PENGEMBANGAN MIKROORGANISME INDUSTRI

MUTASI DAN SELEKSI

Mutasi: perubahan yang terjadi pada material genetik Mutan: organisme yang mengalami mutasi Mutagen: bahan penyebab mutasi Mekanisme terjadinya mutasi

1.

Mutasi Titik (point mutation) Substitusi pasangan basa oleh pasangan basa lain berlangsung bersamaan dengan proses replikasi. a. Transisi Penggantian satu basa purin (A atau G) oleh purin yang lain, atau satu basa pirimidin (C atau T) oleh pirimidin lain.

ACTGTAATCCTTGA TGACATTAGGAACT
ACTGCAATCCTTGA TGACGTTAGGAACT

b. Transversi Penggantian satu basa purin oleh satu basa pirimidin, atau sebaliknya satu basa pirimidin oleh basa purin. A T A T G C Berdasarkan jenis kodon baru yang dimunculkan, mutasi dapat dibagi atas; a. Mutasi Bisu Mutasi yang menghasilkan kodon yang menyandi asam mino yang sama. Ex: Substitusi ACG menjadi ACA menghasilkan asam amino yang sama, yaitu cystein, UCU dan UCA, keduanya sama-sama menyandi asam amino serine. b. Mutasi Rubah Arah Mutasi yang menghasilkan kodon yang menyandikan asam amino yang berbeda dari yang dihasillkan kodon semula. Ex: perubahan ACG menjadi ACC menyebabkan cystein diganti oleh triptofan.

c. Mutasi Hilang Arah Mutasi yang menghasilkan kodon akhir, sehingga sintesis polipeptida berakhir pada titik tempat terjadinya mutasi. Ex: Perubahan ACG menjadi ACT menyebabkan polipeptida yang dihasilkan lebih pendek dari seharusnya. 2. Mutasi Rubah Angka Terjadi melalui penyisipan atau penghilangan pasangan basa pada DNA Ex: DNA A G T T C G A T G C G G Protein Ser Ser DNA A G T Protein Ser

Tyr Ala

penghilangan

C G G

Ala

Penyisipan atau penghilangan basa pada DNA menyebabkan rantai polipeptida yang terbentuk bertambah panjang atau bertambah pendek. Faktor Penyebab Mutasi 1. Mutasi Spontan Terjadi akibat kesalahan secara acak yang berlangsung dalam proses transkripsi 2. Mutasi Akibat Rangsangan dari Luar a. Akibat unsur fisik Gelombang cahaya pada sinar matahari atau sinar radioaktif, seperti ultraviolet, inframerah, sinar gamma dapat mengakibatkan perubahan struktur basa pada DNA sehingga tidak berfungsi pada proses replikasi.

b. Akibat Bahan Kimia i). Senyawa yang mirip dengan basa DNA (seperti 5-Bromo Urasil dan 2AminoPurin) sehingga ikut tersisipkan sebagai penyusun rantai polinukleotida pada waktu replikasi DNA.

ii). Bahan kimia yang dapat merubah struktur basa pada rantai polinukleotida, bahan kimia tersebut antara lain: Hidroksi amin, asam nitrous, Etil Metil Sulfonat (EMS), Etil Etan Sulfonat (EES), Nitoso Guanidin (NS), Proflavin, dan Guinarcrin Dapat beraksi dengan basa DNA SELEKSI MUTANT YANG DIINGINI Mutasi dapat digunakan untuk merubah aturan metabolisme dan meyebabkan kelebihan produksi produk yang diinginkan. Ex: Produksi penisilin dari 0.001 g/L pada tahun 1939 menjadi 50 g/L. 1. Seleksi Langsung Dapat dilakukan terhadap mutan yang karena proses mutasi justru dapat tumbuh dan bertahan pada suatu kondisi lingkungan spesifik. Ex: mutan yang tahan terhadap antibiotik dapat ditumbuhkan pada media yang mengandung antibiotik. 2. Seleksi Tidak Langsung Bila mutasi meyebabkan mutan tidak mampu memproduksi suatu faktor pertumbuhan (seperti asam amino atau vitamin) auxotrof

Ex: auxotrof lysine kehilangan kemampuan memproduksi lysine sehingga lysine harus disuplai ke dalam media pertumbuhan REKAYASA GENETIKA Tonggak sejarah penting ditemukan enzim spesifik untuk memotong rantai polinukleotida pada lokasi spesifik. Enzim Restriksi (Restriction Endonuclease) Sistem Penamaan: Huruf 1: pangkal nama genus mikroorganisme asal

Huruf 2, 3 (dan 4) : pangkal nama spesies mikroorganisme asal

Angka Romawi: jenis retriksi

Mikroba Asal

Nama Enzim

Lokasi Pemotongan

Bacillus amyloliquefaciens Bam HI

H

GGATCC
GAATCC GGCC GTTGAC

Eschericia coli RY13 Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae

Rd

Eco RI Hae III Hind II

Haemophilus influenzae Providencia stuartii Streptomyces albus G Streptomyces stanford

