Pada praktikum kali ini, telah dilakukan percobaan mengenai isolasi DNA plasmid

yang bertujuan untuk memahami metode isolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa
bakteri gram negatif menggunakan GeneJET
T
Plasmid iniprep !it" #akteri yang
digunakan adalah bakteri Escherichia coli yang mengandung plasmid PET$D%ET yang telah
disisipkan resistensi ampisilin" Antibiotik ampisillin termasuk golongan antibitotik beta
laktam, cara kerjanya adalah menghentikan perkembangbiakan bakteri dengan menghalangi
bakteri dari pembentukan dinding yang mengelilingi mereka" Dinding dibutuhkan untuk
melindungi bakteri dari lingkungan dan untuk menjaga isi sel" Ampisilin juga menghambat
pertumbuhan bakteri dengan berikatan dengan en&im DD-transpeptidase sebagai inhibitor
kompetitif yang memperantarai dinding peptidoglikan bakteri, sehingga dengan demikian
akan melemahkan dinding sel bakteri 'al ini mengakibatkan sitolisis karena
ketidakseimbangan tekanan osmotis, serta pengaktifan hidrolase dan autolysins yang
mencerna dinding peptidoglikan yang sudah terbentuk sebelumnya" etode yang digunakan
pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode alkali lisis atau lisis basa" (isis basa adalah
perusakan sel pada p' tinggi dengan )D) *)odium Dodesil )ulfat+, diikuti dengan pelepasan
DNA plasmid, denaturasimaterial dinding sel, dan protein$protein lain"
Prosedur isolasi dia,ali dengan kulti-asi bakteri yang mengandung plasmid yang
akan diisolasi" %mumnya bakteri dikultur selama ./$.0 jam pada media (uria$#ertani broth"
edia (# cair steril media (# terdiri dari beef extract, peptone dan lactose" !egunaan atau
manfaat dari masing$masing komponen pada lactose broth yaitu peptone dan beef extract
merupakan sumber nutrisi esensial untuk metabolisme bakteri" )edangkan fungsi dari laktosa
yaitu sumber karbohidrat untuk bakteri melakukan fermentasi" #akteri Escherichia coli
sangat cocok dan dapat tumbuh baik dalam media ini" Pada umur tersebut, pertumbuhan
bakteri masih berada dalam fase eksponensial" !ulti-asi yaitu memberikan kesempatan bagi
bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam
jumlah banyak" Pemanenan sel dilakukan dengan sentrifugasi" .111 2( suspensi bakteri
dimasukkan kedalam / eppendorf dengan menggunakan mikropipet kemudian di sentrifugasi
pada 0311g selama / menit" Gaya sentrifugal yang ada akan memisahkan massa sel bakteri
yang berbentuk padat dari cairan media pertumbuhan" assa sel akan terendapkan pada dasar
tabung sebagai pelet" %ntuk memperoleh DNA plasmid dalam jumlah yang tinggi, kultur
bakteri yang digunakan dalam isolasi plasmid haruslah yang berada dalam fase logaritmik
akhir atau a,al fase stasioner" )etelah disentrifugasi, supernatannya dibuang kemudian
dimasukkan .m( dd'
/
4 pada salah satu eppendorf, di pipeting kemudian dijadikan satu
dengan pellet yang ada pada eppendorf kedua kemudian di pipeting lagi agar campuran
menjadi homogen" dd'/4 atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air
yang sangat murni, lebih murni dari a5uadest atau pun air reverse osmosis karena telah
melalui berbagai macam cara pemurnian, )ecara umum dd'/4 dibuat dengan mele,atkan
a5uadest ke dalam suatu cartridge berisi resin$resin filter dan deionisasi untuk
menghilangkan ion$ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil
*sekitar 6"6 7 .1
80
)9m
8.
