TUGAS MATA KULIAH FITOKIMIA

TEKNIK PEMISAHAN MENGGUNAKAN

KROMATOGRAFI KOLOM

Disusun oleh :
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Hamdan nababa
Yuliana safitri
Martha
Syahrul
Siti anifiyah
vicka

(10114071)

PRODI S1-FARMASI
FAKULTAS FARMASI
INSTITUTE ILMU KESEHATAN BHAKTI WIYATA
KEDIRI
2016/2017

Kromatografi Kolom/Column Chromatography

Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau
adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan kedalam kromatografi cair padat (KCP) kolom
terbuka. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponenkomponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam.
Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat
(adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase
bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang
kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen
komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda
terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu
melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka
yang pertama tama dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada
adsorben. Komponen komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya
terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen komponen tersebut.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di
antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase
bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk
teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya
secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada
fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase
bergerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai
afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan
afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi
kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada
kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padat berpori seperti kieselguhr,
selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat
padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya.
Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert
terhadap senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap

dan menahan fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk
mengalirnya fase bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih
polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi fase bergeraknya dapat berupa zat
cair dan gas yang mengalir membawa komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika
fase bergeraknya dari zat cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini banyak
digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun anorganik.
Parameter yang di gunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom, setelah
mengoptimumkan efesiensi pemisahan secara kromatografi, mutu kromatografi dapat di
kendalikan dengan menerapkan uji kesesuian sistem tertentu. Salah satu diantaranya adalah
perhitungan pelat pelat teoritis untuk suatu kolom dan terdapat dua parameter utama lainnya
untuk menilai kinerja.
Persyaratan kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat
suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih
adsorben yang ukuran butir butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan
makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil
butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom.
Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum
yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat
mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang
di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic.
Bentuk kolom
Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan.
Sebagai akibatnya, zona zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur
bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom
kecil bahaya ini seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih
memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah 20 kali
diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk
yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi satu.
Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang stasioner. Di

bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur.
Kapiler beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah
dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari
cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak
terjadi pembauran antara cairan cairan yang keluar dari kolom.
Kecepatan arus
Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi tercapainya
keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi
lebih teratur. Tetapi kecepatan arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial
dalam fasa mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan bahwa
pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan kolom yang panjang dan
sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai
apabila campuran yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai renyai melalui kolom dan harus dijaga supaya
arusnya tidak berhenti. Komponen komponen yang telah diadsorpsikan oleh adsorben akan
bergerak dalam bentuk gelang gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda beda
melalui kolom dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa tabung
yang dibubuhi tanda tanda. Tabung tabung ini ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor.
Setelah itu fraksi fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki.
Perolehan data
Suatu integrator, jika berdasarkan mikroprosesor atau perakat lunak pc, hanya
mengukur jumlah total arus yang mengalir melewati lebar puncak suatu kromatografi. Untuk
melakukan hal ini , integrator mengukur laju peningkatan tegangan lebih kurang 30 kali
melintasi lebar puncak tersebut. Parameter yang menunjukan waktu pengukuran harus di
mulai adalah ambang batas puncak tersebut, yang menentukan tingkat ketika tegangan sinyal
tersebut harus di naikkan sebelum akumulasi sinyal terjadi. Untuk mencegah penyimpanan
aliran garis dasar, kemiringan kenaikan harus memiliki ketajaman tertentu sebelum di anggap
suatu puncak.

Perhitungan Efesiensi Kolom

Semakin lebar suatu puncak kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya,
semakin kurang efesien kolom pengelusinya.
Persamaan 1
dengan n adalah jumlah pelat teoretis.
Efesiensi kolom biasanya dinyatakan dalam pelat teoretis per meter:
n x 100/L
Pengukuran efesiensi kolom yang lebih ketat, terutama jika waktu retensi analit
tersebut singkat, di nyatakan dengan persamaan 2.
Persamaan 2
Dengan N eff adalah jumlah pelat yang efektif dan mencerminkan berapa kali analit berpartisi
antara fase gerak dan fase diam selama pergerakannya melalui kolom dan tr =tr t0
N eff = 5, 54 (tr : W1/2)
Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H, tinggi pelat teoretis
H=L/N eff
Dengan h adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk berlangsungnya satu tahap partisi.
(Watson 2005)
Pemisahan pada kolom
Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut di cirikan dengan waktu
retensi (tR) dan faktor retensi (k) yang berbanding lurus dengan D. Waktu retensi merupakan
lamanya waktu yang di butuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi dan faktor
retensi di hubungkan oleh persamaan berikut:
tR=tM(1+k)
tM terkadang di tulis t0 dan di kenal sebagai waktu mati merupakan waktu yang di butuhkan
oleh solut yang tidak tertahan untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan
bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karenanya perbandingan
distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0 akan tertahan secara profosional dan akan
mempunyai waktu retensi yang lebih besar dari pada tM, misal:
jika k = 1 maka tR= 2tM
jika k = 2 maka tR = 3tM
kondisi kromatografi umumnya di atur sedemikian rupa sehingga nilai k lebih kecil dari pada
20 untuk menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nilai k dapat di hitung dengan
menyusun ulang persamaan di atas:
tR=tM (1=k) maka k = (tR-tM) / tM

dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut di karakterisasi dengan volume retensi (Vr) yang
merupakan volume fase gerak yang di butuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu
retensi berbanding langsung dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan
sehingga persamaan di atas dapat di tulis kembali:
Vr=Vm (1+k)
Sementara nilai k dapat di ganti dengan:
k=D(Vs / Vm)
dengan menggabungkan kedua persamaan ini maka akan di peroleh:
Vr=Vm(1+D Vs / Vm)
Atau
Vr=Vm+DVs
Vs dan Vm masing-masing merupakann volume fase diam dan volume vase gerak dalam
kolom.
Persamaan tersebut merupakan persamaan pundamental pada kromatografi kolom karena
berhubungan dengan volume retensi solut terhadap perbandingan distribusinya.
.
Penggunaan Kromatografi Kolom
Menganalisa zat pewarna alami dalam tumbuh-tumbuhan. Contohnya mengekstrak daun
atau wortel. Sampel terlebih dahulu dihaluskan secara manual dengan menggunakan mortar,
kemudian ditambahkan dengan pelarut organic yaitu n-hexane, hasil ekstraksi ini kemudian
disaring dan filtratnya dipanaskan diatas penangas air dan dibiarkan sampai mengental.
Kolom yang dipergunakan misalnya corong pisah yang berbentuk tabung (silinder), dalam
mempersiapkan kolom hal pertama yang perlu dilakukan adalah dengan memasang penahan
pada kolom, penahan yang dipergunakan adalah glass wool, hal ini dilakukan karena glass
wool memiliki kemampuan menyaring dan menahan penyerap lebih baik daripada
menggunakan kapas. Proses memasukan glass wool kedalam corong pisah dilakukan dengan
menggunakan pinset, karena selain dapat menyebabkan gatal pada tangan, glass wool juga
berbahaya jika terhirup. Jumlah glass wool yang ditambahkan secukupnya dan glass wool
yang sudah masuk corong pisah tidak boleh dipadatkan. Penyerap (Alumina/magnesia, silica
gel, karbon, magnesium silikat, magnesium kabonat, kalisum karbonat, dan aluminium
silikat). Penyerap ditimbang secukupnya dan dilarutkan dengan menggunakan pelarut organic
n-hexane sampai penyerap menjadi bubur, kemudian bubur penyerap dimasukan kedalam
corong pisah. Proses memasukan penyerap ini dilakukan dengan menggunakan spatula,
proses ini harus dilakukan dengan cepat karena pelarut yang dipergunakan adalah n-hexane

yang volatile maka bahan penyerap pun menjadi cepat mengering, dan jika bahan penyerap
mengering maka proses memasukannya menjadi lebih sulit.
Proses memasukan penyerap dalam corong dilakukan sebaik mungkin dan homogen
serta hindari terdapatnya gelembung udara, karena gelembung udara dapat menyebabkan
putusnya penyerap dalam kolom. Setelah penyerap dimasukan kedalam kolom, tahap
selanjutnya adalah memasukan kertas saring diatas penyerap sesusai dengan bentuk dari
kolom, pemberian kertas saring ini bertujuan untuk mendapatkan permukaan yang rata,
sehingga contoh akan dengan mudah merata. Contoh dimasukan kedalam kolom yang sudah
dilapisi kertas saring dengan menggunakan pipet tetes, penetesan contoh dilakukan secara
perlahan dan dengan gerakan memutar sehingga contoh dapat menyebar dengan baik. Proses
selanjutnya adalah memasukan pelarut. Penambahan pelarut diatas contoh tersebut dilakukan
sedikit demi sedikit, dan ditambahkan kembali sedikit demi sedikit jika pelarut mulai
berkurang. Pelarut yang ditambahkan akan turun perlahan kebagian penyerap dan
membentuk pita-pita warna sesuai dengan jenis zat warna yang terkandung dalam contoh.
Pelarut tersebut akan turun dan keluar dengan dengan membawa zat pewarna yang terlarut
tersebut.
Kromatografi kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda pemisahan yang
cukup baik untuk sampel lebih dari 1 gram. Pada kromatografi ini sampel sebagai lapisan
terpisah diletakkan diatas fase diam. Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam
sehingga merupakan serbuk kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga
tidak terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel. Fase diam
dan sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari gelas, logam ataupun
plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gravitasi atau
ditekan dan juga disedot dari arah bawa. Komponen sampel akan terpisah selama bergerak
dibawa fase gerak didalam kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh
fase diam akan keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung
sebagai fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).
Kolom kromatografi Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya
beragam. Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya diameternya,
perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan. Perbandingan berat
sampel dan fase gerak (1 : 30) biasanya cukup memadai untuk pemisahan yang mudah,
perbandingan dapat ditingkatkan hingga (1:50) untuk komponen yang susah dipisahkan. Fase
diam Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase dian untuk KLT,

