Anda di halaman 1dari 31

Versi terjemahan dari I.

pdf
Page 1

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.
sifat struktural & biologi molekuler memajukanpublikasionline
artikel
Mikrotubulus berbasis dynein bermotor sitoplasma (disebut di sini
sebagai dynein) kekuatan pengangkutan beragam cargos, memungkinkan
sel untuk mengatur isinya, bergerak, membagi dan merespon rangsangan.
Neuron dan sel-sel panjang lainnya sangat sensitif terhadap cacat dalam
transportasi, mutasi di dynein motor terkait subunit menyebabkan
perkembangan saraf dan neurodegenerative penyakit
1, 2
. Seperti lainnya
motor yang bergerak kargo jarak jauh, molekul tunggal dynein
processively bergerak di sepanjang jalur mikrotubulus mereka
3-8
. Dynein adalah yang terakhir
kelas motor cytoskeletal yang mekanisme processive
motilitas masih belum diketahui.
Mekanisme dynein ini terus menjadi misterius karena sifatnya enorMoU ukuran dan kompleksitas
9
. The holoenzyme dynein terdiri dari
two500 kDa motor (atau 'kepala') subunit rantai berat dan setidaknya
enam lainnya polipeptida. Struktur domain dari berat dynein
rantai ditunjukkan pada Gambar 1a . 'Ekor' The N-terminal domain perwakilansents30% dari massa seluruh rantai berat dan diperlukan untuk
dimerisasi dan interaksi subunit dynein paling dan asosiasidiasosiasikan protein. Terhubung ke ekor adalah 'linker' domain, yang
diperkirakan untuk memperkuat perubahan struktural selama dynein ini ATPase
siklus dan diperlukan untuk motilitas
5, 10-12
. Setelah domain linker
enam + AAA bersambung (ATPase terkait dengan beragam cellular kegiatan) domain, yang melipat ke dalam cincin. Sebagai anggota dari
Superfamili + AAA, dynein adalah evolusi berbeda dari kinesin dan
myosin, yang jauh terkait dengan G-protein
13

. Dynein pertama
AAA + domain adalah situs utama dari hidrolisis ATP
14
, Namun AAA +
domain 2-4 juga diharapkan untuk mengikat ATP atau ADP, berdasarkan mutan
fenotipe
15 - 17
. Memproyeksikan dari domain + keempat AAA adalah
15nm, antiparalel, digulung-coil'stalk ', cappedbyaglobularmicrotubulemengikat domain
18 - 20
.
Meskipun kompleksitas motor dynein, dimer dari dua trunkombatan S. rantai dynein cerevisiae berat cukup untuk processive
motilitas
5, 21
. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa monomer dynein kekuranganing sebagian besar domain ekor tidak processive sendiri tetapi
pindah processively ketika mereka dihubungkan bersama-sama dengan glutathione S-transferase (GST, sebuah homodimer stabil)
5
( Gambar. 1b ). GST-dynein
homodimers berperilaku mirip dengan dynein ragi asli dengan hormat
dengan kecepatan, perilaku processivity, melangkah dan produksi tenaga
in vitro
5, 22
, Menunjukkan bahwa antarmuka dimerisasi asli tidak
diperlukan untuk motilitas dan menyarankan bahwa mekanisme dasar motil
tidak sensitif terhadap metode dimerisasi.
Namun, bagaimana dynein mencapai motilitas processive tetap
diketahui. Untuk dipelajari dengan baik kinesin-1 dan myosin-V motor,
nukleotida-driven konformasi perubahan mekanis elemenments daya sekuensial tangan-over-tangan loncatan dua mereka
identik bermotor domain
23 - 27
. Sebelumnya, untuk menyelidiki dynein yang
Mekanisme melangkah, kita berlabel GST-dynein homodimers dengan
kuantum tunggal dot (Qdot) pada domain motor tunggal atau di
ekor domain (perkiraan pusat massa). Presisi tinggi satuanalisis melangkah dimensi mengungkapkan bahwa langkah domain bermotor
ukuran hampir dua kali ukuran dari ukuran langkah ekor, konsisten dengan
model di mana dua dynein ini domain motorik mereka bergantian posisition dalam waktu dan melewati satu sama lain dalam ruang
5
. Namun, tidak seperti kinesin,
1

Departemen Biologi Sel, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Amerika Serikat.
2
Dana Farber Cancer Institute, Boston, Massachusetts, Amerika Serikat.
3
Departemen
Biochemistry and Molecular Farmakologi, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts,
Amerika Serikat.
4
Departemen Biologi Molekuler Struktural, Max Planck Institute
Biokimia, Martinsried, Jerman.
5
Fisiologi Kursus, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts, Amerika Serikat.
6
Geffen School of Medicine, Universitas
dari California, Los Angeles, Los Angeles, California, Amerika Serikat.
7
Wyss Institute, Harvard University, Boston, Massachusetts, Amerika Serikat.
8
Para penulis berkontribusi sama untuk ini
bekerja. Korespondensi harus ditujukan kepada SLR-P. (Reck-peterson@hms.harvard.edu).
Diterima 29 Juli 2011, diterima 18 November 2011, dipublikasikan secara online 8 Januari 2012 ,
doi: 10.1038/nsmb.2205
Dynein mencapai gerak processive menggunakan kedua stokastik
dan dikoordinasikan loncatan
Weihong Qiu
1,8
, Nathan D Derr
1-3,8
, Brian S Goodman
1
, Elizabeth Villa
4,5
, David Wu
5,6
, William Shih
2,3,7
&
Samara L Reck-Peterson
1
Processivity, kemampuan molekul tunggal untuk bergerak terus menerus di sepanjang
trek, merupakan persyaratan mendasar dari kargomengangkut motor molekul. Di sini, kita menyelidiki bagaimana dynein sitoplasmik, suatu
homodimeric, mikrotubula berbasis motor, mencapai
processive gerak. Untuk melakukan hal ini, kami mengembangkan metode serbaguna
untuk perakitan Saccharomyces cerevisiae heterodimer dynein,

menggunakan oligonukleotida DNA komplementer kovalen terkait dengan monomer


dynein diberi label dengan fluorophores organik yang berbeda.
Menggunakan dua warna, satu-molekul mikroskop dan presisi tinggi, dua-dimensi
pelacakan, kita menemukan bahwa dynein memiliki sangat
loncatan pola variabel yang berbeda dari semua motor lainnya cytoskeletal processive,
yang menggunakan mekanisme 'tangan-over-tangan'.
Uniknya, dynein loncatan adalah stokastik ketika dua bermotor domain yang berdekatan.
Namun, koordinasi muncul sebagai
jarak antara peningkatan bermotor domain, menyiratkan bahwa mekanisme ketegangan
berbasis mengatur langkah-langkah. Plastisitas ini mungkin
memungkinkan tuning dynein untuk fungsi-fungsi yang beragam selular.
Halaman 2

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.