atau .3 : cm+, terakhir air tersebut dile,atkan melalui filter
membran dengan pori$pori 1"// 2l" #iasanya dd'/4 tidak perlu disterilkan lagi
menggunakan autoclave" Pada praktikum ini dd '/4 digunakan untuk pencucian sel yang
sedang di panen agar terbebas dari kontaminan"
!emudian disentrifugasi kembali pada 0311 g selama . menit dilakukan sebanyak /
kali" )etelah itu, supernatan dibuang, pelet sel kemudian diresuspensikan dengan
menggunakan resuspension solution" !edalam eppendorf dimasukkan ./6 2( resuspension
solution, dipipeting agar homogen" Resuspension solution ini merupakan larutan yang
mengandung 61m glukosa, /6m Tris$';l dan .1m EDTA" EDTA berfungsi sebagai
perusak sel dengan cara mengkhelat *mengikat+ kation$kation di-alen seperti g
/<
dan ;a
/<
"
!edua ion ini berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi akti-itas DNAse dalam mencacah
molekul DNA" )elain itu, ion g dan ;a diketahui berperan penting dalam mempertahankan
integritas sel maupun mempertahankan akti-itas en&im nuklease yang merusak asam nukleat
serta menjaga kestabilan membran plasma bakteri sehingga kerja EDTA juga berfungsi
membantu destabilisasi membran" Glukosa berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak
pecah" Tris$';l berfungsi sebagai buffer atau larutan penyangga yang dapat
mempertahankan p' sehingga DNA tetap terjaga pada p'nya" =ungsi dari penambahan
suspension soulution adalah untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan
menggunakan sentrifus
Tahap selanjutnya lisis sel dan denaturasi DNA dengan pemberian lysis solution
sebanyak ./6 2(, kemudian dikocok bulak$balik >$0 kali" ysis solution ini terdiri dari .?
,@- )D) dan 1,/N Na4'" )D) *)odium Dodesil )ulfat+ merupakan garam deterjen anionik,
yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na
<
dan dodesil sulfat"
Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik panjang dengan gugus sulfat
bermuatan negatif pada salah satu ujungnya" Dodesil sulfat akan berikatan dengan bagian
interior lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel" !omponen selular
bakteri termasuk DNA dan ANA akan keluar dan larut" Bon deterjen dodesil sulfat juga
mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan$katan non
ko-alen *terutama ikatan hidrogen+ pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya,
sebagai rantai linier polipeptida" 'al ini membuat protein$protein en&im kehilangan akti-itas
en&imatiknya, termasuk en&im DNAse yang dikha,atirkan merusak DNA plasmid" Pada
tahap ini larutan akan berisi asam nukleat *DNA dan ANA+ dan debris cell yang terdapat
dalam kompleks dodesil sulfat$lipid$protein" Na4' yang bersifat basa membuat seluruh
molekul DNA berutas ganda, baik DNA kromosomal maupun plasmid mengalami denaturasi
menjadi utas$utas tunggal" Btulah mengapa metode ini disebut sebagai metode lisis basa
*al!aline lysis+" Pada tahapan ini, DNA kromosomal terpisah sempurna menjadi utas$utas
tunggal terpisahC sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran tetap terhubung,
seperti dua cincin yang saling bertautan" !arakter ukuran dan struktur kedua jenis DNA
inilah yang menjadi dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal" =ungsi lysis
solutin ini adalah untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membran sel *oleh )D)+, dan
mendenaturasi DNA kromosol namun tidak mendenaturasi DNA plasmid" DNA plasmid
tidak terdenaturasi karena sifatnya yang covalently closed circular DNA
!emudian ditambahkan .D6 2( neutrali"ation solution, kocok >$0 kali"
Neutrali"ation solution ini merupakan larutan kalium asetat p' E6,6, asam asetat glasial dan
a5uadest" Bon !
