BAB I

PENDAHULUAN
1.1................................................................................................Latar Belakang
Enzim merupakan biokatalisator organik dan dibuat dalam sel mahluk
hidup sehingga enzim disebut juga biokatalisator dan juga enzim memiliki sifat
diantaranya, selektif, karena enzim hanya dapat bekerja pada substrat tertentu
(Cartono, 2004). Enzim

adalah biomolekul berupa protein yang

berfungsi

sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi)
dalam suatu reaksi kimia organik (Smith, 1997).
Secara alami sebenarnya enzim telah disediakan oleh alam, namun untuk
keperluan industri umumnya disbutuhkan enzim dalam jumlah yang lebih besar.
Untuk itu, belakangan ini untuk tujuan industri telah dikembangkan enzim hasil
rekayasa yang memiliki berbagai macam keunggulan, antara lain mampu
diproduksi dalam skala besar dengan biaya yang murah dan waktu yang relatif
lebih cepat (Sudjadi, 2008).
Dalam bidang peternakan enzim dapat dimanfaatkan antara lain dalam
industri pakan, pengolahan hasil ternak seperti keju, susu pasteurisasi, hingga
dibidang bioteknologi peternakan molekuler. Dalam industri pakan yang
digunakan memperbaiki nilai nutrisi dimana dibutuhkan dalam pencampuran
ransum pakan ternak. Ciang et al (2005) menambahkan bahwa penggunaan
xilanase pada pakan dasar gandum dapat meurunkan viskositas digesta dan
meningkatkan pertambahan bobot bada ayam broiler 6 mingu thingga 14,72%
dan 2,60%. Renin mikrobia mampu menggumpalkan susu seperti enzim renin
sapi. Fredrich dan Fuller (1988) mengatakan bahwa tidak ada perbedaan yang
nyata dalam proses pematangan dan produk akhir keju yang dihasilkan melalui
penggumpalan dengan enzim rennin mikrobia maupun rennin lambung anak sapi

dan membuktikan kemampuan enzim dalam dunia industry, yaitu memperbaik

mutu produk dan enzim mampu menghemat biaya produksi melalui substitusi
bahan dasar fermentasi.
Enzim yang berasal dari alam (native) maupun yang berupa rekombinan
harus melalui tahapan pemurnian atau purifikasi dimana purifikasi adalah suatu
proses untuk memurnikan protein rekombinan dengan protein lain yang juga
diekspresikan dan dihasilkan oleh sel inang. Immobilized Metalchelate Affinity
Chrimotoghraphy (IMAC) atau dikenal dengan nama kromotografi afinitas
merupakan salah satu cara yang cukup baik untuk memurnikan suatu protein
(Muhaimin et al., 2005). Teknik tersebut didasarkan pada sifat beberapa asam
amino seperti histidin, triptofan, tirosin, atau fenilalanin, yang dapat berikatan
secara spesifik dan reversibel dengan suatu ion logam yang biasa disebut dengan
ligan. Ligan-ligan tersebut dapat berikatan secara kovalen pada suatu matriks
yang disusun dalam suatu kolom kromatografi (Carlton dan Zachariou, 2008).
Enzim laktat dehidrogenase-parasit (pLDH) merupakan enzim glikolitik
dari Plasmodium falciparum yang dihasilkan pada tahap seksual dan
aseksual parasit (Markler et al., 1998; Arum et al., 2006; Widjayanti dan
Harjanto, 2009). P. falciparum merupakan spesies parasit bersel tunggal
penyebab penyakit Malaria dengan agen utamanya nyamuk Anopheles betina
(Nugroho dan Wagey, 2000).
Pada penelitian ini enzim pfLDH digunakan sebagai model dalam proses
pemurnian yang menggunakan peralatan komersil (His-bind Resin) maupun
dengan teknik manual yang lebih murah menggunakan kupri sulfat.
1.2.

Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang penelitian, rumusan masalah yang perlu

dikembangkan yaitu tentang bagaimana profil enzim rekombinan pfLDH yang
dimurnikan menggunakan kupri sulfat dan His-bind Resin.
1.3.
Tujuan dan Kegunaan Penelitian
1.3.1. Tujuan Penelitian
Peneitian ini bertujuan untuk mengetahui cara isolasi enzim rekombinan
pfLDH menggunakan Kupri Sulfat dan Hisbind-Resin.

