aktivitas PPO sangat rendah di kontrol buah-buahan dan tinggi dalam buah-buahan dingin kecuali inMD2, yang nonsusceptible beragam. PPOactivitywas berkorelasi dengan berbagai kerentanan untuk IB (Gambar 2), dan yang konsisten dengan penelitian sebelumnya dalam

yang dua varietas kerentanan yang berbeda dibandingkan (3, 6, 34). 53 Flh menunjukkan peningkatan tertinggi di PPO aktivitas, diikuti oleh SCay dan kemudian Flh 41 (perbedaan antara DNS dan dingin buah-buahan yang sangat signifikan, p <0,01), sedangkan di MD2 tidak ada perbedaan yang signifikan antara buah dingin dan kontrol. Sebaliknya, aktivitas POD lebih rendah pada buah-buahan dingin dibandingkan untuk mengendalikan buah selama empat varietas, khususnya untuk MD2 (semua perbedaan antara kelompok kontrol dan buah-buahan dingin yang sangat signifikan, p <0,01). Di antara varietas rentan, POD kegiatan menurun ketika aktivitas PPO meningkat (Gambar 2). Ini adalah pertama kali perilaku ini telah dilaporkan pada nanas, dan tampaknya sangat berbeda dari apa yang diamati dalam buah-buahan lain dan sayuran seperti melon dan ketimun (32,33,48). PODactivity (Guaiakol) jauh lebih besar dibanding aktivitas PPO (pyrocatechol) bahkan dalam buah dingin, yang konsisten dengan data Teisson (5). Dalam buah-buahan lain dan sayuran atau tanaman daun, aktivitas POD biasanya ditingkatkan dengan stres, karena merupakan bagian dari pertahanan tanaman sistem terhadap tegangan (49, 50). Kegiatan POD sebenarnya peningkatan nanas selama pematangan sebelum menurun lagi ketika buah selesai-matang (11). Signifikansi penurunan dalam PODactivity dalam percobaan kami mungkin berhubungan dengan penuaan buah akibat penyimpanan lama dibutuhkan untuk mengamati perkembangan gejala IB. Sebenarnya, kami menemukan bahwa kegiatan POD, serta seperti yang lain lain peroksidase, peroksidase askorbat, adalah ditingkatkan selama penyimpanan dingin sebelum penurunan kuat setelah kembali ke suhu ruang (data yang akan dipublikasikan). Ini awal meningkat selama penyimpanan dingin mungkin mirip dengan yang diamati untuk buah-buahan lain seperti yang disebutkan sebelumnya. Hasil ini menunjukkan bahwa mekanisme yang bertanggung jawab atas evolusi aktivitas PPO dan POD selama penyimpanan adalah berbeda. Peningkatan PPO diamati hanya setelah buah kembali ke suhu kamar, menyarankan sintesis de novo; Sementara itu, peningkatan cepat POD selama penyimpanan dingin menyarankan mobilisasi enzim yang sudah ada sebelumnya. Kemudian POD kegiatan biasanya menurun dengan penuaan, memberikan kuat perbedaan antara kelompok kontrol dan buah-buahan dingin ditunjukkan pada Gambar 2. PPOandPODIsoform Diffentiation pada NativePAGE Mini (Gambar 3). Elektroforesis pemisahan mengungkapkan beberapa PPO isoform tetapi hanya dalam buah-buahan dingin yang mengembangkan gejala IB.

Banyak PODisoformswere terdeteksi di kedua dingin dan nonchilled buah dari empat varietas. Colorations spesifik untuk PPO (dengan pyrocatechol sebagai substrat) dan POD (dengan andH2O2 guaiakol sebagai substrat) memungkinkan kami untuk membedakan area utama untuk PPO isoform (0,74 <Rf <0,80) dan area utama untuk POD isoform (0,45 <Rf <0,61) (Gambar 3). PPO isoform (Gambar 4). Jumlah PPO isoform terdeteksi jelas berhubungan dengan kerentanan varietas dan adanya gejala IB. Tidak isoform PPO bisa terdeteksi baik dalam buah kontrol (semua varietas) atau dalam MD2 dingin buah-buahan. Satu isoform di Rf = 0,78 adalah umum untuk tiga varietas rentan. Satu isoform di Rf = 0,80 adalah umum hanya untuk SCay dan Flh 53. Akhirnya, dua isoform (Rf = 0,74 dan 0,76) terdeteksi di Flh 53 ekstrak, sehingga dalam empat isoform untuk Flh 53, dua isoform untuk SCay, dan satu isoform di Flh 41 di daerah PPO utama yang disebutkan di atas. Selain itu, dua isoform minor juga terdeteksi untuk SCay andFlh 53 atRf = 0,55 dan 0,59. Ini dapat berupa PPOisoform atau kegiatan PPO PODexhibiting seperti yang disarankan oleh Teisson (5). Ini kemungkinan juga telah disebutkan dalam tanaman lain seperti Discorea esculenta (51), tetapi kedua isoform PPO, meskipun mereka terdeteksi di themain PODarea pada gel, tidak menunjukkan PODactivitywhen guaiacolwas digunakan untuk pewarnaan, menunjukkan bahwa mereka PPO benar. Gambar 3 menunjukkan dengan jelas bahwa PPO isoform di Rf = 0,59 tidak menunjukkan aktivitas POD. Penggunaan tropolone dalam mandi pewarnaan tidak membawa informasi tambahan penentu karena inhibitor ini adalah lambat-mengikat inhibitor (37). Tropolone hanya mengurangi intensitas dari band pada gel tanpa memodifikasi jumlah jelas isoform PPO. KCN, di sisi lain, yang benar-benar diblokir penampilan kedua PPO dan isoform POD (data tidak ditampilkan). Sebagai kesimpulan, terdapat hubungan yang jelas antara varietas kerentanan, yang PPOactivity, dan jumlah PPOisoforms. POD isoform (Gambar 5). Sampai tujuh POD isoform bisa terdeteksi termasuk dua isoform di daerah protein kationik. Jumlah isoform forPODwas lebih tinggi dibandingkan PPO.Using NaCl dalam buffer ekstraksi untuk meningkatkan kekuatan ion, kami tidak hanya diekstraksi POD larut tetapi juga ionically terikat yang. Sejumlah tinggi POD isoform dengan kationik dan anionik isoform juga diamati pada tanaman lain di bawah tekanan (52). Beberapa perbedaan muncul antara buah dingin dan kontrol buah-buahan untuk SCay dan Flh 53 tetapi tidak untuk Flh 41 andMD2. Untuk kedua SCay dan Flh 53, isoform POD di Rf = 0,61 lebih tinggi di dingin buah dari pada kontrol, sebaliknya, mereka yang Rf = 0,54 dan 0,47 lebih ringan, menunjukkan link antara PODexpression dan IB atau, setidaknya, stres dingin. Hasil ini konsisten dengan Weerahewa et al. (8), whomanaged untuk memisahkan dua solublePODs dalam pengendalian dan tiga buah menunjukkan IB.