Hind III Pst I Sal I SstI

GTCAAC AAGCTT CTGCAG GTCGAC GAGCTC

REKAYASA GENETIKA Manipulasi DNA di luar sel untuk menciptakan gen-gen buatan atau kombinasi baru gen-gen yang sudah dirancang dan ditentukan sebelumnya dengan tujuan yang jelas

TEKNIK DNA REKOMBINAN

Suatu teknik mengisolasi gen-gen dari suatu organisme, mengkombinasikan kembali dengan DNA lain, untuk dapat diperbanyak dalam sel induk Langkah-langkah: 1. Pemotongan molekul DNA DNA dari organisme donor dipotong dngan enzim restriksi (restriction endonuclease). Tiap enzim mempunyai tempat pemotongan yang spesifik. Misalnya: Enzim EcoRI selalu memotong DNA pada posisis G AATTC

Sebelum dipotong: G G C C T G A A T T C C TA C CCGGACTTAAGGATG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 bp (base pairs) Setelah dipotong dengan EcoRI G G CC T G dan A A T T C C TA C CCGGACTTAA GGATG Jenis pemotongan seperti ini disebut sticky end Ada juga enzim yang memotong molekul DNA dengan struktur yang lain, misalnya enzim Haelll yang memotong pada posisi GG CC Sebelum dipotong: GGCCTGAATTCCTAC CCGGACTTAAGGATG Setelah dipotong dengan Haelll: G G dan C C T G A A T T C C T A C CC GGACTTAAGGATG potongan jenis blunt end(tumpul)

2. Penggabungan molekul DNA Dua molekul DNA dapat digabungkan kembali dengan menggunakan enzim ligase. Contoh: enzim E. coli DNA ligase dan T4 DNA ligase (enzim yang dihasilkan E. coli yang terinfeksi virus T4). Kedua enzim mensintesa pembentukan ikatan phosphodiesteryang menghubungkan antara satu nukleotida dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaannya hanyalah pada cofactor yang membantu reaksi pembentukan ikatan tersebut. Cofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP Cofaktor untu E. coli DNA ligase adalah NAD+ (Nicotinamide Adenin Dinucleotida) molekul A ATATGTGTG TATAC + molekul B molekul AB ATATGTGTGCCGTACGT TATACACACGGCATGCA

CCGTACGT ACACGGCATGCA

PLASMID Plasmid merupakan molekul DNA di luar kromosom (dalam sitoplasma), biasanya berbentuk bulat dan mampu berkembang biak sendiri. Panjang molekul DNA-nya bervariasi antara 1000 pasang basa (1 kbp) sampai dengan 200 000 pasang basa (200 kbp). Plasmid biasa digunakan sebagai alat untuk memindahkan./membawa gen dari satu organisme ke organisme lain vektor Plasmid mempunyai beberapa gen yang ikut berperan dalam menentukan sifat sel pembawanya, seperti ketahanan terhadap antibiotik tertentu, logam berat, penghasil enzim -galactosidase, dan sebagainya. Gen-gen ini dapat berfungsi sebagai marker dalam menyeleksi sel rekombinan dari sel-sel lainnya.

PLASMID

3. Transformasi Setelah DNA dari organisme donor dan DNA dari plasmid dipotong dengan enzim retriksi yang sama, kemudian digabungkan kembali dengan emzim ligase, maka tugas selanjutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel untuk dapat dikembangbiakkan. 4. Seleksi Sel Rekombinan Perlakuan pemotongan, penyelipan gen asing dan penyambungan kembali dapat mengakibatkan aktif atau inaktifnya selectable markers. Sebagai contoh, gen Lac Z, bakteri yang mengandung Lac Z bila ditempatkan pada media yang mengandung Xgal, akan membentuk koloni berwarna biru tua. Bila gen ini rusak atau dirusak, akan menimbulkan koloni berwarna putih. Dengan cara melihat perubahan warna koloni inilah manusia dapat memonitor berhasil tidaknya suatu gen asing disisipkan, karena ukuran molekul DNA yang sangat kecil tidak memungkinkan manusia melihat DNA tersebut.

PLASMID REKOMBINAN

DNA REKOMBINAN

Herbert Boyer dan Stanley Cohen

(1973) : suatu gen yang

menghasilkan suatu jenis protein tertentu yang dihasilkan oleh suatu

makhluk memungkinkan untuk

dipindahkan ke makhluk lain sehingga makhluk lain tersebut juga bisa menghasilkan protein yang sama

PRODUK REKOMBINAN DNA

Hormon insulin oleh E. coli rekombinan dengan gen yang berasal dari pankreas sapi/babi Enzim chimosine menggantikan enzim rennin yang berasal langsung dari hewan

Kedelai dan jagung transgenik

Memperbaiki/mengganti gengen manusia yang rusak karena penyakit keturunan (terapi gen)

REKAYASA GENETIKA