PAPER KULIAH GENETIKA LANJUTAN PCR DAN SEKUENSING

Oleh :

NAMA : ANDRI RAHMAT NO. BP : 07112044

JURUSAN BUDIDAYA PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS ANDALAS PADANG 2011

A. PCR (Reaksi berantai polymerase)

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. Metode ini bergantung pada siklus termal , yang terdiri dari siklus pemanasan dan pendinginan berulang dari reaksi untuk mencair DNA dan enzimatik replikasi DNA. Primer (fragmen DNA pendek) yang mengandung urutan komplementer ke wilayah target bersama dengan DNA polimerase (setelah yang Metode ini dinamai) merupakan komponen kunci untuk mengaktifkan amplifikasi selektif dan diulang. Sebagai PCR berlangsung, DNA yang dihasilkan itu sendiri digunakan sebagai template untuk replikasi, pengaturan dalam suatu gerak reaksi berantai di mana template DNA secara eksponensial diperkuat. PCR dapat ekstensif dimodifikasi untuk melakukan berbagai macam manipulasi genetik . Reaksi PCR memerlukan komponen-komponen berikut: 1. DNA template - sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur dari satu sama lain. 2. DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR: 1) mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan template DNA dan primer, dan 2) mereka tahan panas. 3. Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer. 4. Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA baru.

5. RT-PCR (R everse T ranscription PCR) adalah PCR diawali dengan konversi RNA sampel ke cDNA dengan enzim reverse transcriptase. Keterbatasan PCR dan RT-PCR: Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial. Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi, membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.

Prinsip kerja Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian perubahan suhu 20-40 berulang, disebut siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari 2-3 biasanya suhu langkah diskrit, biasanya tiga (Gambar 2). Bersepeda ini seringkali diawali oleh satu langkah temperatur tunggal (disebut ditahan) pada suhu tinggi (> 90 C), dan diikuti oleh satu terus di akhir perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan lamanya waktu mereka diterapkan pada setiap siklus tergantung pada berbagai parameter. Ini termasuk enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion divalen dan dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh ( Tm ) dari primer. Adapun tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus sebagai beriktu : 1. Langkah inisialisasi: Langkah ini terdiri dari pemanasan reaksi sampai suhu 94-96 C (atau 98 C jika polimerase termostabil yang digunakan sangat), yang diadakan untuk 1-9 menit. Hal ini hanya diperlukan untuk polimerase DNA yang membutuhkan aktivasi panas dengan panas mulai PCR . 2. Langkah denaturasi : Langkah ini merupakan acara rutin bersepeda pertama dan terdiri dari pemanasan reaksi untuk 94-98 C selama 20-30 detik. Hal ini menyebabkan leleh DNA dari template DNA oleh mengganggu ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan beruntai tunggal molekul DNA. 3. Langkah Annealing : Suhu reaksi diturunkan sampai 50-65 C selama 20-40 detik memungkinkan anil primer ke template DNA untai tunggal. Biasanya suhu anil adalah sekitar 3-5 derajat Celcius di bawah Tm dari primer yang digunakan. Stabil DNA-DNA ikatan hidrogen hanya terbentuk ketika urutan primer sangat erat sesuai urutan template. Polimerase mengikat hibrida primer-template dan mulai sintesis DNA. 4. Perpanjangan / elongasi langkah: Suhu pada langkah ini tergantung pada polimerase DNA yang digunakan; polimerase Taq telah optimumnya aktivitas suhu di 75-80 C, [10] [11] dan umumnya suhu 72 C digunakan dengan enzim ini . Pada langkah ini mensintesis DNA polimerase untai DNA baru melengkapi untai DNA cetakan dengan menambahkan dNTP yang melengkapi template dalam 5 'ke 3' arah, mengembunkan 5'- gugus fosfat dari dNTP dengan 3'- hidroksil kelompok pada akhir untai (memperpanjang) DNA baru lahir. Waktu perpanjangan tergantung baik pada DNA polimerase yang digunakan dan pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Sebagai aturan-of-thumb, pada suhu optimal, DNA polimerase akan mempolimerisasi seribu basis per menit. Dalam kondisi optimal, yaitu, jika tidak ada keterbatasan karena membatasi substrat atau reagen, di setiap langkah

ekstensi, jumlah target DNA dua kali lipat, yang mengarah ke eksponensial (geometris) amplifikasi fragmen DNA spesifik. 5. Elongasi akhir: Ini langkah tunggal kadang-kadang dilakukan pada suhu 7074 C selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan bahwa setiap DNA untai tunggal yang tersisa sepenuhnya diperpanjang. 6. Akhir terus: Ini langkah pada 4-15 C untuk waktu yang terbatas dapat digunakan untuk penyimpanan jangka pendek reaksi. Untuk memeriksa apakah PCR dihasilkan fragmen DNA diantisipasi (juga kadang-kadang disebut sebagai amplimer atau amplikon ), elektroforesis gel agarosa digunakan untuk pemisahan ukuran produk PCR. Ukuran (s) produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan tangga DNA (penanda berat molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran yang dikenal, berjalan di samping gel produk PCR (lihat Gambar. 3).