memajukan publikasi alam secara online strukturmolekulbiologi&


artikel
dynein mengambil langkah ukuran variabel dan arah
4, 5,8
, Membuat lainnya
teoritis mungkin melangkah pola
5
. Dynein yang variabel melangkah
Perilaku ini mungkin karena ukurannya yang besar
10, 12,28
, Yang memungkinkan
bermotor cincin untuk memisahkan dan mengakses situs mikrotubulus beberapa mengikat.
Meskipun kemajuan dalam memahami arsitektur dynein
bermotor domain telah datang dari dua dekat-atom-resolusi kristal
struktur
18, 20
( Gambar. 1c ), Bagaimana dua dynein motor yang diatur pada
mikrotubulus ketika bergerak processively juga masih belum diketahui. Di sini,
kami berangkat untuk menentukan bagaimana dynein mencapai motilitas processive.
Sebuah penghalang utama untuk menentukan pola loncatan dynein dan nya
dasar struktural adalah kurangnya sistem yang efisien untuk membuat afinitas tinggi,
heterodimer fungsional, sehingga setiap protomer bisa dideteksi indeindependen. Kami menciptakan S. cerevisiae heterodimer dynein diberi label dengan
dua yang berbeda fluorophores melalui basis-pasangan dari kovalen terpasang,
komplementer DNA oligonukleotida. DNA-terdimerisasi dynein
berperilaku indistinguishably dari dynein asli dan berbasis protein

dynein homodimers
5, 22
. Menggunakan dua warna, satu-molekul mikroskop
ditambah dengan presisi tinggi, dua-dimensi pelacakan partikel, kita
menemukan bahwa dynein memiliki pola loncatan yang sangat tidak biasa dibandingkan
untuk kinesins processive dan myosins. Kami menunjukkan bahwa dynein itu dua motor
domain dapat melangkah secara bergantian dan non-bergantian dalam waktu, dan
mereka bisa lulus atau tidak lulus sama lain di ruang angkasa. Tanpa diduga,
kami menemukan bahwa langkah dynein banyak terkoordinasi tetapi menjadi
dikoordinasikan sebagai jarak antara dua domain meningkat motor.
Hasil ini menunjukkan bahwa dynein dapat beralih di antara stochastic dan
ketegangan berbasis melangkah, sehingga berbeda dari semua lain berkepala dua
motor processive.
HASIL
Dua-dimensi analisis dynein melangkah
Karena langkah dynein yang diketahui memiliki komponen off-axis
5, 8
,
analisis menginjaknya diproyeksikan ke satu dimensi sepanjang mikrotubulus sumbu (seperti standar di lapangan) dapat menghasilkan meremehkan
ukuran langkah yang benar dynein itu. Untuk menentukan ukuran langkah dynein di
dua dimensi, kami menerapkan program langkah-temuan kustom
(Lihat Metode Tambahan). Sebelum menganalisis langkah-dynein ini
ping perilaku dalam dua dimensi, pertama-tama kita menentukan ukuran-the
pemerintah presisi fluoresensi refleksi internal total kami (TIRF)
mikroskop untuk be1.5 nm untuk Qdot 655 and3.5 nm untuk organik
fluorophores Atto647N dan Cy3B (Gambar 1a Tambahan -. c
Tambahan dan Metode). Sebagai kontrol tambahan untuk
presisi dari metode kami, kami melakukan satu dimensi dan duadimensi melangkah eksperimen dengan ragi kinesin-8 (Kip3)
29
.
Kami menemukan bahwa kinesin-8 label pada domain motor tunggal mengambil
16-nm langkah (Gambar Tambahan 2a -. D), mirip dengan kinesin lainnya
anggota keluarga
27
.
Todeterminethetwo-dimensionalstepsizeofdynein, wetrackedthe
melangkah GST-dynein homodimers berlabel dengan Qdot tunggal 655
ditempatkan di kedua domain ekor (melalui HaloTag N-terminal;
Gbr. 1a dan 2a - e ) atau pada domain motor tunggal (melalui C-terminal
HaloTag, lihat Gambar. 1a dan Gambar Tambahan. 2e - j)
5
. Kami baru Metode
analisis mengungkapkan bahwa dua-dimensi ukuran langkah ekor-label
dynein was10 nm ( Gambar 2b. ), lebih besar dari awalnya dilaporkan satu-

dimensi ukuran langkah. Namun, ketika dua-dimensi data yang


diproyeksikan ke arah gerakan sepanjang sumbu mikrotubulus,
kami mengamati An8-nm satu-dimensi ukuran langkah ( Gambar. 2b ), Pada setujupemerintah dengan sebelumnya satu-dimensi pada sumbu ukuran langkah dilaporkan untuk
dynein
5, 7,22
. Pengamatan dari fluorophore di domain motor tunggal
(Kepala-label) menghasilkan ukuran langkah dua dimensi of14-16 nm,
sedangkan satu dimensi pada sumbu ukuran langkah sedikit lebih kecil
(Tambahan Gambar. 2i). Seperti diberitakan sebelumnya, kami menemukan bahwa
Sebagian besar langkah-langkah dynein berada di arah depan ( Gambar 2c. dan
Tambahan Gambar. 2j).
Analisis dua-dimensi data yang memungkinkan kita untuk melangkah
menentukan ukuran langkah dan sudut off-axis dynein ini langkah-langkah untuk
pertama kali. Kami menemukan bahwa 77% dari langkah merupakan langkah maju, dan banyak
langkah yang diambil oleh ekor-berlabel dynein dan motor tunggal domainberlabel dynein mengandung komponen off-axis> 6 nm ( Gambar. 2d dan
Tambahan Gambar. 2g), tidak seperti kebanyakan-kinesin 8 langkah, yang berperilaku
mirip dengan kinesins lain
30, 31
(Tambahan Gambar. 2c). Itu
persentase off-axis langkah diamati di sini lebih tinggi dari previmenerus dilaporkan
5
, Kemungkinan besar karena pembangunan kita dan implementasipemikiran dari algoritma melangkah dua-dimensi, yang
memungkinkan klasifikasi yang lebih akurat dan menyeluruh dari sumbu offkomponen dynein melangkah. Namun, kedua kelengkungan
mikrotubulus dan geometri yang berhubungan dengan jarak
antara fluorophore pada dynein bermotor domain dan ini dynein
mikrotubulus-binding domain bisa memperkenalkan sumber tambahan
kesalahan untuk pengukuran dalam arah off-axis. Dengan demikian, distances diukur dalam arah off-axis mungkin menjadi meremehkan
dan dynein dapat berlangsung lebih sering dan lebih besar off-axis langkah dibandingkan
kita dapat mendeteksi.
sebuah
b
c
CT
NT
NT
NT
Linker pandangan
CT pandangan
Side view
12 nm

12 nm
10 nm
180
90
1
6
5
3
2
4
1
6
5
3
2
4
DIMERIZER
Asli
ekor
GST
DNA
=
DIMERIZER
Linker
C
N
Ekor
1
2
3
4
5
6
Linker
C
N
1
2
3
4
5
6
GST
SNAP-tag
HaloTag
MTBD

Linker
C
N
1
2
3
4
5
6
AAA + cincin
Linker
C
N
1
2
3
4
5
6
GST
H
H
H
1
2
3
4
MTBD
Gambar 1 Struktur dynein dan konstruksi yang digunakan dalam penelitian ini. (A) Linear
diagram struktur domain dynein pribumi (1) dan konstruksi yang digunakan dalam
studi ini: GST-terdimerisasi dynein dengan N-terminal HaloTag (H) untuk
tail-berlabel eksperimen (2), GST-terdimerisasi dynein dengan C-terminal
HaloTag untuk eksperimen bermotor domain-label (3); dynein monomer
dengan tag SNAP-N-terminal untuk dimerisasi DNA dan C-terminal
HaloTag untuk motor domain pelabelan (4). MTBD, mikrotubulus-binding
domain. (B) Dua-dimensi skema dynein dimer. Dimerisasi
(Kotak putih) dapat dicapai dengan menggunakan domain dimerisasi protein asli,
GST atau oligomer DNA komplementer yang melekat melalui tag SNAP-.
(C) tiga-dimensi struktur ragi dynein (PDB 3QMZ)
18
, Disaring
sampai 8- resolusi. Dilihat dari kiri ke kanan: wajah linker, sebaliknya
Wajah dari cincin yang mengandung C-terminal (CT) helix alpha, dan sisi
cincin. Dimerisasi dicapai melalui GST (magenta) di
N terminus (NT).