1.3.2. Kegunaan Penelitian

Adapun kegunaan dari penelitian ini antara lain :
a. Untuk mempelajari teknik pemurnian enzim yang menggunakan kupri
sulfat dan His-bind Resin.
b. Sebagai

pembanding

bagi

mahasiswa

yang

akan

melakukan

penelitian berikutnya.
c. Memenuhi

sebagian

syarat

menjadi

sarjana

Peternakan

di

Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Enzim
Enzim merupakan senyawa organik yang berperan sebagai biokatalisator,
yang artinya dapat mempercepat reaksi-reaksi didalam tubuh tanpa enzim itu
sendiri ikut bereaksi (Dwisang, 2012). Enzim memiliki keunggulan sifat, antara
lain mempunyai aktivitas yang tinggi, efektif, spesifik dan ramah lingkungan
(Lidya dan Djenar, 2000). Saktiwansyah (2001) menambahkan bahwa enzim
memiliki sifat yang khas, yaitu sangat aktif walaupun konsentrasinya amat
rendah, sangat selektif dan bekerja pada kondisi yang ramah, yaitu tanpa
temperatur atau tekanan tinggi dan tanpa logam yang umumnya beracun. Hal ini
yang menyebabkan reaksi yang dikatalisis secara enzimatik menjadi lebih efisien
dibandingkan dengan reaksi yang dikatalisis oleh katalis kimia (August, 2000).
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif
dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam
sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim induktif adalah
enzim yang ada dalam jumlah tidak tetap, tergantung pada adanya induser. Enzim
induktif ini jumlahnya akan bertambah sampai beberapa ribu kali bahka lebih
apabila dalam medium mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila
substrat penginduksi merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar,
2000).

2.2. Protein Rekombinan

Protein rekombinan merupakan protein yang dihasilkan dari ekspresi DNA
atau gen rekombinan menggunakan sel inang tertentu dalam jumlah yang cukup
besar sesuai dengan kebutuhan. Namun, protein rekombinan tidak hanya

dihasilkan oleh sel tertentu namun juga memerlukan materi genetik tambahan
seperti penyisipan gen penyandi protein ke dalam vektor ekspresi. Vektor
ekspresi digunakan untuk mengekspresikan gen asing sehingga dapat dikenali
oleh sel inang. Selain itu produksi protein rekombinan biasanya diinduksi dengan
menggunakan suatu inducer tertentu (Yuwono, 2005).
Sudjadi (2008) menyatakan bahwa tahapan dalam menghasilkan protein
rekombinan dengan teknik rekayasa genetic telah popular di kalangan peneliti
bioteknologi. Proses pembuatan protein rekombinan dapat dilihat pada gambar
dibawah ini.

Gambar 1. Proses Pembuatan Protein Rekombinan

(Sumber : Brown T.A., 2006)
Kurnia (2011) menjelaskan bahwa enzim restriksi EcoRI, memotong
molekul DNA plasmid pada urutan heksa-nukleotida 5GAATTC3 pada
posisi antara basa G dan A. demikian pula pada urutan polindromiknya 3
CTTAAG5 enzim EcoRI, juga memotong pada posisi antara basa A dan G.

dengan demikian molekul DNA heliks ganda yang terpotong oleh enzim EcoRI,
menghasilkan fragmen restriksi dengan kedua ujung yang lengket. Proses
transformasi plasmid dari bagian luar ke dalam sel diinduksi oleh kejutan panas
dari suhu 0 C ke suhu 42C. Kejutan panas merupakan tahap krusial dalam
transformasi.
Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung atau menyisipkan DNA
pada vektor. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg
berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka menggabungkan fragmenfragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu
fragmen

dengan

ujung

sticky

ends

fragmen

lainnya,

kemudian

menyambungkan kedua ujung fragmen tersebut secara kovalen dengan

menggunakan enzim DNA ligase (Tjahjoleksono, 2010). Kurnia (2011)
menambahkan bahwa vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai
wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke
dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi DNA asing
tersebut. Vektor ekspresi pada pembuatan protein rekombinan didasarkan pada
fungsi- fungsi tertentu; 1) sebagai pembawa gen pengkode protein yang
diinginkan dan bertanggung jawab untuk replikasi, transkripsi dan translasi; 2)
sebagai instruksi yang disediakan oleh gen tersebt untuk mensintesis gen yang
diinginkan; 3) sebagai penginduksi protein tersebut; 4) sebagai alat pemisah dan
ekstraksi protein dari kulturnya (Sudjadi, 2008).
Memasukan vektor ke dalam bakteri Escherichia coli yang merupakan
mikroorganisme pertama yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan dan
terus menjadi inang pilihan oleh para ilmuwan. Bakteri ini telah digunakan

sebagai sel inang dalam bidang industri untuk memproduksi enzim, antibiotik,
insektisida dan lain-lain (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).