Membran sel dianggap sebagai target utama mengerikan cedera pada tanaman (50). Gaspar (49) mengusulkan sebuah model interpretatif untuk tanggapan tanaman tekanan melibatkan langkah utama dengan berbagai reaktif oksigen spesies yang dihasilkan oleh depolarisasi membran, yang pada gilirannya dimulai peroksidasi lipid. Degradasi dari membran memungkinkan kebocoran zat terlarut seluler seperti fenolik senyawa asam askorbat, dan K . Langkah berikutnya, termasuk sekresi peroksidase dasar menjadi ruang bebas, menyebabkan protein sintesis seperti amonia lyase-fenilalanin (PAL) dan asam POD dan menghasilkan rigidification membran sel sebagai respons terhadap stres. Data kita sendiri, sebagaimana disebutkan sebelumnya, dan orang lain studi (8) menunjukkan bahwa peningkatan kebocoran zat terlarut dapat diukur dalam tembus terkait dengan IB. Kami juga mengamati seperti kebocoran dengan tembus terkait dengan stress panas selama periode hujan, menunjukkan degradasi sel membran (11). Dalam studi yang sama, kami menemukan bahwa berbeda enzim yang terlibat dalam pengendalian oksidatif menekankan menunjukkan increase.We kuat hipotesis bahwa itu adalah hasil dari tanaman reaksi untuk melindungi sel-sel fromthe stres oksidatif yang dihasilkan oleh stres abiotik awal dan bahwa itu bertujuan untuk memperlambat sel degradasi. Sistem enzimatik termasuk PPO, POD, NADH kuinon reduktase, SOD, dan reduktase glutation, yang dikenal sebagai bagian dari sistem pertahanan tanaman (16, 17). Pada saat yang sama, banyak asam hidrolisis bertanggung jawab untuk dinding sel degradasi menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam tahap akhir buah penuaan. Ini akan menarik untuk menentukan apakah sistem serupa terlibat dalam tembus dari daging yang dihasilkan dari dingin stres bukannya stress panas. Akhirnya, penggunaan PAGE asli pada mini-gel mungkin sederhana dan alat yang berguna untuk screening varietas suseptibilitas nanas untuk IB. Insiden dan keparahan dari gejala setelah dingin penyimpanan terkait dengan peningkatan aktivitas PPO dan dari PPO isoform jumlah yang terlibat, yang juga jelas varietas komponen. Peningkatan ini inPODactivities awal pada awal dingin penyimpanan diikuti dengan penurunan kuat setelah kembali ke kamar suhu; Sementara itu, peningkatan kegiatan PPO diamati hanya setelah kembali ke suhu ruang menunjukkan bahwa mekanisme yang melibatkan PPO dan POD di stres dingin di nanas Hasil dari sintesis de novo untuk PPO tetapi tidak untuk POD. Seperti tembus muncul sebelum kematangan, dan gejala IB terbatas dalam sangat nanas tembus (karena baik untuk dingin atau untuk selama-masak), gangguan sel lain mungkin menjadi penyebab utama penurunan integritas membran sel mungkin bertanggung jawab untuk membuat fenolik substrat yang tersedia untuk enzim PPO dan POD. Dua hal sekarang harus diselidiki untuk lebih menjelaskan mekanisme fisiologis yang terlibat dalam nanas IB. Yang pertama adalah untuk

memverifikasi apakah jumlah isoform PPO mencerminkan aktivasi jumlah gen PPO benar-benar terlibat dalam nanas IB, mereka peraturan, dan implikasinya relatif mereka dalam keparahan gejala. Yang kedua adalah untuk lebih mengidentifikasi gangguan primer terlibat dalam cedera dingin dan kerentanan varietas untuk mereka. Ini harus menyediakan alat tambahan tidak hanya untuk evaluasi ketahanan varietas untuk IB tetapi juga untuk lebih memahami respon nanas ke berbagai cekaman biotik dan abiotik dalam nanas.

SIMPULAN