Page 3

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.
sifat struktural & biologi molekuler memajukanpublikasionline
artikel
Analisis dua dimensi juga memungkinkan kami untuk menyelidiki
apakah dynein memiliki preferensi untuk melangkah ke kiri atau kanan. Kita
menghitung probabilitas bahwa langkah off-axis diikuti oleh yang lain
off-axis langkah dalam arah yang sama dan menemukan bahwa ekor berlabel dynein
sama kemungkinan untuk melangkah ke kiri atau ke kanan ( Gambar. 2e ), Terlepas dari
arah langkah off-axis sebelumnya. Singkatnya, dengan menganalisis dynein
melangkah dalam dua dimensi, kami telah menemukan bahwa dynein yang benar ukuran langkah
lebih besar dari ukuran satu dimensi langkah dilaporkan sebelumnya, bahwa
langkah banyak mengandung komponen off-axis dan bahwa langkah-langkah yang sama
mungkin ke kiri atau ke kanan.
Pengembangan DNA-dynein heterodimer
Untuk menentukan bagaimana dua dynein motorik domain bergerak processively,
kita meneliti perilaku melangkah dari masing-masing dynein motorik
domain independen. Pekerjaan sebelumnya kami menggunakan rapamycin-dimediasi
FKBP-FRB heterodimer
5
, Namun, kompleks ini memiliki afinitas yang lebih rendah
32
daripada yang diinginkan untuk menciptakan heterodimer yang kuat dan stabil di
rendah protein konsentrasi yang diperlukan untuk single-molekul pengalamanKASIH. Sebaliknya, kami memilih pendekatan dimerisasi DNA-based yang
mencapai tinggi afinitas (subfemtomolar untuk duplex 21-base-pair di
22 C (ref. Fleksibilitas 33)) dan kombinatorial dan yang memungkinkan individu
-32
32
48
64
-16
0
16
b
e
Langkah ukuran (nm)
Normalized frekuensi
1D ukuran langkah
0
0.05

0.10
0.15
0.20
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
-48 -32 -16
0
16
32
48
Off-axis ukuran langkah (nm)
Normalized frekuensi
Kanan (2
nd
langkah)
Kiri (2
nd
langkah)
sebuah
Kanan (1
st
langkah)
Kiri (1
st
langkah)
c
200
400
600
800
90
270
180
0
Minus end
Ditambah end
300
330
60
30
120
150

210
240
Off-axis
On-axis
+
2D ukuran langkah
d
-48 -32 -16
0
16
32
48
0
0.05
0.10
0.15
0.20
Normalized frekuensi
Off-axis ukuran langkah (nm)
Kiri (2
nd
langkah)
Kanan (2
nd
langkah)
Qdot
Gambar 2 analisis Dua-dimensi melangkah GST-dynein homodimers. (A) Skema dari GSTdynein homodimer dilabeli dengan Qdot melalui suatu
N-terminal (ekor domain) HaloTag dan diagram dari mikrotubulus menunjukkan on-dan offsumbu arah gerakan. (B) Histogram ukuran langkah dynein ini
dalam satu (1D) dan dua (2D) dimensi N = 1.391 langkah untuk semua panel.. (C) Suatu
histogram sudut (atau mawar plot) dari sudut langkah. Sudut melangkah adalah
didefinisikan sebagai sudut antara vektor melangkah dan arah pada sumbu gerakan. Langkahlangkah ke kiri atau kanan arah gerakan yang
antara 0 dan 180 atau antara 180 dan 360 , masing-masing. Langkah antara 90 dan 270
adalah langkah mundur. (D) Histogram off-axis ukuran langkah.
(E) Histogram langkah ke kiri atau ke kanan setelah langkah kiri atau kanan sebelumnya.
Langkah ke kiri dan ke kanan yang ditampilkan sebagai langkah dengan negatif dan
positif off-sumbu komponen, masing-masing.
b
1
M
250 kd
2
3

4
c
d
Waktu
Mikrotubulus
f
e
sebuah
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Langkah 2D Ukuran (nm)
Normalized frekuensi
GST-dynein
DNA-dynein
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
300
0
50 100 150 200 250
0
GST-dynein
DNA-dynein
Normalized frekuensi
0
2
4
6
8
10
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Velocity (nm s
-1
)
GST-dynein

DNA-dynein
Normalized frekuensi
Jalankan panjang (pM)
-32 -16
0
16
32
48
64
TMR
Atto647N
DNA heterodimer
0.30
Monomer
Dimer
0
2
4
6
8
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0
2
4
6
8
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Normalized frekuensi
Normalized frekuensi
Waktu tinggal (s)
Waktu tinggal (s)
GST-dynein

DNA-dynein
g
h
Kelebihan oligo * A
+
Dynein-oligo A *
+
+
+
Dynein-oligo A
+
+
+
Gambar 3 DNA berbasis dynein heterodimer yang fungsional dan langkah serupa dengan protein
berbasis homodimers dynein. (A) Skema dari dynein berbasis DNA
heterodimer berlabel Atto647N (red star) dan TMR (green bintang) melalui C-terminal HaloTag
(lingkaran merah muda). The SNAP-tag dan DNA oligomer
(Terlampir melalui tag SNAP-N-terminal) diperlihatkan dengan warna biru. (B) LDS-PAGE gel
menunjukkan dimerisasi dari monomer dynein melalui hibridisasi DNA.
Oligo, oligonukleotida. (C) Kymograph dari motilitas DNA berbasis dimer dynein berlabel TMR
(hijau) dan Atto647N (merah), dengan tumpang tindih, dualberlabel heterodimer dengan warna kuning. Skala bar: y, 1 menit, x, 10 pM. (D) Histogram dari
kecepatan GST-dan DNA berbasis dimer dynein. (E) Histogram
dari panjang menjalankan dimer dynein GST-dan DNA-based. (F) Histogram dari ukuran dua
dimensi (2D) langkah-GST dan DNA berbasis dynein dimer
diberi label dengan Qdot tunggal 655 pada domain ekor N-terminal. (G, h) Histogram dari
distribusi waktu tinggal GST-dynein homodimers (g) dan
DNA-dynein heterodimers (h) diberi label dengan Qdot tunggal 655 pada domain ekor Nterminal. Distribusi yang cocok untuk fungsi eksponensial tunggal
dengan tingkat melangkah k = 1,78 0,13 s
-1
dan 1,43 0,10 s
-1
, Masing-masing.
Page 4

2.012
Alam
Amerika,
Inc

All rights reserved.