2.3. Plasmodium falsiparum Laktat Dehidrogenase (pfLDH)

pfLDH dihasilkan pada stadium aseksual dan seksual (gametosit) oleh
parasite malaria (Pediatri, 2002). Enzi mini sering juga disebut

Parasite

Laktat Dehidrogenase yang disingkat pLDH merupakan enzim penting yang

digunakan untuk kelangsungan hidup plasmodium sejak parasite tidak memiliki
siklus asam fungsional menggunakan trikarboksilat (siklus krebs) selama
aseksual mereka (Ali, et al, 2013).
Alfiah et al., (2009) dan Nwazue (2014) menyatakan bahwa pLDH
dapat digunakan untuk mendiagnsa penyakit malaria, mengefaluasi hasil
pengobatan, serta untuk skuening obat anti malaria. WHO (2013) menyatakan
bahwa RDT (Rapid Diagnosis Test) yang digunakan untuk mendeteksi
Plasmodium-spesifik antigen (protein) dalam darah utuh dari orang yang
terinfeksi dimana RDT mengandung antibody terikat antigen spesifik seperti
HRP2 khusus untuk P. falciparum, P. vivax, P. Malariae, P. ovale.
Mengetahui pengaruh obat terhadap P. falciparum secara in vitro yang
dijelaskan Syamsudin (2008) bahwa dengan mengambil sampel darah dari
penderita ditambahkan ke dalam microplate yang mengadung obat dengan
beberapa dosis dimana teknik ini mengukur hambatan maturasi pada stadium
schizon. Manfaat lain pLDH adalah sebagai target senyawa-senyawa
antimalarial, sehingga dapat dipergunakan untuk mencari obat-obat baru untuk
penyakit malaria (Berwel et al., 2008).

2.4. Purifikasi Protein Rekombinan

Pemurnian berarti membebaskan suatu protein dari bahan-bahan atau
protein lain yang tidak diinginkan atau sering disebut pengotor. Dijelaskan
bahwa tingkat kemurnian suatu produk enzim berbeda-beda tergantung pada
metode yang digunakan. Dengan mengetahui enzim yang didapatkan adalah
enzim murni, maka diharapkan dapat diperoleh data yang valid dalam
penggunaannya (Channel, 1998).
a. Cuprum Sulfat atau Kupri Sulfat
Curpri sulfat atau tembaga(II) sulfat, juga dikenal dengan cupri sulfat,
adalah sebuah senyawa kimia dengan rumus molekul CuSO4. Senyawa garam
ini eksis

di

bumi

dengan

kederajatan

hidrasi

yang

berbeda-

beda. Bentuk anhidratnya berbentuk bubuk hijau pucat atau abu-abu putih,
sedangkan bentuk pentahidratnya (CuSO45H2O), berwarna biru terang.
(Anonim, 2012).
Beberapa tes kimia menggunakan tembaga sulfat. Tembaga sulfat
digunakan

dalam larutan

fehling dan larutan

benedict untuk

mengetes

gula pereduksi, yang nantinya akan mereduksi tembaga(II) sulfat yang berwarna
biru menjadi tembaga(I) oksida yang berwarna merah (Anonim, 2012).
Tembaga sulfat juga digunaka pada reagen biuret untuk mengetes protein.
Tembaga sulfat juga digunakan dalam uji darah seseorang penderita dengan efek
gravitasi, darah yang banyak mengandung hemoglobin akan

dengan

cepat

tenggelam karena massa jenisnya besar, sedangkan darah yang hemoglobinnya

sedikit akan lebih lama tenggelam (Anonim, 2012).

Routh (1996) menyatakan bahwa, jika CuSO4 ditambahan dalam suatu

bahan yang mengandung protein akan berubah warnanya menjadi warna unggu
dan terjadi pengendapan. Cu2+ merupakan ion positif sehingga jika digabungkan
dengan protein dengan muatan negativ akan menyebabkan larutan menjadi netral
yang menyebabkan terjadinya pengendapan dan perubahan warna. Protein
negatif berada pada pH diatas titik isoelektrik sedangkan dibawah titik
isoelektrik protein bermuatan posotif dan mampu berikatan dengan ion-ion
negatif. Diungkapkan pula bahwa pengendapan pada uji protein menggunakan
logam akibat netralisasi menghasilan endapan garam protein yang bersifat
reversible (Anonim, 2011).

c.

