REKAYASA GENETIKA

RESUME
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika II
Dibimbing oleh Prof. Dr. Duran Corebima A., M.Pd
oleh
Kelompok 16
i!o Kharist "ein #1$$%&1&$&616'
Putri Dhamira #1$$%&1&$&6(&'
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
)o*ember ($1(
REKAYASA GENETIKA
+erikut ini dikemukakan arti reka,asa genetika #genetic enginecring' ,ang
dikutip dari tiga sumber
eka,asa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan
!ara mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu #Mi!los, dkk,
1..$'.
eka,asa genetika adalah manipulasi geneti! dalam sel untuk
menghasilkan suatu sifat ,ang dikehendaki ,ang biasan,a disebut
teknologi rekombinan D)A #asmussen, dkk, 1..$'.
eka,asa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau
indi*idu dengan !ara pemindahan selektif, insersi atau dengan modifikasi
gen balik ,ang indi*idual maupun ,ang berupa perangkat gen #Klug, dkk,
1..&'.
+erdasarkan kutipan tersebut,pada reka,asa genetika terdapat manipulasi
atas materi genetik dengan !ara menambah atau menghilangkan gen tertentu.
+erbagai fenomena genetik alami /ika di!ermati dapat men/adi model alami dari
teknik reka,asa genetika !ontohn,a crossing over, gene pick up, transduksi, dll.
0enomena ini ter/adi pemutusan, pen,ambungan, serta perpindahan bagian materi
genetik ,ang dapat mengakibatkan penambahan atau perpindahan suatu gen atau
beberapa gen.
PROSES REKAYASA GENETIKA
Menurut 1mith dan +,ars #1..$' terdapat berbagai teknik ,ang digunakan
dalam teknik reka,asa genetika meliputi teknik *ektor, in/eksi mikro, fusi
protoplas, dan elektoporasi. 1elain itu klug menambahkan /uga teknik
kopresipitassi kalsium pospat dan endositosis dan dikenal pula teknik pro,ektil
mikro.
Transfer Vektor
2ransfer *ektor merupakan !ara memasukan suatu gen ke sel baru dengan
menggunakan pemba3a #carrier' khusus ,ang memanfaatkan proses alami seperti
pada transfer D)A oleh bakteri dan *irus. 4ektor,ang digunakan adalah plasmid,
bakteriofage dan cosmid #russel, 1..('.
1e!ara kimia3i *ektor-*ektor tersebut adalah molekul D)A. 1ebagai
*ektor suatu molekul D)A harus memiliki sifat-sifat ,ang harus dimiliki D)A
seperti di ba3ah ini #Klug, dkk.,1..&'
Molekul D)A mampu melekukan replikasi sendiri maupun
replikasi segmen D)A ,ang diinsersikan bebas dari replikasi
kromosom sel inang dengan !ara membuahi suatu 5ori6
Molekul D)A harus mengandung se/umlah tapak pemutusan
en7im retrisi khusus ,ang bermanfaat untuk insersi segmen-
segmen D)A.
Molekul D)A harus membuhai suatu penenda ,ang dapat
dimanfaatkan.
Molekul D)A harus mudah terbebas kembali ari sel inang.
1elain sifat-sifat itu ada pula sifat lain ,ang diharapkan #8ld dan Primrose,
1.9.'
+etar molekul rendah
Adan,a kemampuan untukmemberikan sifat fenotip ,ang dipilih
dengan segera pada sel inang.
a. Plasmid
Plasmid terbentuk se!ara alami invitro. Plasmid terdapat pada E. coli
#plasmid 10 (1(& merupakan derifat dari plasmid Col:1'. Plasmid-plasmid itu
terdapat pada E.coli #plasmid 10(1(& merupakan deri*at dari plasmid Co:1'.
b. +akteriofag
+akteriofag ,ang ban,ak digunakan dalam teknologi D)A rekombinan
pada E.coli adalah fag . 1eluruh gen fag sudah diidentifikasi dan dipetakan
urut-urutan genom se!ara keseluruhan sudah diketahui. 1eluruh deri*at fag
,ang digunakan sebagai *ektor transfer sudah direka,asa sehingga han,a siklus
titik sa/a. Deri*at-deri*at fag lebih dari 1$$ deri*at ,ang dimanfaatkan sebagai
*ektor dibuat dengan !ara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah
tengah.