memajukan publikasi alam secara online strukturmolekulbiologi&


artikel
modifikasi protomer masing-masing dalam dimer
34
. Kami beralasan bahwa
molekul dynein akan setuju untuk metode ini, karena yang
antarmuka dimerisasi menunjukkan plastisitas besar
5
. Selanjutnya, DNA
antarmuka dimerisasi harus stabil di bawah beban, seperti ragi dynein
Generasi gaya maksimum telah diukur untuk be7 pN (band. 2 2),
sedangkan 'unzip' DNA membutuhkan kekuatan of14 pN (band. 35).
Untuk membuat DNA berbasis dimer dynein, kita direkayasa mono-dynein
mer protein fusi di mana SNAP-tag menggantikan N-terminal
dimerizationdomainoftheendogenousdyneinheavychain ( Gambar. 1a, b ).
ThisdyneinmonomerisalsofusedtoaHaloTagattheCterminusofthe
bermotor domain untuk mengaktifkan pelabelan fluorophore ( Gbr. 1a dan 3a ). Keduanya
SNAP-tag dan HaloTag adalah enzim kecil yang membentuk ikatan kovalen
dengan substrat mereka, yang dapat digabungkan ke fluorophores, biotin atau
reaktif kimia kelompok. Mengambil keuntungan dari fleksibilitas
SNAP-tag, kami ditambah 5 'atau 3' akhir pelengkap, 21-nukleotida
DNA oligonukleotida ke substrat SNAP, benzylguanine, dan
DNA-benzylguanine molekul yang kemudian dicampur dengan dimurnikan, SNAPtagged monomer dynein. Kami menemukan bahwa metode ini dimerisasi
adalah sangat spesifik, dengan monomer dynein melekat pelengkap
oligomer membentuk dimer yang stabil, tetapi tidak di hadapan kelebihan, competing oligomer ( Gambar. 3b , Bandingkan jalur 3 dan 4).
Untuk menentukan apakah DNA-terdimerisasi dynein adalah fungsional, kita comdikupas motilitas dan pola loncatan untuk GST-dynein homodimers.
Setiap monomer dynein diberi label dengan organik kecil yang berbeda
fluorophore (TMR atau Atto647N) melalui C-terminal HaloTag
sebelum dimerisasi ( Gambar. 3a ). Menggunakan mikroskop TIRF, kami menemukan bahwa
mayoritas motor bergerak adalah dual-berlabel ( Gambar. 3c ), Dan mereka
kecepatan dan panjang run yang mirip dengan GST-dynein homodimers
(134 60,4 nm s
-1
(Rata-rata sd) dan 1,06 0,044 m (rata-rata sem,
N = 943) untuk GST-dynein, 125 56,1 nm s
-1
(Rata-rata sd) dan 1,45
0.063 m (rata-rata sem, N = 866) untuk DNA-dynein). ( Gambar. 3d, e ). Sebagai
tes yang lebih ketat fungsi, kami menentukan dua-dimensiLangkah sional ukuran dan diam-waktu distribusi DNA-dynein dimer
dengan label domain ekornya dengan Qdot 655. Sekali lagi, kami menemukan ini

parameter untuk menjadi sebanding dengan GST-dynein homodimers


( Gambar 3f -. h ). Terutama, perilaku melangkah DNA-dynein heterodimer juga mirip dengan dynein ragi asli dianalisis pada kedua tingkatmembatasi dan seluler ATP konsentrasi
5, 22
, Indikasi lebih lanjut bahwa
kedua metode dari dimerisasi dan ATP rendah konsentrasi (untuk
memperlambat kecepatan motor) yang digunakan dalam percobaan kami tidak mengubah
dynein yang melangkah perilaku. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa
DNA-dynein heterodimer merupakan sistem model yang efektif untuk membedahing mekanisme dynein melangkah.
Loncatan dynein adalah berbeda dari kinesin dan myosin
Semua processive dimer myosin dan kinesin motor dipelajari untuk saat ini
mencapai motilitas processive dengan bergantian posisi dua mereka
bermotor domain dalam ruang dan waktu (tangan-over-tangan loncatan).
Kami berusaha untuk menentukan apakah dynein memiliki spasial yang sama dan temporal pola melangkah. Untuk melakukannya, kami menggunakan kami DNA-dimerisasi
Metode untuk membangun heterodimer dynein berlabel dengan terang
fluorophores Cy3B dan Atto647N, yang jauh lebih kecil (2 nm
dalam ukuran) dibandingkan qdots (biasanya> 15 nm, lebih besar dari motor dynein
domain) dan dengan demikian tidak akan mengganggu gerak dynein itu. Dualberlabel dynein motor yang dicitrakan menggunakan hampir bersamaan,
bolak-eksitasi, presisi tinggi TIRF mikroskop bawah tingkatmembatasi kondisi ATP. Kami terletak posisi centroid dari masing-masing
fluorophore-berlabel bermotor domain dengan presisi tinggi dengan menerapkan
dua-dimensi Gaussian cocok untuk data dari masing-masing saluran
36
,
memungkinkan untuk posisi pengukuran presisi nm of3.5 di kedua
arah x dan y untuk kedua Atto647N dan saluran Cy3B
(Tambahan Gambar 1b, c,. Lihat Metode Tambahan). Untuk
tepatnya colocalize data Cy3B dan Atto647N, kami menerapkan
molekul resolusi tinggi tunggal colocalization (SHREC) metode
37
,
yang menghasilkan kesalahan pemetaan berarti of4 nm baik di x dan y
**
Pada sumbu perpindahan (nm)
Waktu (s)
sebuah
b
110 120 130 140 150 160 170
Waktu (s)
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Pada sumbu perpindahan (nm)

c
Cy3B
Atto647N
Satu-dimensi proyeksi
Off-sumbu perpindahan (nm)
Satu-dimensi proyeksi
d
Persen langkah
Tidak
lewat
Lewat
e
Persen langkah
Alternating
Tidak
bolak
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
f
Persen langkah
Alternating,
lewat
Alternating,
tidak lulus
Tidak bolak,
lewat
Tidak bolak,
tidak lulus
Co-aligned
0

10 20
30 40
50 60 70
80 90 100
16 nm
16 nm
**
**
**
**
**
**
Gambar 4 Dua-warna pelacakan dynein melangkah. (A) Perwakilan duawarna melangkah jejak dari heterodimer DNA-dynein. Kiri dan pusat panel,
baku dua dimensi posisi (titik hitam di panel kiri dan tengah) dari
heterodimer DNA-dynein diberi label dengan Cy3B dan Atto647N. Panel kanan,
co-alignment jejak bermotor domain dari masing-masing saluran. Darker biru
(Cy3B) dan merah (Atto647N) garis dan titik merupakan langkah ditentukan
oleh langkah dua dimensi menemukan algoritma, lebih besar, lebih ringan berwarna biru
dan lingkaran merah mewakili sd dari langkah-langkah individu. (B) Satu-dimensi
on-sumbu proyeksi dua dimensi data dari, dengan ringan biru
dan bar merah mewakili sd dari langkah-langkah individu. Oval sorot
contoh tangan-tangan over-(oranye) atau inchworm (hijau) langkah. Itu
y-sumbu garis grid diberi jarak 16 nm terpisah di semua panel. (C) Contoh
satu-dimensi pada sumbu proyeksi dari dua warna melangkah pasang jejak dari
dual-berlabel DNA-dynein heterodimer berwarna sama seperti di b. Abu-abu
panah, mulai dari jejak masing-masing. Lampu hijau dan merah tanda bintang, bolak-balik dan
langkah melewati (tangan-over-tangan), tanda hijau dan merah gelap, bolak
dan tidak melewati langkah ('inchworm'); hijau muda dan oranye tanda cahaya,
tidak bolak-balik dan melewati langkah-langkah, hijau tua dan oranye tanda cahaya,
tidak bolak-balik dan tidak melewati langkah-langkah. (D) Temporal analisis
relatif frekuensi melangkah peristiwa. Alternating, saat ini dan sebelumnya
loncatan peristiwa yang berasal dari kepala yang berbeda, non-bolak, saat
dan acara melangkah sebelumnya berasal dari kepala yang sama N = 268..
(E) Analisis spasial frekuensi relatif passing atau tidak lulus
melangkah peristiwa. N = 233. (F) temporal dan spasial analisis Gabungan
melangkah peristiwa. N = 135.
Halaman 5