IMAC ( Immobilized Metal Affinity Chromatography)

Gebere dan Menart (2001) menyatakan bahwa Immobilized Metal

Affinity

Chromatography

merupakan

suatu

teknik pemisahan

protein

menggunakan senyawa pengkelat yang terikat secara kovalen pada zat padat
pendukung kromotografi dan zat padat ini data mengikat ion logam. Prinsip
dari IMAC ini yaitu interaksi reversible antara beberapa rantai samping asam
amino dan immobilized ion metal.
Sucipto (2008) menyatakan bahwa banyak protein rekombinan yang
direkayasa agar mengandung paling sedikit 6 residu hsitidin pada N atau C
terminalnya dan protein ini sering disebut sebagai His-Tag. Kehadiran His-Tag
ini memfasilitasi proses pemurnian protein berdasarkan afinitas protein dengan
polihistin tersebut terhadap abdsorbsi yang dilengkapi pengkelat metal seperti
Ni+2 atau Co+2. Interaksi antara residu histidine dengan ion loga ini bersifat

reversible dan protein yang terikat dapat dielusi dengan imidazole atau dengan
merendahkan nilai pH. Karena imidazole identik dengan rantai samping
histidine, maka pada saat posisi pilihistidine pada resin dan polihistidin akan
terelusi keluar. Berbagai jenis IMAC antara lain Nickel His-bind Resin dan NiNTA (nitriloacetic acid) His-bind Resin yang memiliki pengkelat metai NI2+.
Dan TALON dengna pengkelat berupa Co2+ - carboxymethylaspartate (Sucipto,
2008).

d. SDS-PAGE
SDS-PAGE

(Sodium

Dodecyl

Sulfate

Polyacrylamide

Gel

Electrophoresis) merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein

berdasarkan ukuran berat molekulnya (Davidson et al., 2003).
Menurut Yepyhardi (2009) bahwa penggunaan polikrilamid mempunyai
keunggulan dibandingkan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan
sampel dan tidak membentuk matrik denga sampel, sehingga tidak menghambat
pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna.
Selain itu, gel polikrilamidini mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi.
Penggunaan SDS berfungsi untuk medenaturasi protein terputus membentuk
protein yang dapat terelusi dalam gel tersebut. Denaturasi protein dilakukan
dengan merebus sampel dalam bufer yang mengandung -merkaptoetanol
(berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfida), gliserol dan SDS (Wilson dan
Walker, 2000). Mautan asli protein akan digantikan oleh muatan negative dari
anion yang terikat sehingga kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per
berat molekul yang konstan (Hames dan Hooper, 2000).

10

Wilson dan Walker (2000) menyatakan bahwa sampel-sampel enzim yang

diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat
terionisasi. Fungsi pewarna dalah untuk membantu memonitor jalannya
eketroforesis. Berat moekul protein dapat diketahui dengna membandingkan Rf
Protein dan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui.
2.5. Hipotesis
Pemurnian pfLDH merupakan satu-satunya jalan yang haris ditempuh
untuk mendapatlan enzim tersebut yang dapat digunakan dalam beberapa
keperluan. Diantaranya, pembuatan antibody monoklonal, pencarian obat
alternative malaria dan keperluan lainnya. Untuk itu diperlukan metode yang
murah guna memurnikan enzim tersebut. Berdasarkan hal itu, maka
bagaimanakah profil enzim tersebut jika dimurnikan dengan kupri sulfat dan Hisbind Resin.

11

BAB III
MATERI DAN METODE PENELITIAN
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboraturium Mikrobiologi dan
Biteknologi, Fakultas Peternakan, Universitas Mataram pada bulan Oktober 2016
sampa bulan November 2016.

3.2. Materi Penelitian

Penelitian ini menggunakan enzim rekombinan plasmodium falciparum
laktat dehydrogenase (pfLDH) yang diekspresikan dalam biakan E. coli BL21
Codon plus pCOLD pLDH.

3.3. Bahan dan Alat Penelitian

3.3.1 Bahan penelitian
Glyserol stock bakteri E. coli BL21 pembawa plasmid pCOLD
pLDH, Media Luria Bertani (LB) cair, Media Luria Bertani (LB) padat,
Ampicilin dengan konsentrasi 50 mg/ml, IPTG (isopropyl thio Dgalactoside) dengan konsentrasi 1 mM, lysis Buffer, Elution Buffer, Washing
Buffer, PBS (Phospat Buffer Saline), Aquades, TEMED, APS (Ammonium
persulfate), Cuprum Sulfat, 30% acrylamide solustion, 4x separation buffer,
4x stacking gel buffer, 2x Sampel Bufer, Elektroforesis Bufer, CBB
(Commassie Brilliant Blue), TCA (Trichloro Acetic Acid), Aseton, Marker,
Kapas, Kain Kasa, Aluminium foil, Tisu, Kertas Label, HCl, NaOH, Proteo
Block, Alkohol 70%, dan 50% Gliserol.