Gambar 3: etidium bromida bernoda PCR produk setelah elektroforesis gel . Dua set primer digunakan untuk memperkuat urutan target dari tiga sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada amplifikasi hadir dalam sampel # 1; DNA sampel band di # 2 dan # 3 menunjukkan keberhasilan amplifikasi urutan target. Gel juga menunjukkan kontrol positif, dan sebuah tangga DNA yang mengandung fragmen DNA panjang yang ditetapkan untuk ukuran band-band di PCR eksperimental.

B. SEKUENSING Sekuensing DNA adalah metode laboratorium yang digunakan untuk menentukan urutan molekul DNA. Metode ini dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yang kemudian dianugerahi Hadiah Nobel dalam bidang kimia pada tahun 1980 atas kontribusi untuk pemahaman urutan DNA. Akibatnya, sering disebut sebagai Sanger Sequencing. Sekuensing DNA meliputi metode biokimia untuk menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, sitosin, dan timin, dalam oligonukleotida DNA. Dengan menghasilkan urutan DNA organisme tertentu, Anda menentukan pola-pola yang membentuk sifat genetik dan dalam beberapa kasus perilaku. Dalam sekuensing Sanger, DNA yang akan diurutkan berfungsi sebagai template untuk sintesis DNA. Sebuah primer DNA dirancang untuk menjadi titik awal untuk sintesis DNA pada untai DNA yang akan diurutkan. Empat reaksi sintesis DNA individu dilakukan. Keempat reaksi yang normal termasuk A, G, C, dan trifosfat deoksinukleotida T (dNTP), dan masing-masing mengandung tingkat rendah salah satu dari empat trifosfat dideoxynucleotide (ddNTP): ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP. Keempat reaksi ini dapat bernama A, G, C dan T, sesuai dengan yang dari empat ddNTP dimasukkan. Ketika ddNTP adalah dimasukkan ke dalam rantai nukleotida, sintesis berakhir. Hal ini karena molekul ddNTP tidak memiliki gugus hidroksil 3 ', yang diperlukan untuk membentuk link dengan nukleotida berikutnya dalam rantai tersebut. Karena ddNTP secara acak dimasukkan, sintesis berakhir pada posisi yang berbeda untuk setiap reaksi. Setelah sintesis, produk dari A, G, C, dan T reaksi individual dimuat ke empat jalur dari gel tunggal dan dipisahkan menggunakan elektroforesis gel, sebuah metode yang memisahkan fragmen DNA dengan ukuran mereka. Band gel terdeteksi, dan kemudian urutan dibaca dari dasar gel ke atas, termasuk band-band di semua empat jalur. Sebagai contoh, jika band terendah di seluruh empat jalur muncul di jalur reaksi A, maka nukleotida pertama dalam urutan adalah A. Kemudian jika band berikutnya dari bawah ke atas muncul di jalur T, nukleotida kedua dalam urutan ini T, dan sebagainya. Karena penggunaan dideoksi dalam reaksi, Sanger sekuensing juga disebut "dideoksi" sekuensing. Pada tahun 1953, dua peneliti, yaitu James Watson dan Francis Crick, menemukan struktur dasar DNA. DNA pada dasarnya adalah sebuah molekul panjang yang menyimpan kode instruksi untuk sel. Semua sel dalam beberapa cara dikodekan dalam DNA-DNA menyediakan cetak biru dasar yang bertanggung jawab untuk

penciptaan dan fungsi sel. Informasi yang terkandung di dalamnya menentukan mana sel-sel harus tumbuh dan ketika suatu sel tertentu harus mati dan bagaimana sel harus terstruktur untuk menciptakan berbagai bagian tubuh. Misalnya, DNA bertanggung jawab untuk menentukan kualitas rambut kita, warna dan kelimpahan, atau kurang dari itu. Kami menyerupai orang tua kita karena tubuh kita telah dirumuskan oleh DNA membimbing proses, DNA bahwa kita mewarisi dari mereka. DNA dan Nukleotida DNA adalah singkatan untuk asam deoksiribonukleat. Hal ini hadir di hampir semua organisme dan menyimpan informasi jangka panjang yang digunakan untuk membangun suatu badan organis. DNA terdiri dari molekul panjang analog dengan rantai, sementara link dari rantai disebut Nukleotida. Ada empat nukleotida berbeda dalam DNA, yaitu adenin, guanin, sitosin dan timin. Mereka juga disebut sebagai "A", "G", "C" dan "T". Sequencing DNA Sequencing DNA memerlukan beberapa teknik dan metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida tersebut dalam molekul DNA. Memahami urutan DNA telah menjadi bagian integral dari penelitian biologi. Namun, telah menjadi perjuangan yang berat bagi para ilmuwan dan peneliti untuk mengembangkan dan berbagi ide inti DNA sekuensing. Tapi sekuensing DNA telah datang jauh sejak tahun 1970-an, ketika teknik pertama diperkenalkan. Kebutuhan untuk DNA Sequencing Proses sekuensing DNA menerjemahkan DNA dari suatu organisme tertentu ke dalam format yang dipahami oleh para peneliti dan ilmuwan. Sekuensing DNA telah memberikan dorongan besar untuk berbagai bidang seperti biologi forensik, bioteknologi dan banyak lagi. Dengan memetakan urutan nukleotida dasar, sekuensing DNA telah memungkinkan para ilmuwan untuk lebih memahami gen dan peran mereka dalam penciptaan tubuh manusia. Biologi forensik menggunakan urutan DNA untuk mengidentifikasi organisme yang unik untuk. Meskipun mengidentifikasi individu yang kurang akurat saat ini, tetapi sebagai proses berkembang lebih lanjut, perbandingan langsung dari segmen DNA yang besar, dan mungkin bahkan genom, akan lebih praktis dan layak