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.
sifat struktural & biologi molekuler memajukanpublikasionline

artikel
arah dan ketidakpastian keseluruhan dalam pengukuran kami of6 nm
(Tambahan Gambar 3a, b,. Lihat Metode Tambahan).
Gambar dari saluran Cy3B dan Atto647N disaring untuk
dual-berlabel motil molekul dengan jelas dua-dimensi
melangkah cluster (lihat Metode Tambahan). Kami menganalisis 27
berbeda dua warna dynein melangkah pasang jejak, mengandung 708
langkah ( Gambar 4a, b. dan Gambar Tambahan 3c -. l). Rata-rata satudimensi, dua dimensi (bandingkan Gambar Tambahan. 2i
dengan Gambar Tambahan. 3g, h) dan ukuran langkah off-axis (bandingkan
Tambahan Gambar. 2g dengan Gambar Tambahan. 3i, j) adalah pemlar ke ukuran domain motor langkah kami amati untuk Qdot-label
GST homodimers. Selain itu, satu-dimensi pada sumbu-langkah
ukuran (Tambahan Gambar. 3g, h) kami amati di setiap saluran untuk
DNA-dynein juga sangat mirip dengan yang kita sebelumnya
diukur untuk full-length dynein ragi asli sitoplasma
5
, Yang lain
indikasi bahwa metode DNA-dimerisasi adalah model yang efektif
sistem untuk memeriksa mekanisme loncatan dynein.
Pelabelan masing-masing dua dynein ini domain motor dengan warna yang berbeda
fluorophores memungkinkan kita untuk mengamati spasial dan temporal hubungankapal dari domain bermotor selama gerakan processive ( Gambar. 4a, b ;
lihat Gambar Tambahan. 3c - f untuk jejak tambahan). Di sini kita menggunakan
istilah 'bergantian' atau 'tidak bolak' untuk menggambarkan motor
domain 'perilaku relatif temporal dan' lewat 'atau' tidak lulus '
untuk menggambarkan perilaku relatif spasial mereka. Mayoritas (74%) dari
langkah dynein berganti-ganti dalam waktu, tetapi non-bolak peristiwa (satu
Kepala mengambil beberapa langkah berturut-turut) juga diamati ( Gambar 4b -. d
dan Tambahan Gambar. 3d, f). Dalam analisis spasial kami dynein langkahping, kami menemukan bahwa sebagian besar (83%) dari langkah dynein tidak lulus
satu sama lain, meskipun melewati peristiwa (satu kepala beralih dari
mengarah ke posisi tertinggal) juga diamati ( Gambar. 4b, c, e , dan
Tambahan Gambar. 3d, f). Hasil ini ( Gambar. 4f ) Berada dalam ditandai conTRAST ke dipelajari dengan baik berkepala dua kinesin processive dan myosin
motor, yang menunjukkan tangan-over-tangan loncatan
26, 27
.
Spasial hubungan dua dynein ini domain motorik
Meskipun laporan baru tentang struktur domain dynein motorik mendekati
atom resolusi
18, 20
, Posisi dan orientasi dari setiap motor
domain dalam dimer ketika terikat untuk mikrotubulus tetap
diketahui. Oleh karena itu, kita selanjutnya menentukan jarak antara
dynein motorik domain dalam 'keadaan dua kepala terikat', ketika kedua

kepala yang bersamaan terikat mikrotubulus ( Gambar. 5a, b , dan


Tambahan Gambar. 4a - c). Sebagai dimensi motor dynein
domain are12 nm (diameter cincin + AAA) sebesar 10 nm (tebalness dari cincin + AAA dan linker) ( Gambar. 1c ), Data kami menunjukkan bahwa
dynein bermotor domain diposisikan berdekatan. Namun,
untuk mengakomodasi jarak terbesar kami amati antara motor
domain (4% dari head-to-head jarak adalah> 30 nm), domain linker
undocking dari domain bermotor mungkin terjadi, fenomena
yang telah diamati dalam studi mikroskop elektron dari kedua cytoPlasmic dan axonemal dyneins
10, 12
. Selain itu, tidak seperti lainnya cytorangka motor, distribusi head-to-head jarak untuk dynein
adalah luas dan bervariasi secara luas dalam jejak individu ( Gambar. 4a - c dan
Tambahan Gambar. 3c - f), lebih menyoroti sifat yang tidak biasa
mekanisme dynein yang melangkah.
Dua-dimensi pelacakan kami dynein melangkah juga memungkinkan
kita untuk menentukan hubungan spasial dari masing-masing motor dynein
domain di negara relatif dua kepala terikat ke arah
gerak di sepanjang mikrotubulus ( Gambar. 5a ). Dalam analisis motor
dengan statistik diatasi (two-tailed Student t-test dengan 0,05)
memimpin atau tertinggal dan posisi kiri atau kanan, kita melihat bahwa timbalKepala ing lebih cenderung ke kanan dari sumbu gerak,
sedangkan kepala tertinggal lebih cenderung ke kiri
sumbu gerak ( Gambar. 5c ). Tren ini juga meluas ke seluruh dataset
(Gambar Tambahan 4d.). Hal ini menunjukkan bahwa dua motor domain
dari dimer dynein tidak biasanya berada pada protofilament yang sama
mikrotubulus a. Temuan ini juga menyiratkan bahwa setiap dynein bermotor
domain mempertahankan identitas yang relatif stabil menjadi hak-terkemuka
kepala atau kepala kiri-lagging. Meskipun kepala dynein memiliki yang berbeda
identitas kiri atau kanan (64% dari kepala terkemuka yang ke kanan
mikrotubulus axis), arah langkah berikutnya yang diambil oleh baik
memimpin atau tertinggal kepala didominasi ke depan, tanpa sumbu offbias ( Gambar. 5d ), menunjukkan bahwa dua motor dynein ini biasanya Domain
straddle setidaknya satu protofilament mikrotubulus, tetapi kemudian bergerak untukmenangkal menjelang akhir minus mikrotubulus itu.
sebuah
Head-to-head jarak (nm)
Maupun
maliz
ed fr
equenc
y
b
Berarti = 18 11 nm
0

10
20
30
40
50
60
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Terkemuka
Lagging
+
Off-axis
Head-to-head
jarak
On-axis
c
d
Memimpin kepala:
arah langkah berikutnya
Lagging kepala:
arah langkah berikutnya
-32
-16
16
32
-32
-16
0
16
32
0
10
20
30
40
50
60
0
Off-sumbu jarak (nm)
Pada sumbu jarak (nm)
Memimpin kepala

Lagging kepala
+
20
40
60
30
210
60
240
90
270
120
300
150
330
180
0
Memimpin kepala
Lagging kepala
30
210
60
240
90
270
120
300
150
330
180
0
20
40
30
210
60
240
90
270
120
300
150
330
180
0