12

3.3.1 Alat-alat Penelitian

Kolom purifikasi Ni-NTA, Satu set alat SDS-PAGE, Tabung Reaksi,
Laminar air flow, Autoclave, Mesin Shaker (Waterbath shaker dan Shaker
37 C). Mikropipet, Alat Sentrifugasi, Tip Mikropipet (Blue, Yellow,
White), Falcon (15 dan 50 ml), Timbangan Analitik, Gloves, Tabung
Effendorf, Incubator, Cawan Petri, Jarum Ose, Lampu Bunsen, Gelas Ukur,
Erlenmeyer, Host Plate Stirer, Spinner, Beaker Glass, Vortex, Ice Box,
Refrigator (4 C, -20 dan -80 C), pH Meter, Sonikator.

3.4. Variabel yang Diamati

Adapaun variabel yang diamati pada penelitian in adalah tingkat
purifikasi

dari

enzim

rekombinan

Plasmodium

falciparum

Laktat

Dehidrogenase (pfLDH) yang menggunakan ammonium sulfat, kupri sulfat dan

His-bind Resin.

3.5. Metode Penelitian

3.5.1. Pembuatan Media LB
Dalam pembuatan media LB cair dibutuhkan tryotone powder
sebanyak 1% (0,5 g), NaCl 1% (0,5 g), dan yeast extract 0,5% (0,25 g).
untuk pembuatan media LB padat sebanyak 1 liter, dibutuhkan
menambahkan tryotone powder 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g, agar
15 g, dan antibiotic ampicillin sebanyak 1ml. kemudian tingkat pH
diatur dengan menambahkan NaOH apabila asam, dan penambahan HCl
apabila basa dan diukur dengan menggunakan pH meter sampai

13

menunjukan angka 7 atau dalam keadaan netral. Semua bahan tersebut

kemudian dicampur dengan aquades kemudian dilarutkan menggunakan
hot plate stirrer. setelah larutan homogeny dengan warna bening, hot
plate stirrer dimatikan dan magnet stirrer dikeluarkan. Kemudian
dengan menggunakan popet sedot yang dipasang ball pipet, larutan
dipindahkan kedalam tabung-tabung rekasi yang telah disediakan.
Tabung-tabung kemudian ditutup dengan menggunakan kain kasa dan
kapas. Selanjutnya, semua tabung rekasi dimasukkan kedalam baker
gelas lalu ditutup dengan aluminium foil. Dan dimasukkan ke dalam
autoclave.

3.5.2. Peremajaan

Bakteri

E-Coli

BL21

Pembawa

Plasmid

pCOLD.pLDH
Produksi

enzim

rekombinan

pfLDH

dimulai

dari

tahapan

menumbuhkan bakteri E-Coli BL21 pembawa plasmid pCOLD.pLDH

yang disimpan dalam bentuk glycerol stock pada suhu -20 C pada
media LB padat yang mengandung 50 l/ml ampisilin (kosentrasi
working solution). Setelah itu, dilakukan streak (penggoresan) pada
media LB padat yang mengandung ampisilin. Hasil goresan yang
tumbuh kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam sampai
tumbuhnya koloni tunggal bakteri

E-Coli BL21 pembawa plasmid

pCOLD.pLDH. Selanjutnya koloni tunggal diinokulasikan untuk

pembuatan starter dengan menggunakan media LB cair.

14

3.5.3. Pembuatan Starter

Koloni tunggal yang tumbuh ada media LB padat diinokulasi
kembali pada media LB cair yang mengandung ampisilin 50 mg/ml
untuk menghasilkan starter. Kemudian kultur di shaker pada suhu 37C
dengan kecepatan 120 rmp selama 24 jam. Dan siap digunakan sebagai
starter untuk menghasilkan enzim pLDH.

3.5.4. Kultur pada Media LB Cair 100 ml

Mengambil sebanyak 1 ml kultur bakteri E-Coli BL21 pembawa
plasmid pCOLD.pLDH yang telah jenuh diinokulasi kembali ke dalam
100 ml media LB cair yang mengandung 50 mg/ml ampisilin kemudian
kultur tersebut dishaker pada suhu 37C dengan perputaran 120 rpm
sampai OD600 mencapai 0,3 0,5. Setelah kepadatan bakteri tersebut tercapai
kultur dipindahkan ke waterbath shaker suhu 15C, dan dibiarkan selama 30
menit. Kemudian dilakukan induksi pada hasil kultur

dengan IPTG (Iso

Propyl Thio D-glactoside) konstrasi 1 mM. setelah induksi, kultur diinkubasi

kembali pada waterbath shaker suhu 15C selama 12 jam.

3.5.5.

Panen Pelet Hasil Kultur

Kultur dipindahkan ke tabung falkon untuk kemudian di sentrifugasi

pada kecepatan 6000 rpm Selama 10 menit pada suhu 4C. Kemudian
supernatant hasil sentriguasi dibuang dan pelet disimpan pada suhu -20C.
3.5.6.

