ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh :
Nama
NIM
Rombongan
Kelompok
Asisten

: Saefullah Habibi
: B1J0008010
: VI
:3
: Zakiyyah

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2011

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T)
yang memiliki struktur cincin-tunggal. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan
materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah
set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi
menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun
pada tumbuhan.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Hasil dari berbagai
manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis
yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan
meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis didasarkan
pada perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara
keduanya. Karena elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan
listrik pada medan arus listrik maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke
elektroda bermuatan positif (kutub positif) dan molekul bermuatan positif akan
bermigrasi ke arah kutub negatif.
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan
fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah
pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui
ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu,
elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk
mengisolasi

masing-masing

komponen

dari

campurannya,

mempelajari

fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis

dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang
dikandung suatu sekuen DNA tertentu.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA
menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan
mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara
akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik
diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju
elektroda positif. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam
teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut
berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena
pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun
biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi,
sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.
B. Tujuan
Praktikum kali ini bertujuan untuk melihat cara kerja dan prinsip
elektroforesis gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi Gelas ukur 1000
ml, Labu erlenmeyer 50 ml, Mikropipet beserta tip, Sarung tangan, Kertas parafilm,
Seperangkat alat elektroforesis, UV transiluminator dan Kamera (Foto digital).
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi DNA produk
PCR (DNA No. 9), DNA marka (DNA yang dipotong dengan Hind III), Agarosa,
Larutan buffer TAE 1X (tris-base, asam asetat glacial dan EDTA), Akuades,
Loading dye (Bromophenol blue, xylene cyalol) dan Larutan Etidium Bromid
(EtBr).
B. Metode
1. 10 ml larutan buffer TAE 0,2M + 500 mL akuades dihomogenkan (larutan 500
mL TAE 1x).
2. Gel agarosa 0,2 g + TAE hingga 20 ml (agarosa 1%), dididihkan hingga larut
sempurna.
3. Disiapkan baki elektroforesis dan diletakkan selotip disetiap ujung baki
elektroforesis.
4. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki dengan posisi hampir
menyentuh dasar baki.
5. Dituang larutan agarosa 60C ke dalam baki elektroforesis dan dibiarkan hingga
larutan berubah menjadi gel yang padat.
6. Sisir diambil dengan hati-hati kemudian selotip dilepaskan dari ujung-ujung
baki.
7. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukan ke dalam tangki elektroforesis
yang telah diisa dengan larutan buffer TAE 1x (dipastikan bahwa gel terendam
seluruhnya dalam TAE).
8. Disiapkan kertas parafilm, dimasukkan 10L sampel DNA dan 2L loading dye
6x ke dalam sumuran gel dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut
terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm.
9. Elektroforesis dinyalakan, diatur voltase dan waktunya (70 V, 35), dirunning.
10. Hasil running diangkat menggunakan sarung tangan, gel agarosa dimasukkan ke
dalam EtBr selama 2 menit kemudian dipindahkan ke aquades selama 1.
11. Gel dikeluarkan kemudian divisualisasikan pada UV transiluminator.

12. Didokumentasikan dengan kamera.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Visualisasi DNA Hasil Elektroforesis

B. Pembahasan
Berdasarkan hasil visualisasi DNA setelah dielektroforesis diperoleh bahwa
pita DNA marka tidak muncul, sedangkan DNA sampel menghasilkan pita-pita
DNA. Hal tersebut dapat terjadi karena DNA marka terdenaturasi sebelum
dielektroforesis, penyimpanan DNA marka setelah selesai digunakan tidak
disimpan kembali pada lemari pendingin. Menurut Standfield et al. (1996),
kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA telah mengalami
depolarisasi. Perlu diperhatikan bahwa pemberian arus listrik pada gel agarosa tidak
boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan
merubah bentuk pita DNA. Beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita
DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam
sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang
terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel
agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak
ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam
elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 50 menit dengan menggunakan arus 50
mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open
circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk
berbeda-beda

sehingga

kecepatan

migrasinyapun

berbeda.