10
15
5
+
+
Gambar 5 pengaturan spasial domain dynein bermotor selama duakepala-terikat negara. (A) Skema dual-berlabel DNA-terdimerisasi dynein
terikat untuk mikrotubulus a. Lain pengaturan dari domain bermotor
yang mungkin. Fluorophores diwakili oleh bintang-bintang merah dan hijau.
(B) Histogram head-to-head dynein ini jarak selama duakepala-negara terikat N = 523.. (C) Plot Contour menunjukkan kiri dan kanan
asimetri antara kepala terkemuka dan lagging. Orientasi
sumbu mikrotubulus adalah vertikal, seperti yang ditunjukkan oleh - dan +, dengan centroid
posisi setiap molekul dynein ditempatkan pada asal sumbu (X putih).
Jumlah kejadian setiap posisi yang ditunjukkan oleh bar warna
di sebelah kanan, dengan tepi bin pada 8-nm penambahan pada kedua sumbu. N = 256
dimer atau 512 kepala. (D) Kiri histogram, sudut posisi
terkemuka dan lagging kepala dimer dynein individu relatif terhadap mereka
masing centroid posisi (ditempatkan pada asal sumbu). Lokasi
ke kiri atau kanan dari arah gerak adalah antara 0 dan 180 ,
atau 180 dan 360 , masing-masing N = 256 atau 512 kepala dimer.. Benar,
sudut distribusi langkah berikutnya yang diambil oleh kepala terkemuka atau tertinggal.
Langkah antara 90 dan 270 adalah langkah mundur.
Halaman 6

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.

memajukan publikasi alam secara online strukturmolekulbiologi&


artikel
Langkah dynein dapat berupa stokastik atau terkoordinasi
The spasial asimetri antara motor terkemuka dan lagging
domain menyarankan bahwa dua dynein itu kepala memiliki identitas yang berbeda
ketika mikrotubulus-terikat. Selain itu, studi perangkap optik memiliki
menunjukkan bahwa dynein merespon asimetris ke belakang dan ke depan
Pasukan
22
. Untuk menentukan apakah ketegangan memiliki peran dalam dynein langkahping, kami menganalisis durasi dua kepala negara terkait terikat
dengan memimpin-atau lagging-kepala melangkah peristiwa. Durasi rata-rata untuk

dua-kepala-negara terikat diakhiri oleh loncatan lagging-kepala (4.3 s,


N = 228) secara signifikan lebih pendek dibandingkan dengan dua kepala negara terikat
diakhiri oleh loncatan terkemuka-kepala (5,4 s, N = 119, P = 9,7 10
-5
,
alpha 0.05, satu-tailed Kolmogorov-Smirnov (KS)-test, Gambar. 6a ). Kita
hipotesis bahwa respon asimetris yang maju dan tertinggal
kepala adalah karena perbedaan arah gaya masing-masing
vektor bertindak atas mereka sepanjang sumbu mikrotubulus.
Karena domain bermotor dipisahkan oleh jarak yang lebih besar dapat experience meningkatkan ketegangan, kami memeriksa apakah ini dynein melangkah
Pola berubah sebagai fungsi dari jarak head-to-head. Dynein
bermotor domain yang berdekatan memiliki probabilitas yang sama
dari loncatan kepala terkemuka atau tertinggal ( Gambar. 6b ), Tetapi sebagai kepala
menjadi dipisahkan oleh jarak yang lebih besar dalam arah on-sumbu,
tertinggal kepala itu semakin lebih mungkin untuk langkah ( Gambar. 6b ). Ini
Tren juga diamati ketika kita memeriksa durasi
dua-kepala-terikat negara sebagai fungsi jarak antara motor
domain dalam arah pada sumbu. Seperti jarak yang lebih besar dipisahkan
motor domain, durasi negara dua-kepala-terikat
menurun ( Gambar. 6c ). Selain itu, kami menemukan bahwa arah
dari gaya adalah penting untuk efek ini, selama tidak ada persentase
kepala terkemuka melangkah dibandingkan tertinggal kepala melangkah maupun
durasi negara dua-kepala-terikat bervariasi sebagai fungsi dari
jarak antara domain motor, ke arah off-axis
(Gambar Tambahan 5a,. B).
Hasil kami menunjukkan bahwa loncatan, stokastik tidak terkoordinasi
mendominasi ketika domain bermotor dynein yang berdekatan, tapi ketika
Dua dynein motorik domain yang dipisahkan oleh jarak yang lebih besar, langkahping menjadi semakin terkoordinasi ( Gambar. 6d ). Kami berhipotesis bahwa
ketika besar jarak dua domain bermotor dynein terpisah, dynein
mikrotubulus-binding domain dapat merespon asimetris untuk memaksa di
arah gerakan di sepanjang mikrotubulus (on-axis) tetapi tidak
di seluruh mikrotubulus (off-axis). Hal ini konsisten dengan laporan bahwa
dynein merespon asimetris untuk meneruskan-dan belakang-diarahkan
Pasukan
22
, Serta studi yang menunjukkan bahwa ukuran langkah dynein adalah
lebih kecil di bawah beban meningkat
4, 22
.
PEMBAHASAN
Sebuah Model Baru untuk mekanisme loncatan dynein
Bycombiningtwo-warna, satu-moleculemicroscopywithhigh-presisi,
dua-dimensionaltracking, wehaveshownthatdynein'ssteppingmechaNISM berbeda dari semua motor molekul cytoskeletal ditandai dengan
tanggal. Meskipun banyak dari langkah-langkah yang dynein alternatif dalam waktu,

kebanyakan melangkah
peristiwa tidak beralih identitas spasial terkemuka atau tertinggal dari yang dynein
dua kepala, perbedaan dari myosin berkepala dua processive dan
kinesinmotorsthatusealternatingandpassing (tangan-over-tangan) mekanisme
nisms.Strikingly, ourdatasuggestdynein'sstepsareuncoordinatedwhen
jarak antara domain motor kecil, mungkin karena
regangan intramolekul rendah. Namun, karena jarak antara motor
domainsincreases, ourdatashowthatdyneinbecomesincreasinglycoordinated, mungkin melalui mekanisme ketegangan-based. Temuan
menunjukkan bahwa dynein adalah cytoskeletal berkepala dua pertama processive
motortobeidentifiedthatcanalternatebetweenstochastic-andtensionberdasarkan melangkah untuk mencapai processivity (Gambar. 6d).
Selain kemungkinan bahwa ketegangan dapat mengatur langkah-dynein ini
ping perilaku, ukuran besar motor dynein domain (Gambar 1c)
dapat memberikan kendala sterik pada pola melangkah. Data kami nyarankanGest bahwa keterbatasan struktural mempengaruhi jangkauan dan lokasi
dynein pada kisi mikrotubulus. Kami telah menemukan bahwa dynein memiliki
suatu kiri atau kanan yang melekat asimetri, dengan domain motor yang tepat
dari dimer lebih mungkin untuk menjadi kepala terkemuka dan motor kiri
domain lebih mungkin untuk menjadi kepala tertinggal. Hal ini tidak mungkin bahwa
ini
asimetri yang dihasilkan oleh DNA berbasis dimerisasi, sebagai linker yang kita
telah dimasukkan antara dynein dan DNA mengandung beberapa bebas
rotatable obligasi. Oleh karena itu, kemungkinan sumber asimetri bisa
posisi domain linker, yang terletak di seluruh wajah
AAA + cincin dan bergerak dalam menanggapi hunian nukleotida pada
Aaa1 (refs. 10, 12). Kami mengusulkan bahwa domain linker motor
di sebelah kanan adalah 'terjepit' antara cincin dynein, sedangkan
domain linker dari motor di sebelah kiri tidak terikat oleh motor lain
domain, menanamkan sebuah struktural dan fungsional asimetri (Gambar. 6d).
Kami pengamatan pemisahan besar antara dua motor dynein ini
domain juga menunjukkan bahwa domain linker dapat undock dari
bermotor domain (kemungkinan besar motor lagging, seperti yang ditunjukkan
pada Gambar. 6d,
Panel 2), sebagaimana telah diamati dalam studi mikroskop elektron dari kedua
sitoplasma dan axonemal dyneins
10, 12
.
Sifat stokastik perilaku dynein yang melangkah menimbulkan pertanyaantion bagaimana motor sebagian tidak terkoordinasi mencapai processive
+
+
Stochastic
Ketegangandikoordinasikan
Kepala
menutup
Kepala jauh