Sonikasi Pelet
Pelet bakteri pembawa plasmid pCOLD.pLDH yang disimpan pada

suhu -20 C diencerkan dalam 10 ml buffer lisis dan proteo block 100 l ke
dalam sampel dan divorteks sampai larut. Sampel pelet yang telah larut

15

kemudian disonofikasi mengguanakan sonikator selama 5 menit (durasi

sonikasi 10 kali, satu periode selama 30 detik) yang berguna untuk melisiskan
dinding sel bakteri. Setelah itu disentrifugasi semalam 10 menit dengan
kecepata 8.500 rpm. Supernatant hasil sentrifugasi kemudian disimpan pada
suhu 4 C.
3.5.7. Pembuatan Bufer
Stok CuSO4
Stok CuSO4 yang digunakan adalah 20 mM karena berat molekul kupri
sulfat adalah 249,68 gram/mol. Maka membuat stok CuSO 4 dengan
konsentrasi 20 mM, dibutuhkan sebanyak 24,97 mg CuSO 4 dilarutkan
dalam 5 ml air melalui vorteks. Setelah itu siap digunakan.
3.5.8. Pemurnian
Adapun beberapa teknik purifikasi yang dilakukan yaitu antara lain :
1) Cuprum Sulfat (CuSO4)
Bahan yang digunakan untuk isolasi adalah saline, stok CuSO 4 20
mM dan superntatan hasil sonifikasi. Sedangkan alat-alat yang digunakan
adalah vortek, sentrifius dan mikro tube.
Menggunakan konssentrasi 10 mM CuSO4 yang akan dicampurkan
dengan sampel dan megnaati perubahan yang terjadi. Setelah itu, sampel
tersebut disentrifugasiselama 10 menit denga kecepatan 10.000 rpm pada

suhu 4 C, selanjutnya disentrifugasi agar endapan dan supernatant terpisah.

Dialisis
Endapan yang diperoleh dari proses islasi ditambahkan 250 l
PBS pada sampel. Sampel pfLDH dimasukkan ke dalam membran tubing
selulosa dan ujung membrane dijepit agar sample tidak keluar dari dalam
tubing. Tubing yang telah berisi sample dimasukkan ke dalam beaker
glass yang berisi 800 ml garam fisiologis. Proses dialisis dibiarkan selama
24-48 jam pada suhu 4C dengan 3 kali pergantian lautan garam fisiologis.
2) Kolom His-bind Resin
Kolom Ni-NTA dibilas dengan buffer lisis dibiarkan menetes dan
dibuang selanjutnya supernatan hasil sonifikasi dimasukkan ke dalam
kolom dan ditampung menggunakan tabung falkon, washing buffer

16

dimasukkan sebanyak 4 ml yang berfungsi untuk membersihkan

kontaminan lain yang terikat dalam kolom, diulang sebanyak 3 kali dan
tetesannya ditampung. Kemudian dimasukkan elution buffer sebanyak 2 ml
yang berguna untuk melepaskan protein target yaitu rekombinan pfLDH
dari kolom, diulangi sebanyak 3 kali dan tetesannya ditampung. Bufer lisis
kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sebanyak 2 ml dan kolom
ditutup agar tidak menetes, simpan pada suhu 4 C. Sampel yang diisolasi
atau dimurnikan tersebut siap dianalisis dengan SDS-PAGE.
3.5.9. Pengujian hasil purifikasi melalui SDS-PAGE
a. Preparasi Gel
Menyiapkan 2 lempeng kaca sebagai alat pencetak gel. Lempeng kaca
tersebut kemudian dirapatkan dan dijepit menggunakan alat penjepit. Untuk
pembuatan ge dengan konsentrasi 12,5%, gel yang pertama kali dibuat adalah
separation gel sebagai gel bawah yang terdiri dari 30 % akrilamide solution 2,5
ml, 4x separation buffer 1,5 ml, 50% gliserol 1,2 ml, aquades 1,14 ml, 10 % APS
60 l dan TEMED 6 l. Setelah semua bahan dicampur dan dihomogenkan,
kemudian dimasukkan ke dalam cetakan kaca yang telah disiapkan menggunakan
mikropipet. Tunggu sampai membeku. Setelah itu, cetakan sumuran berupa
sisiran dimasukkan ke dalam cetakan gel. Kemudian disiapkan untuk gel atas
yaitu stacking gel yang terdiri dari 30 % akrilamid solution 188 l, 4x stacking
gel buffer 313 l, aquades 500 l, 10 % APS 10 l, dan TEMED 2 l. Seluruh
larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung kemudian dihomogenkan dengan
cara dibolak balik. Larutan stacking gel kemudian dimasukkan ke dalam cetakan
gel yang sudah terdapat cetakan untuk sumuran dan tunggu hingga membeku.
Setelah membeku, sisiran dilepas dan lempengan kaca yang berisi gel
dipindahkan ke dalam alat elektroforesis.
b. Preparasi Sampel