1elain bakteriofag ,ang digunakan sebagai *ektor, salah satun,a adalah M
1%. Materi genetik pada M 1% berupa D)A unit tunggal. ;ika M 1% menginfeksi
suatu sel bakteri, D)A unting tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model
D)A unting ganda ,ang disebut 0 #eplikasi 0orm'. Molekul 0 setara dengan
plasmid dan D)A asing dapat diinsersikan ke tapak-tapak pemutusan en7im
retriksi tunggal ,ang ada pada genom. 1usunan dari molekul 0 terdiri dari suatu
unting tunggal #<' ,ang mengandung satu unting segmen D)A ,ang diinsersikan.
Klon D)A unting tunggal ,ang di hasilkan oleh M 1% dapat digunakan untuk
pengurutan D)A atau sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat
mutasi.
!. Kosmid #cosmid'
Kosmid adalah *ektor ,ang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-
urutan !os dan fag ,ang berguna untuk pemasukan=pegumpulan kromosom ke
dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan #bagian tengah kosmid'
untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan
plasmid dan fag , !ontoh plasmid ,ang digunakan Pbr%((.
d. 4ektor ulang-alik #Shuttle vectors'
1elain *ektor-*ektor transfer seperti plasmid, bakterio fag , dan kosmid
,ang digunakan untuk pengklonan D)A, *ektor lain ,ang dimanfaatkkan untuk
memanfaatkan untuk memasukkan molekul-molekul D)A rekombinan ke dalam
sel prokariotik maupun eukariotik. 4ektor-*ektor sema!am itu disebut *ektor
ulang alik atau shuttlr vectors. 4ektor ulang alik atau shuttlr vectors adalah *ektor
pengklon ,ang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih mahkluk hidaup inang.
3. Injeksi mik!" #$si %!&!%'(s" e'ek&!%!(si" k!%esi%i&(si k('si$m #!s#(&
)(n en)!si&!sis" se&( %!*eksi mik!
Pada in/eksi mikro menggunakan /arum mikroskopis,untuk memasukkan
D)A melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi
protoplas ter/adi pelarutan dua membran sel dari sel-sel ,ang berbeda sehingga
dua sel dapat di gabung men/adi satu, misaln,a fusi antara sel sel-sel ,ang di
kultur dengan protoplas bakteri ,ang mengandung D)A eksogen. 0usi protoplas,
suatu sistem transformasi ,ang memanfaatkan liposom ,ang tersusun dari suatu
lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau
transfeksi ,ang disebut sebagai lipofeksi #lipofection'.
Pada teknik eletroporasi menggunakan listrik untuk men!iptakan lubang
ke!il di membran sel ,ang akan dimanfaatkan untuk pemindahan D)A ke dalam
sel. +erkenaan dengan elektroporasi informasi dari 8ld dan Primrose #1.9.'
men,ebutkan bah3a pada pendedahan singkat ke/utan listrik berkekuatan antara
&$$$-9$$$ 4, sel-sel memperoleh D)A eksogen dan larutan sekitar #tampakn,a
melalui lubang-lubang ,ang terbentuk sesaat pada membran plasma' dengan
ke/utan listrik akan meningkatkan frekuensi efisien transformasi #Potter dkk.,
1.9& dalam 8ld dan Primrose, 1.9.'.
Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampakn,a butir-
butir kopresipitas kalsium fosfat dan D)A masuk ke dalam sel melalui endositosis
fagositosis #8ld dan Primrose, 1.9.'. Pada teknik ini merupakan !ara umum
memasukkan suatu D)A ke dalam sel-sel mamalia.
Pada teknik pro,eksi mikro, D)A ataupun )A ditembakkan ke dalam sel
#Klein dkk., 1.9> dalam 8ld dan Primrose 1.9.', teknik ini merupakan suatu !ara
,ang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan
memanfaatkan ke!epatan tinggi. Pada teknik pro,eksi mikro membutuhkan kultur
sel ataupun perlakuan /aringan resipien.
P!se)$ D(s( Tekn!'!+i DNA Rek!m,in(n
?rutan proses ,ang men/adi prosedur dasar pada teknik D)A rekombinan
,ang diperantai *ektor akan dikemukakan lebih lan/ut #Klug dkk., 1..&'.
Pembuatan fragmen D)A dengan bantuan en7im nuklease retriksi ,ang
mengenal dan memotong molekul D)A pada urut-urutan nukleotida ,ang
spesifik
1egmen-segmen digabung ke molekul D)A lain dengan bantuan *ektor.