dan akan memungkinkan identifikasi yang tepat dari individu. Para ilmuwan akan dapat mengisolasi gen yang bertanggung jawab untuk penyakit genetik seperti Cystic Fibrosis, penyakit Alzheimer, distrofi myotonic, dll, yang disebabkan oleh ketidakmampuan gen untuk bekerja dengan baik. Pertanian telah dibantu oleh DNA sekuensing sangat. Ini telah memungkinkan para ilmuwan untuk membuat tanaman lebih tahan terhadap serangga dan hama, dengan memahami gen mereka. Demikian pula, teknik yang sama telah dimanfaatkan untuk meningkatkan produktivitas dan kualitas susu, serta daging, yang dihasilkan oleh ternak. Metode Sequencing Sekuensing DNA upaya untuk memahami urutan basa sepanjang rantai tersebut. Proses sekuensing DNA dapat dihentikan di lokasi yang tepat dan basis dapat diisolasi mana berhenti. 1) Maxam-Gilbert Sequencing Teknik Maxam-Gilbert bergantung pada membelah nukleotida oleh kimia dan yang paling efisien dengan polimer nukleotida kecil. Teknik ini dikembangkan oleh Maxam-Gilbert di tahun 1976-1977 dan diterbitkan dua tahun setelah kertas mencerahkan Plus-Minus pada sekuensing oleh Sanger dan Coulson. Tidak seperti dalam metode awal Sanger, yang mengharuskan bahwa setiap mulai membaca dikloning untuk sintesis DNA beruntai tunggal, metode ini digunakan DNA dimurnikan secara langsung, yang membuatnya sangat populer. Meskipun karena kemajuan dalam metodologi terminasi rantai, metode Maxam-Gilbert menjadi berlebihan. Itu dibuat usang karena itu menjadi kurang ergonomis layak. Hal ini juga dianggap tidak aman karena penggunaan luas bahan kimia beracun. 2) Pemutusan Rantai metode Cara paling sederhana untuk melakukan sekuensing rantai untuk memanipulasi molekul kimia. Daripada katering untuk DNA dengan nukleotida normal, mungkin untuk mensintesis satu adanya gugus hidroksil, yang penting bagi polimerase yang menambah basis berikutnya. Teknik ini juga dikenal sebagai metode Sanger dan bernama setelah penemu Fredrick Sanger.

Reaksi berantai arketipal membutuhkan template DNA, polimerase DNA, dexoynucleotide normal (dNTP) dan deoksinukleotida dimodifikasi (ddNTP). Sintesis untai dilakukan empat kali secara terpisah, yang melibatkan reaksi dengan ddNTP. Ini mengakhiri reaksi karena kurangnya hidroksil yang sangat penting bagi pembentukan ikatan antara dua nukleotida. Hasilnya adalah empat keluarga diskrit polynucleotides. Elektroforesis gel poliakrilamida yang digunakan untuk denaturasi DNA untuk memperoleh untai yang baru disintesis dari template yang diberikan. Tegangan tinggi digunakan untuk memanaskan gel ke 60 derajat Celcius dan ini memastikan bahwa dua untai tidak mengaitkan ulang. Autoradiografi membantu dalam menentukan untaian karena mereka radio berlabel. 3) Dye-terminator Dye-terminator sequencing melibatkan pelabelan rantai mengakhiri ddNTP, yang memungkinkan urutan dalam reaksi tunggal, bukan empat reaksi paralel. Dalam proses ini, masing-masing ddNTP diberi label dengan pewarna fluorescent, yang memancarkan cahaya dalam panjang gelombang yang berbeda. Karena itu adalah kenyamanan dan kecepatan, pewarna terminator sequencing adalah lebih disukai dalam urutan otomatis. Keterbatasan termasuk anomali dalam penggabungan dye terminator rantai berlabel menjadi fragmen DNA, yang dapat mengakibatkan pembacaan abnormal dalam urutan DNA kromatografi melacak elektronik setelah elektroforesis kapiler.