17

Sampel yang telah melalui tahap purifikasi menggunakan kolom Ni-NTA

dan Cuprum Sulfat kemudian dikonsentrasikan menggunakan larutan TCA
100%. Sampel diambil sebanyak 400 l kemudian direkasikan denga 100 l
larutan TCA 100%. Sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu 4C
kemudian disentrifugasi selama 5 menit, dengan kecepatan 12.000 rpm pada
suhu 4C. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, kemudian pelet dicuci
menggunakan aceton absolut dingin sebanyak 200 l. Sampel disentrifugasi dan
dicuci kembali dengan metode yang sama. Pelet sampel kemudian dipanaskan
sampai kandungan aceton menguap. Pelet kemudian diresuspensi dengan dH 2O
dan 2x buffer sampel. Penambahan dH 2O dan 2x bufer sampel tergantung dari
pelet yang diperoleh. Kemudian sampel didenaturasi selama 5 menit dalam air
mendidih pada suhu 100 C.
c. Elektroforesis Gel
Mengisi dam mesin running dengan elektroforesis buffer. Sampel yang
telah didenaturasi kemudian dimasukkan ke dalam sumran gel sebanyak 20 l.
setelah semua sampel dimasukkan, tutup mesin running dan menyalakan mesin
dengan voltase 100 volt selama 3 jam. Gel selanjutnya diwarnai menggunakan
CBB (commassie Brilliant Blue) sambal digoyangkan menggunakan mesin
shaker selama 30 menit. Kemudian gel dibilas (destaining) menggunakan
campuran larutan aquades, methanol, dan asam asetat dengan perbandingan 6 : 3
: 1. Kerta tisu ditambahkan pada gel yang dibilas yang berfungsi sebagai
penyerap warna pada saat pembilasan. Pembilasan dilakukan sampai gel bersih
dari sisa pewarna CBB.
3.6. Analisis Data
Data diolah dan dianalisis menggunakan analisis deskriptif terhadap ada
atau tidak pita protein dari kedua pemurnian menggunakan kupri sulfat dan Hisbind Resin saat diuji dengan SDS-PAGE.
3.7. Jadwa Penelitian

18

Penelitian ini direncanakan mulai pada bulan Oktober hingga pada bulan
November 2016. Pelaksanaan penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yang
dijabarkan dalam tabel berikut :
Tabel 1. Jadwal Penelitian
Bulan

No
Kegiatan
.
1

Septembe
Oktober

November

Desember

r
Persiapan Proposal
Persiapan alat dan

2
bahan
3

Peneltian

Analisis data

19

DAFTAR PUSTAKA

Alfiah, N., Hardjoeno, dan Windarwati. 2009. Perbandingan Laktat

Dehydrogenase (pLDH) Plasmodium falciparum Strain Lokal. Program
Pascasarjana Universitas Mataram; Mataram
Ali, M., Sulaiman, ND., Yunita, S. 2013. Production of anti-pLDH and antiHRP2 for Rapid Diagnostic Kit Material of Malaria. Research Report :
Mataram University and Toyama University.
Anonim. 2011. Mekanisme Pmebentukan Gel.
http://carikartika.blogspot.com/2011/03/mekanisme-pembentukan -gl.html.
Dikutip 31/08/2016
Anonim. 2012.
https://id.wikipedia.org/wiki/Tembaga(II)_sulfat. Dikutip
31/08/2016
. https://id.wikipedia.org/wiki/Tembaga(II)_sulfat. Dikutip 31/08/2016
. https://id.wikipedia.org/wiki/Enzim. Dikutip 31/08/2016
Arum, Ima., Purwanto AP., Arfi, S., Tetrawindu, H., M. Octora, M., Surayah, K.,
dan Amanukarti. 2006. Uji Diagnostik Plasmodium Malaria Menggunakan
Metode Imunokromatografi diperbandingkan dengan Pemeriksaan
Mikroskopis Indonesia Journal of Clinical Pathology and Medical
Laboratory, Vol. 12, No. 3, 118-122.
August, E. 2000. Kajian Penggunaan Lipase Amobil dari Aspergillus Niger pada
Pembuatan Monoasilgliserol yang Bersifat Antibakteri dari Minyak Kelapa
(Skripsi). Bogor: Institute Pertanian Bogor.
Berwel, R., Gopalan, N., Chandel, K., Prasad, GBKS., Prakash, S., 2008.
Plasmodium falciparum: enhanced soluble expression, purification, and
biochemical characterization of lactat dehydrogenase. Experimental
Parasitologi, pp 135-141.
Brown, T.A. 2006. Gene Cloning & DNA Analysis An Introduction 6th Edition.
Wiley-Blackwel :Manchester.
Carlton, A. and M. Zachariou. 2008. Immobilized Metal Ion Affinity
Chromatography Of Native Protein And Histidine Tagged Fusion Proteins.
Dalam: Zachariou, M. 2008. Affinity chromatography methods and
protocols, 9th Edition. Humana Press. Totawa: 25-34 & 137-148.
Cartono.2004. Biologi Umum. Bandung: Prisma Press
Chakrapani, U., dan U. Satyanarayana. 2007. Biochemstry. Kalkuta :Books and
Allied (P) Ltd.
Channel, Richard. JP. 1998. Natural Product Isolation. Humana press, New
Jersey.