4ektor dapat bereplikasi se!ara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi
dan identifikasi molekul D)A ,ang baru terbentuk.
4ektor ,ang sudah terinsersi segmen D)A ditransfer ke suatu sel inang.
Molekul D)A rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin ,ang
disebut klon-klon.
1egmen-segmen D)A ,ang diklon dapat diambil dari sel inang.
1el-sel inang ,ang mengandung D)A rekombinan me3ariskan kepada
seluruh sel turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel identik ,ang
semua memba3ahi urut-urutan ,ang dklon.
1e!ara potensial, D)A diklon dapat ditranskripsikan, )A-d
ditranslasikan serta produk-produk gen diisolasi dan di ka/i.
Pe(n En-im En)!n$k'e(se Re&iksi
Pada urutan pertama proses ,ang men/adi prosedur dasar teknik D)A
rekombinan ,ang diperantai oleh *ektor en7im endonuklease dibutuhkan untuk
memotong molekul D)A dalam rangka pembuatan fragmen D)A. Molekul D)A
rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa abntuan en7im endunuklease restiksi.
Penanaman endunuklease restiksi di beri nama berdasarkan ma!am makhluk
hidup tempat en7im tersebut diisolasi se!ara kon*ensional digunakan sistem tiga
huruf dalam posisi huruf miring ,ang diikuti dengan suatu angka roma3i.
:n7im endonuklease retriksi terbagi men/adi dua kelompok atau tipe
#ussel, 1..('. 2ipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida ,ang
spesifik pada D)A dan selan/utn,a memotong D)A pada suatu tapak tidak
spesifik /auh dari urutan. :n7im endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu
bermanfaat untuk pembentukan molekul D)A rekombinan. :n7im endonuklease
restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada D)A namun tipe ini
memotong D)A di dalam urutan #ussel,1..('. :n7im endonuklease restriksi
bermanfaat untuk pembentukan molekul D)A rekombinan.
?ntuk pengenalan e7im endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu
sumbu simetri ,ang mele3ati titik tengah urutan pengenalan #ussel, 1..('.
Dalam urutan basa @A %A pada unting D)A sama dengan urutan basa @A %A
pada komplementern,a.
:n7im endonuklease restriksi sudah diisolasi dari se/umlah besar strain
bakteri ,ang berbeda #ussel, 1..('. 8leh karena itu setiap en7im memotong
D)A pada suatu pasangan nukleotida ,ang spesifik untuk en7im ,ang
bersangkutan, /umlah potongan ,ang dibuat en7im pada suatu molekul D)A
tertentu tergantung pada /umlah berapa kali urutan pengenalan ditemukan pada
D)A.
:n7im endonuklease restriksi tipe II menghasilkan u/ung-u/ung lan!ip
,ang memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmen-fragmen D)A /ika kedua
u/ung ta/am hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk
pasangan basa ,ang sempurna.
Peluang /umlah tapak pemutusan pada suatu D)A oleh en7im
endonuklease restriksi II dapat dihitung dalam kaitann,a dengan /umlah pasangan
nukleotida pada setiap urutan pengenal, sepan/ang keberadaan tiap pasangan
nukleotida bersifak a!ak. Peluang /umlah tersebut ditun/ukkan pada tabel berikut.
Pasangan nukleotida pada tapak
restriksi
Probabilitas ke/adian
& #1=&'
&
B 1 dalam (@6 bp
@ #1=&'
@
B 1 dalam 1$(& bp
6 #1=&'
6
B 1 dalam &$.6 bp
9 #1=&'
9
B 1 dalam 6@, &>6 bp
11 #1=&'
11
Se'eksi K'!n Rek!m,in(n
Pada urutan dari fragmen D)A restriksi ,ang ditranskripsikan men/adi
)A atau membuat peta urut-urutan hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen
restriksi. 8leh karena itu, 1outhern mengembangkan suatu metode untuk
mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel agarose ,ang komplementer denga
urutan )A atau D)A tertentu, metode ini dikenal dengan 1outhern +lotting.
Pada inti metode ini mentransfer makro molekul dari gel ,ang berarti telah di
pisahkan se!ara elektroforesis ke suatu permukaan membran.
MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIKA
Manfaat reka,asa genetika dapat dilihat kaitann,a dengan analisis genetik,
diagnosis atas pen,akit manusia, terapi gen, sidik /ari D)A, serta bioteknologi
#Klug dkk, 1..&'.