selain
Durasi dua-kepala-terikat negara (s)
0.5
Normalized frekuensi
0
10
20
30
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Lagging
Terkemuka
b
0
20
40
60
80
100
0-8
8-16
16-24 24-32
Lagging
Terkemuka
Persen langkah
Arah gerak
On-axis head-to-head jarak (nm)
sebuah
c
0
1
2
3
4
5
6
0-8
8-16
16-24 24-32
On-axis head-to-head jarak (nm)
Dua-kepala-terikat negara (s)
**
*
d
Gambar 6 dynein langkah yang stokastik pada pendek head-to-head jarak dan
terkoordinasi sebagai head-to-head meningkat spasi. (A) Histogram dari
durasi dua-kepala-terikat negara yang dihentikan oleh terkemuka-

kepala melangkah acara atau event-loncatan tertinggal kepala. (B) Relatif


loncatan frekuensi kepala terkemuka dan tertinggal sebagai fungsi dari
on-sumbu jarak antara domain motor. Kesalahan bar mewakili sem
dan dihasilkan oleh bootstrap setiap bin. N = 352. (C) Durasi
negara dua-kepala-terikat diplot sebagai fungsi dari pada-sumbu kepalato-head jarak. Berarti jangka waktu sem ditampilkan (* P = 0,0139,
** P = 0.0094, dua-ekor KS-test, nilai alpha 0,05, N = 485). (D) Model
untuk mekanisme loncatan dynein. Struktur tiga-dimensi dari
dynein (PDB 3QMZ)
18
, Disaring untuk 8- resolusi, yang digunakan untuk menghasilkan
dua mikrotubulus-terikat model dimer GST-dynein. The dynein cincin
ditampilkan sejajar dengan sumbu panjang mikrotubulus dan sejajar satu sama
lainnya, didasarkan pada rekonstruksi mikroskop elektron
51 - 54
. Melangkah adalah
stokastik ketika domain bermotor dynein yang berdekatan (panel kiri).
Jarak yang besar antara dua domain bermotor menghasilkan keteganganberbasis mekanisme yang koordinat melangkah (panel kanan).
________________________________________
Page 7

2.012
Alam
Amerika,
Inc
All rights reserved.
sifat struktural molekul biologi & online publikasi muka
Artikel
motilitas. Dalam kasus kinesin-1, myosin-V dan myosin-VI, processivity dilakukan dengan menjaga kepala terkemuka di kuat,
filamen-terikat negara sampai kepala tertinggal melepaskan dari filament untuk lulus kepala terikat dan menjadi kepala terkemuka baru.
Ketegangan intramolekul antara domain motorik menyediakan nukleosidapasang gating mekanisme yang berpihak pada detasemen lagging
bermotor domain dan mempromosikan bias yang, difusi berbasis pencarian ini
kepala untuk situs filamen berikutnya mengikat
38 - 43
. Ada kemungkinan bahwa itu dynein
tinggi rasio duty
21
secara substansial mengurangi kemungkinan bahwa kedua motor
domain sekaligus memisahkan dari jalur mikrotubulus mereka. Suami
Gagasan ini dikuatkan oleh temuan terbaru menunjukkan bahwa mutan myosin-V
dan myosin-VI motor masih processive bahkan ketika mereka keteganganmekanisme gating berbasis terganggu atau hancur
44, 45
. Namun,
Data kami tidak mengesampingkan kemungkinan gating nukleotida untuk dynein.
Misalnya, fakta bahwa 74% dari langkah-langkah yang kami amati adalah alternat-

ing akan konsisten dengan gating dari beberapa langkah, seperti yang telah
nyarankangested oleh studi dari dynein Dictyostelium sitoplasma
46
.
Kesamaan antara motilitas dari DNA-dynein heterodimer, motilitas dari GST-dynein homodimer dan dari pribumi
ragi dynein
5, 22
menunjukkan bahwa mekanisme loncatan dasar akan
sama untuk dynein asli dan sistem model yang saat ini sedang
digunakan untuk mempelajari mekanisme dynein. Dengan demikian, teknik
berbasis DNA
pembentukan heterodimer yang kami kembangkan akan menjadi alat yang ampuh
untuk kontrol ortogonal atas setiap protomer dynein untuk studi
tambahan heterodimer kombinasi di masa depan. Namun, data kami
tidak mengesampingkan kemungkinan bahwa dimerisasi asli dynein yang antarwajah, terkait subunit (menengah, menengah dan cahaya terang
rantai), kofaktor (dynactin, Lis1 dan Nudel) atau kargo dapat memberikan suatu
tambahan lapisan peraturan tentang mekanisme loncatan dynein. Untuk
Misalnya, mengingat bahwa ketegangan muncul untuk mengkoordinasikan loncatan
dynein,
daerah yang menarik untuk studi di masa depan akan menentukan apakah dynein
ini
Mekanisme melangkah menjadi dikoordinasikan di bawah beban bergerak
kargo besar.
Dalam implikasi vivo
Dibandingkan dengan motor cytoskeletal lain, perilaku dynein yang melangkah
menunjukkan variabilitas yang besar dan fleksibilitas. Banyak langkah dynein
memiliki offsumbu komponen, beberapa langkah yang mundur, dan dua motor dynein ini
domain dapat melangkah secara independen satu sama lain. Kami mengusulkan
bahwa
fleksibilitas memungkinkan dynein untuk menavigasi sitoplasma ramai serta
hambatan pada mikrotubulus. Hasil kami memberikan PENJELASAN-molekul
tion untuk pengamatan bahwa dynein lebih mampu menavigasi hambatan
daripada kinesin motor
47, 48
.
Ini plastisitas jelas dari mekanisme loncatan dynein menunjukkan
bahwa lapisan peraturan dapat digunakan untuk mencapai sel yang berbeda biofungsi logis. Pada sel eukariotik, dynein mengangkut puluhan, jika tidak
ratusan, dari berbagai jenis kargo, tapi hanya ada satu gen tunggal
encoding dynein sitoplasma 1 di semua genom eukariotik sequencing
(Dengan pengecualian dari tanaman berbunga dan ganggang beberapa, yang
kurang
dynein gen
49, 50
). Mengingat variabilitas dari ukuran, jenis dan beban
disampaikan oleh kargo yang berbeda (mulai dari endosomes ke mitosis yang