20

Chiang, C.C., B.Yu. and P.W.S. Chiou. 2005. Effect of Xylanase Supplementation
to Wheat-Based Diet on The Performans and Nutrient Availability of Broiler
Chickens. Asian-Aust.J.Anim.Sci. 18:1141-1146.
Davidson, org. 2003. SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis).
http://www.davidson/edu/academic/biology/SDSPAGE.html. Diakses :
31/08/2016
Dwisang, Evi Luvina. 2012. Buku Saku Biologi SMA, Kelas 1,2, dan 3.
Tanggerang: Karisma
Fredrich, I.A., and Fuller, S.C. 1998. Comparison of Calf Rennet and Modfied
Mucor miechei Cogulant in Cheddar Cheese. J. Dairy Technology. 41
(1):12-15.
Gebere-Porekar, V. and Menart, V. 2001. Perspective if immobilizedmetal affinity chromatography. J. Biochem. Biophy. Methods.. 49 : 335360
Hames, BD and Hooper NM. 2000. Biochemistry: the instant notes. 2nd edition.
Hongkong:Springger-Verag.
Kurnia, Ashfar. 2011. Dasar Tekonologi DNA Rekombinan. Depok: UI Press.
Lidya, B., dan Djenar NS. 2000. Dasar Bioproses. Bandung: Jurusan Teknik
Kimia Politeknik Negeri Bandung.
Markler, MT., Piper RC., and Milhous W. 1998. Lactat Dehydrogenase and
Diagnosis of Malaria. Parasitol. 14:376-7
Muhaimin, Oei Ban Liang. E. Ratna Ningsih, E. Purwantini, dan D.S. Retno
Ningrum. 2005. Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga. Streptococcus Pyogenes
Hasil Ekspresi Heterolog di Escherchia Coli. Jurnal Matematika dan Sains
10 (1): 31-36
Nugroho, A., dan Wagey, MT. 2000. Siklus Hidup Plasmodium Malaria. Dalam:
Harijanto PN (editor) Malaria, Epdidemilogi,Patogenesis, Manifestasi
Klinis,dan Penanganan. EGC. Jakarta., hal: 38-53
Routh, J.I., 1969. Essential of General Organic and Biochemestry, W.B. Sounders
Company, Philadelphia.
Saktiwansyah, E. 2001. Karakteristik Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas
Esterifikasi dari Kapang Rhizopus Oryzae TR 32, Tesis, Program
Pascasarjana, IPB, Bogor.
Smith, A.L., 1997. Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology.
Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 0-19-954768-4
Syamsudin. 2008. Penapisan Senyawa Antimalaria yang Berasal dari
Tumbuhan. Jakarta. Jurnal Ilmu Kefarmasan Indonesia. Pp 95-99.
Sucipto, Hilda. 2008. Analisis Fungsional Dua Glikosil Tranferase dalam
Biosintesis Kanamysin. Depok. UI Press.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta.

21

Tjahjoleksono, Aris., 2010. DNA Rekombinan. (Online) Tersedia

http://web.ipb.ac.id/-tpb/files/materi/genetika/dna/rekombinan.htm. Dikutip
31/08/2016
WHO. 2013. Malria Rapid Diagnostic Test Performance: results fo WHO product
testing of malaria RDTs: Round 5. WHO Library Cataloguing.
Widjayanti, A., Harjanto, T. 2009. Nilai Diagnostik Malaria dengan Antigen
HRP-2 dan Pan Spesifik pLDH. Jurnal Vol. 22, No. 3.
Wilson, K. 2000. Protein and Enzyme Technique in Practical Biochemistry, (ed.
Wilson K and Walker JM), Cambridge University Press. P.161-226
Yephardi. 2009. Elektroforesis; Putu Gerbang Penelitian Biologi Molekular.
Jakarta:UI-Press.
Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

22