Hal

tersebut

menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju

migrasinya (Sambrook & Russel 2001).
Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis merupakan proses bergeraknya
molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Klug and

Cummings (1994) menambahkan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik yang

mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam
suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan
partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak
menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation)
akan bergerak menuju kutub negatif (anode).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000
pasang basa (pb). Prinsip dasar tekhnik elektroforesis ini adalah DNA, RNA, atau
protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel biasanya dilakukan
untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai tekhnik preparatif
(Standfield 1996).
Menurut Rachmaniar (1998), agarosa merupakan polimer dari 3,6-AnhidroL-galaktosa dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak
bermuatan. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut,
rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum atau bisa juga dari jenis
golongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika dilarutkan
dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang digunakan
untuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan denga agar yang digunakan
untuk kultur bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai dengan
konsentrasi agarosa.
Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandung
larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik
untuk DNA. Gel agarosa mempunyai

laju pemisahan lebih cepat, dapat

memisahkan fragmen DNA antara 100 bp50 kb tergantung dari konsentrasi gel
agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal.
Fungsi dari masing-masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikum
elektroforesis adalah:
1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada medium
karena keringat mengandung DNAase dan melindungi toksik dari EtBr. Selama

pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin

(Faatih, 2009).
2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA.
3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah dirunning.
4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampel
DNA dengan loading dye.
5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA.
6. EtBr, digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan
menunjukan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda.
7. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai penanda
jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya
elektroforesis.
8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat glasial
sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak
DNA yaitu DNAase).
9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.
10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70 V
selama 35 menit.
Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yang mempengaruhi
Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa, sebagai
berikut:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier
lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah
laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.
2. Konsentrasi gel agarosa
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai
dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya adalah:
log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah
retardation coefficient, dan

adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic

mobility DNA.
Tabel 1. konsentrasi gel agarosa dan ukuran molekul DNA

No

Konsentrasi Gel

Effisiensi range Pemisahan

Agarosa (%)
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0

pada DNA linier (kb)

60-5
20-1
10-0.8
7-0.5
6-0.4
4-0.2
3-0.1

1
2
3
4
5
6
7
3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu

bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II),
dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju
migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

Konsentrasi gel agarosa

Kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

Densitas kembaran superheliks pada bentuk I

Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,

pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh
untuk bentuk I

Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg.

Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju migrasinya

dan semakin basar berat molekul DNA maka laju migrasinya pun semakin lambat.
Berdasarkan ukuran, semakin berat molekul DNA maka semakin lambat laju
migrasinya, begitu juga sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan struktur
molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk covalently closed
circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang paling lambat adalah bentuk
open circular (OC).

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarosa bergerak 5v/cm. Arah dari bidang
elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan
berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,
mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan
pada suhu kamar
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent Ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa
DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit
DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media
UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau doublestranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk
single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum.

III. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut:
1. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan
listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya.
2. DNA bermuatan negatif sehingga DNA akan bergerak menuju kutub positif
(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anode).
3. Semakin padat gel agarosa dan berat molekul DNA maka akan semakin lambat
laju migrasinya.

B. Saran
Pelaksanaan praktikum lebih bekerja secara aseptis dan teliti. Penggunaan
sampel DNA yang digunakan lebih diperhatikan agar tidak terjadi denaturasi.
Selanjutnya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya demo dalam penggunaan alat
agar semua praktikan dapat mengetahui secara detail penggunaan alat.

DAFTAR REFERENSI
Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi, 10(1):61 67.
Fatchiyah. 2006. Electroforesis Migration Rate. Laboratorium Sentral Biologi
Molekuler & Seluler Universitas Brawijaya Malang, Malang.
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall,
Englewood cliffs.
Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed,
Purwokerto.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor
1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.
Rachmaniar. 1998. Pemisahan Agarosa dari Polisakarida Agar. Buku Produk Alam
Laut I. Puslit Oseanografi LIPI, Jakarta.

Sambrook, J., Russel D. W. 2001. Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual

3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Stanfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996. Molecular and Cell Biology. Mc
Graw-Hill, New York.