spindle), sejumlah mekanisme untuk mengatur itu sitoplasma dynein


melangkah perilaku mungkin telah berevolusi. Masa Depan studi tentang fungsi
dari dynein terkait subunit dan kofaktor, mengenai dampak dari kargo
beban pada motilitas, serta bagaimana beberapa motor dapat mengkoordinasikan
untuk memindahkan kargo, akan menentukan apakah ini sebagian tidak
terkoordinasi
motor diatur untuk langkah terkoordinasi untuk beberapa fungsi.
Menggunakan metoda
Metode dan setiap referensi terkait tersedia di online
versi kertas di http://www.nature.com/nsmb/.
Catatan: Informasi Tambahan tersedia di Nature Structural & Molecular
Biologi website.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada X. Su dan D. Pellman (Harvard Medical School) untuk
menyediakan dimurnikan
kinesin-8; S. Zou untuk bantuan teknis, A. Carter, S. rohaniawan, A. Gennerich,
Y. Goldman, A. Hendricks, J. Huang, A. Leschziner dan A. Roberts untuk kritis
komentar pada naskah, F. Aguet, A. Besser, M. Vilela dan G. Danuser
untuk diskusi analisis data, M. Bagonis untuk pekerjaan awal oligomer-SNAP
linking; A. Leschziner bantuan dengan desain gambar, dan A. Carter untuk
menyediakan
MATLAB kode. WQ didukung oleh sebuah persekutuan postdoctoral dari Amerika
Heart Association. SLR-P. didanai oleh Rita Allen Foundation, Harvard
Armenise Foundation dan US National Institutes of Health penghargaan Innovator
Baru
(1 DP2 OD004268-01).
PENULIS KONTRIBUSI
WQ dan NDD berkontribusi sama. WQ, NDD, WS dan SLR-P. merancang
eksperimen. WQ, NDD dan BSG melakukan eksperimen dan menganalisis
Data. WQ, NDD, BSG dan SLR-P. Kertas menulis. EV dan DW menulis
dua-dimensi partikel pelacakan kode.
Bersaing Kepentingan Keuangan
Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan keuangan bersaing.
Diterbitkan online di http://www.nature.com/nsmb/.
sifat struktural & biologi molekuler
doi: 10.1038/nsmb.2205
METODE ONLINE
Ragi strain. Modifikasi rantai S. cerevisiae endogen dynein berat
gen dilakukan dengan penyisipan dipilih lactis Kluyveromyces URA3
penanda ke dalam gen DYN1 di lokasi perubahan yang diinginkan. The K. lactis
URA3 gen kemudian diganti dengan tag SNAP-, SNAPf-tag
(New England Biolabs), HaloTag (Promega) atau GFP. Ragi strain yang digunakan
dalam
Studi yang tercantum dalam Tabel Tambahan 1.
Persiapan HaloTag ligan-fluorophores. HaloTag ligan-fluorophore
konjugasi tidak tersedia secara komersial disiapkan sebagai berikut: Atto647N
adalah terkonjugasi dengan ligan HaloTag dengan mencampur 10 mM Atto647N
NHS ester
(Atto-Tec), 20 mM HaloTag-amina (O4) Ligan (Promega) dan 30 mM
N, N-diisopropiletilamina dalam dimetilformamida dan nutating pada 30 C untuk

24 h. The HaloTag-Atto647N konjugat dipisahkan dari bahan yang tidak bereaksi


dengan HPLC menggunakan kolom fase-balik C18 dengan metanol yang: gradien
air.
Finalproductpuritywas> 85% asassessedbymassspectrometry.Cy3B-HaloTag
disiapkan oleh Bio-sintesis dari Cy3B-NHS (GE Healthcare Lifesciences)
dan HaloTag-amina (O4) ligan (Promega).
Benzylguanine-conjugatedDNAoligonucleotides. Benzylguanine-terkonjugasi
Oligonukleotida DNA dibuat dengan mencampur 10 mM benzylguanine-GLANHS (NewEnglandBiolabs) di anhidrat DMSOwith0.33mMPAGE-dimurnikan
amina-difungsikan oligonukleotida (Bioneer) di 67 HEPES mM (pH 8,5)
dan 50% DMSO (v / v) selama 30 menit pada 22 C. Bereaksi benzylguanine-GLANHS
telah dihapus dengan menggunakan Micro Bio-spin 6 Kolom (Bio-Rad), pradiseimbangkan dengan
10 mM Tris (pH 8.0), 150 mM KCl dan 10% (v / v) gliserol. Keterkaitan benzilguanin untuk oligonukleotida dikonfirmasi oleh tes pergeseran gel pada gel TBE
20%
(Invitrogen). Urutan oligonukleotida yang digunakan untuk dimerisasi dynein
terdaftar
dalam Metode Tambahan.
Protein pemurnian dan pelabelan. Dynein motor yang dimurnikan seperti yang
dijelaskan
sebelumnya
5
, Dengan modifikasi rinci dalam Metode Tambahan.
Motor diberi label dengan benzylguanine-oligonukleotida dan HaloTag
ligan-fluorophores selama pemurnian dynein (lihat SupplementaryMethods).
Oligonucleotidesusedforlabelingdyneinanddyneinmonomersusedindifferent
percobaan tercantum pada Tabel Tambahan 2.
TIRF mikroskop. Tes motilitas dilakukan dengan menggunakan tujuan terbalik
Tipe Olympus IX-81 TIRF mikroskop dengan perendaman 100 1,45 minyak NA
TIRF Tujuan (Olympus) dilengkapi dengan empat terus-gelombang dioda-dipompa
solid state laser: 405-nm dan 640 nm laser-kubik (koheren) dan 491-nm dan
561-nmlasers (Cobolt). Signalsweredetectedwithaback-thinnedelectronmultiplier kamera CCD (Hamamatsu). Untuk pencitraan hampir bersamaan, dua warna,
mikroskop telah dimodifikasi untuk menyertakan dual-band Laser cermin polychroic
(Z561/635rpc, Chroma) dan dual band-tergagap filter emisi (etCy3/Cy5m,
Chroma) di jalur optik utama. Jalur eksitasi laser 561 nmdikontrol oleh acousto-optik merdu (Neos filter, waktu respon
10 ms), dan dari laser nm 640 dikontrol oleh rana mekanik cepat
(SmartShutter, Sutter, waktu respon 25 ms).
Melangkah analisis. Sebuah program kustom ditulis dalam MATLAB (Mathworks)
untuk menganalisis perilaku dynein melangkah di kedua domain temporal dan
spasial
dan menentukan peristiwa berkorelasi. Singkatnya, semua berlaku berdiam
dimasukkan dalam analisis
setidaknya tiga frame lama di saluran masing-masing. Sebuah langkah dihitung
hanya jika berdiam sebelum dan sesudah mengandung setidaknya tiga frame
dalam langkah ini
channel.Two-kepala-boundstatesweredefinedascontainingthreepointsormore

(Dua dalam satu saluran dan satu yang lain), di mana semua poin adalah bagian
dari yang valid
dwelllocationintheirrespectivechannels.Alternatingandnon-alternatingsteps
ditugaskan hanya ketika kedua langkah saat ini dan sebelumnya telah diputuskan
dalam
waktu (yaitu, lebih dari satu frame menjauh dari satu sama lain). Memimpin atau
tertinggal
identitieswereassignedonlyifthepositionsofbothheadsweredifferent, asdeterditambang oleh Mahasiswa-dua ekor t-test dengan tingkat alfa 5%. Data posisi yang
terdistribusi normal dari mean, keputusan di-tes yang sesuai. Klasifikasi
yang lewat dan tidak melewati langkah-ditugaskan hanya jika memimpin
dibandingkan tertinggal
identitas sebelum dan sesudah langkah bisa ditentukan. Lihat Tambahan
Metode untuk rincian.