An('isis Gene&ik(
Para ahli genetika menggunakan teknik-teknik D)A rekombinan untuk
analisis genetik #Klug dkk, 1..&'. 2eknik-teknik ini memungkinkan pengadaan
suatu kumpulan klon ,ang meliputi keseluruhan klon, demikian pula
memungkinkan pemetaan genetika maupun fisik ,ang lengkap, serta
memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan kromosom. Peta
fisisk ,ang dihasilkan memperlihatkan seluruh gen pada genom ,ang di tandai
oleh urutan nukleotida, tanpa pula memperhatikan mutan bahkan sering tanpa
dukungan pengetahuan a3al tentang fungsi atau fenotip dari gen-gen ,ang
dipetakan.
Di(+n!sis m!'ek$'e (&(s %en*(ki& m(n$si(
Pemanfaatan urutan D)A ,ang diklon memungkinkan pengamatan
langsungterhadap genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen ,ang
belum di kenal atau ,ang tidak terekspresi. Contoh deteksi molekuler dapat
dilakukan atas Thelessemia dan Sickle cell anemia.
Te(%i +en
Kemampuan mengisolasi dan mengklon gen-gen spesifik manusia ,ang
pada mulan,a dikembangkan sebagai suatu penelitian. Proses terapi sema!am ini
di sebut terapi gen. Metode ini dikembangkan untuk memasukkan gen ke dalam
sel manusia, termasuk pemanfaatan *ektor *irus maupun fusi sel dengan *esikula
buatan ,ang mengandung urutan D)A ,ang diklon, transfer kimia3i ,ang
mendorong pengangkutan gen mele3ati membran sel /ika sudah dilakukan.
Panduan terapi gen sudah disusun dan men!akup beberapa pers,aratan
#Klug dkk., 1..&' ,ang akan dikemukan lebih lan/ut.
Gen harus diisolasi dan ditransfer.
Cara transfer gen ,ang efektif harus ada.
;aringan target harus dapat di!apai, sebagai !ontoh per!obaan terapi gen
,ang pertama menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekursorn,a
sebagai /aringan target.
2erapingen tidak boleh men,akiti pasien dan sudah tidak ada !ara terapi
lain ,ang efektif.
Pe&(n*((n
1. +agaimana proses in/eksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi,
kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis, serta pro,eksi mikroC
;a3abD Pada in/eksi mikro menggunakan /arum mikroskopis,untuk
memasukkan D)A melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti
sel. 0usi protoplas, suatu sistem transformasi ,ang memanfaatkan liposom
,ang tersusun dari suatu lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai
suatu sistem transformasi atau transfeksi ,ang disebut sebagai lipofeksi
#lipofection'. Pada teknik elektroporasi menggunakan listrik untuk
men!iptakan lubang ke!il di membran sel ,ang akan dimanfaatkan untuk
pemindahan D)A ke dalam sel. Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat
dan endositosis tampakn,a butir-butir kopresipitas kalsium fosfat dan
D)A masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis. Pada teknik ini
merupakan !ara umum memasukkan suatu D)A ke dalam sel-sel mamalia.
Pada teknik pro,eksi mikro, D)A ataupun )A ditembakkan ke dalam
sel, teknik ini merupakan suatu !ara ,ang sama sekali baru untuk
memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan
ke!epatan tinggi. Pada teknik pro,eksi mikro membutuhkan kultur sel
ataupun perlakuan /aringan resipien.
(. Apakah ,ang membedakan antara en7im endonuklease retriksiC
;a3abD 2ipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida ,ang
spesifik pada D)A dan selan/utn,a memotong D)A pada suatu tapak
tidak spesifik /auh dari urutan. :n7im endonuklease restiksi tipe I tidak
terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul D)A rekombinan. :n7im
endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik
pada D)A namun tipe ini memotong D)A di dalam urutan. :n7im
endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri ,ang mele3ati
titik tengah urutan pengenalan. Dalam urutan basa @A %A pada unting
D)A sama dengan urutan basa @A %A pada komplementern,a.
%. Apa ,ang dimaksud dengan kosmid, /elaskan E
;a3abD Kosmid merupakan *ektor ,ang dibangun di laboratorium
memanfaatkan urut-urutan !os dan fag ,ang berguna untuk
pemasukan=pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan
memanfaatkan pula urut-urutan #bagian tengah kosmid' untuk fungsi
resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid
dan fag