ukuran yang digunakan antara 63-250|iim. Ukuran partikel lebih kecil 63 jam fase gerak akan
mengalir lebih lambat, sehingga perlu ditekan atau dihubungkan dengan pipa hisap. Silika gel
(SiOi) adalah fase diam yang serba guna, banyak digunakan. Pada pembuatannya silika gel
perlu diaktifkan panaskan pada 150-160C selama 3-4 jam. Fase diam lain adalah alumina.
Alat kromatografi kolom sederhana, terdiri dari kolom dari kaca yang ada kranya.
Umumnya panjang kolom minimum 10x diameter pipa kaca yang digunakan dan labu
Erlenmeyer sebagai penampung eluen. Fasa diam berupa adsorben yang tidak larut dalam
fasa gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam. Adanya pengotor dalam fasa diam dapat
menyebabkan adsorbsi tidak reversible. Sebagai fasa diam digunakan alumina, silica gel,
arang, bauksit, kalsium karbonant, bauksit, magnesium karbonat, pati, talk, selulose, gula,
tanah diatom. Pengisian fasa diam ke dalam kolom dapat dilakukan dengan cara kering dan
cara basah. Pada cara basah fasa diam dibuat bubur dulu dengan pelarut yang akan digunakan
untuk fasa gerak, baru kemudian dimasukkan kedalam kolom. Fasa gerak dalam kromatografi
kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi
tertentu. Pelarut dapat polar atau non polar dengan berat molekul kecil lebih cepat
meninggalkan fasa diam.
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode
kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar. Pada kromatografi
kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita bagian atas kolom penyerap
yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastic. Pelarut (fase
gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran ini disebabkan oleh gaya berat atau di
dorong dengan tekanan. Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan,
silica gel, kilsegur terkalsinaasi, dan kilsegur kromatografi murni) dalam keadaan kering atau
sebagai bubur, dimampatkan ke dalam tabung kaca atau tabung kuwarsa dengan ukuran
tertentu dan mempunyai lubang mengalir keluar dengan ukuran tertentu.Sediaan yang diuji
dan dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada puncak kolom dan dibiarkan mengalir
ke dalam zat penyerap. Zat berkhasiat diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan yang
mempunyai

sifat

penyerap

berupa

pita

sempit

pada

daerah

puncak

kolom.

Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut, dengan atau tanpa tekanan udara, masingmasing zat bergerak turun dengan kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom
yang disebut kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh beberapa faktor
misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut dan suhu dari sistem kromatografi. Jika

dikehendaki pemisahan beberapa zat khasiat dapat dilakukan dengan mengalirkan selanjutnya
pelarut yang sama atau pelarut lain yang mempunya daya elusi yang kuat .
Teknik pemisahan kromatografi kolom dalam memisahkan campuran, kolom yang
telah dipilih sesuai ukuran diisi dengan bahan penyerap (adsorben) seperti alumina dalam
keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan
batang pemanpat (pengaduk) untuk memanpatkan adsorben dengan gelas wool pada dasar
kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga
terhindar dari gelembung-gelembung udara. Untuk membantu homogenitas pengepakan
biasanya kolom setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu.
Sejumlah cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom
dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran
diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom, dengan penambahan pelarut (eluen) secara terus-menerus, masingmasing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan
terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen.
Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke
bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan.
Jika kolom cukup panjang dan semua parameter pemisahan betul-betul terpilih seperti
diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka akan terbentuk pita-pita
(zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar dari
kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom.
Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya, misalnya
dengan cara titrasi atau spektofotometri.
2.8. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom
2.8.1 Kelebihan kromatografi kolom :
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative. Digunakan untuk menentukan
jumlah komponen campuran. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi.
2.8.2 Kekurangan kromatografi kolom :
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual. Metode ini
sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming).

DAFTAR PUSATAKA

Sudjadi.1988.Metode Pemisahan. Konsius: Yogyakarta.

Arsyad, M. Natsir, 2001, Kamus Kimia Arti dan Penjelasan Istilah, Gramedia: Jakarta.
Aswad.2001.Kimia Untuk Universitas.Erlangga : Jakarta.
Bernaseoni,G. 2005. Teknologi Kimia. PT Padya Pranita: Jakarta.
Keenan, Charles W. dkk. 2002. Kimia Untuk Universitas Jilid 2. Erlangga: Jakarta.
Mulyadi. 2006. Pengenalan Ilmu Kimia . Bumi aksara: Jakarta
Syukri. 2000. Kimia Dasar 3. ITB Press: Bandung.
Synder, L.R,J.J. Kirkland, dan J.L.Glajch. 1997. HPLC Method Development. New York:
John Willey & Sons.
Watson, G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2. Penerbit Buku Kedokteran: Jakarta.
Prof. Dr. Gholib, Ibnu, dan Rohman, Abdul. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:
Universitas Gadjah Mada.