<
bebas yang berasal dari kalium asetat pada larutan akan menetralkan muatan
negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat$lipid$protein terdenaturasi, membentuk
kalium$dodesil$sulfat *!D)+ yang tidak larut dan terpresipitasi bersama lipid membran dan
protein yang terdenaturasi" Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan
oleh ion hidroksida dari Na4' yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya" !etika p'
larutan kembali netral, ikatan$ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk
kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda" Proses
renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid" %tas$utas tunggal sirkular DNA
plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat berenaturasi sempurna
membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutanC sedangkan DNA kromosomal yang
berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak dapat berenaturasi sempurna, membentuk
struktur kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks
!D)$lipid$protein" (arutan ini berfungsi untuk menetralisir p' menghentikan denaturasi
DNA kromosomal sehingga terbentuk presipitat DNA kromosom yang menempel dengan
debris seluler, dan memisahkan DNA plasmid yang larut di dalam supernatan hingga
terbentuk lisat bakteri" !emudian disentrifugasi pada ./111 g selama 6 menit untuk
mengendapkan debris sel"
!emudian supernatannya dipindahkan kekolom tabung kolektor untuk proses
purifikasi" Purifikasi ini bertujuan untuk membersihkan@memurnikan isolat dari kontaminan
selain DNA" !emudian disentrifugasi pada ./111 g selama . menit bertujuan agar DNA
plasmid yang berada dalam kolom" !emudian supernatant dibuang dan hanya DNA plasmid
yang berada dalam kolom"
!emudian ditambahkan #ash $olution sebanyak /61 2( dan disentrifugasi pada
./111 g selama . menit" !emudian supernatant dibuang dan kolom dimasukkan kembali ke
tabung kolektor" Penambahan #ash $olution bertujuan untuk menghilangkan kontaminan
yang ada di kolom" #ash $olution ini berisi etanol yang berfungsi selain menghilangkan
kontaminan, etanol ini berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan
mengendapkan DNA" Tahap ini dilakukan dua kali bertujuan untuk menghilangkan sisa
#ash $olution yang terdapat dalam kolom"
)etelah itu, kolom dipindahkan kedalam tabung Eppendrof .,6 m( baru" !emudian
ditambahkan Elution %uffer sebanyak F1 2(" !emudian diinkubasi selama / menit pada suhu
ruangan dan kemudian disentrifugasi pada ./111 g selama / menit" Penambahan Elution
%uffer bertujuan untuk mengelusi DNA plasmid atau melepaskan ikatan antara matriks dan
silica gel dengan DNA plasmid" Elution %uffer mengandung .1m Tris$';l p' 3,6 yang
berfungsi sebagai larutan penyangga yang menjaga kestabilan p'" Pada saat memasukkan
Elution %uffer, tip mikropipet tidak boleh menyentuh membrane kolom agar kolom tidak
rusak dan mencegah adanya kontaminan"
!emudian ditambahkan dd'
/
4 sebanyak F1 2( dan diinkubasi selama / menit"
!emudian disentrifugasi pada ./111 g selama / menit dan diperoleh supernatant yang berisi
DNA plasmid *=raksi A+" Penambahan dd'
/
4 bertujuan untuk melepaskan sisa DNA yang
melekat pada matriks dan memekatkan DNA plasmid yang diperoleh" )etelah itu, kolom
dilepaskan dan dimasukkan kedalam Eppendrof .,6 m( baru" !emudian ditambahkan
Elution %uffer sebanyak F1 2( untuk mengelusi DNA plasmid dan diinkubasi selama / menit
pada suhu ruangan" !emudian disentrifugasi pada ./111 g selama / menit dan diperoleh
supernatant yang berisi DNA plasmid *=raksi #+" !emudian kolom dilepaskan dan
dimasukkan kedalam tabung kolektor" !edua fraksi tersebut disimpan pada suhu $/1
1
; agar
DNA plasmid tidak rusak"
)etelah proses isolasi DNA plasmid selesai, sampel diuji menggunakan elektroforesis"
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas
ukuran *berat molekul+ dan struktur fisik molekulnya" akin besar ukuran molekulnya,
makin rendah laju migrasinya Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan
partikel$partikel bermuatan negatif *anion+, dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju
kutub positif *anode+, sedangkan partikel$partikel bermuatan positif *kation+ akan bergerak
menuju kutub negatif *anode+ 'asil elektroforesis ini dapat diamati dengan bantuan sinar %G
dimana akan terlihat pita pita DNA . Elektroforesis ini juga dapat digunakan untuk
mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui
ukurannya"
igrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka
bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya" %ntuk plasmid
yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA
kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA
plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA" #entuk DNA plasmid yang
diperoleh juga ber-ariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang
tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan
plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi"
#entuk DNA *plasmid+ yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA
dengan bentuk supercoiled" Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi,
relaHed circular, linear, dan nicked open circular" DNA plasmid yang digunakan untuk proses
elektroforesis ini tidak dapat dijamin .11? kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam
bakteri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan
jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA
kromosom dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk
tahap selanjutnya" Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi
migrasi DNA, yaituI ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus
listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan
komposisi buffer elektroforesis"
Kesimpulan
Praktikan dapat mengisolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa bakteri gram
negatif Escherichia coli menggunakan GeneJET
T
Plasmid iniprep !it dengan
melakukan beberapa tahap yaitu I tahap kulti-asi dan harvesting , tahap lisis dan tahap
pemurnian DNA plasmid" )etelah, hasil isolasi DNA kromosom diuji dengan
elektroforesis"