BAB III

METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan merupakan penelitian eskperimental dengan
desain post test only control yang dilakukan di laboratorium dengan cara
mengukur diameter daya hambat aktivitas antibakteri dan nilai KHM (Kadar
Hambat Minimum) fraksi teraktif dari ekstrak umbi bawang Dayak (Eleutherine
palmifolia (L.) Merr) terhadap bakteri Shigella boydii.

B. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan April sampai Mei 2016 di laboraturium
Farmakognosi Jurusan Farmasi Poltekkes Kemenkes Palembang dan Balai Besar
Laboraturium Kesehatan (BBLK) Palembang.

C. Objek Penelitian
Objek penelitian ini adalah bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.)
Merr) yang diambil dalam keadaan segar di daerah Jln.Kolonel Haji Burlian,
Palembang kebun bapak S. Bagian tumbuhan yang digunakan adalah umbi segar
yang berbentuk bulat telur memanjang, berwarna merah dan tidak berbau, serta
berasa pahit. Umbi lapis berumur 4 bulan dan terdiri dari 5-6 lapisan, dengan
panjang umbi 4-5 cm dan diameter 1-3 cm.

46

47

D. Alat dan Bahan

1. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain,
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.

Botol maserasi
Seperangkat alat destilasi vakum
Corong
Erlenmeyer
Beaker glass
Gelas ukur
Dry Head Oven (DHO)
Jarum ose
Timbangan
Anak timbangan
Tabung reaksi

l. Pipet tetes
m. Kertas saring
n. Kapas
o. Lampu spiritus
p. Corong pisah
q. Cawan petri
r. Autoclave/ Inkubator
s. Pinset
t. Penggaris milimeter
u. Cawan
v. Vial

2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain,
a. Umbi bawang Dayak (Eleutherine
palmifolia (L.) Merr)
b. Etanol
c. n-heksan
d. Etil asetat
e. Aquadest
f. Biakan bakteri Shigella boydii
g. Media Mueller Hinton Agar (MHA)
h. Kloroform

i. HCl jenuh
j. Logam Mg
k. FeCl3
l. Asam asetat anhidrat
m. Asam sulfat 2N
n. Disk Siprofloksasin
o. NaCl
p.Pereaksi mayer (HgCl2+KI)
q. Kloroform ammonia

E. Prosedur Kerja
Adapun prosedur kerja dalam penelitian ini sebagai berikut :
1. Uji Pendahuluan
a. Uji Alkaloid
1) Masukkan 1 ml ekstrak kental di dalam mortir gerus
2) Basahi dengan 5 ml kloroform, tambahkan 5 ml kloroform-ammonia
0,05 M, kemudian saring dengan menggunakan kapas ambil dengan
pipet tetes simplisia yang larut dari mortir ke dalam tabung reaksi

48

3) Hasil saringan ditambahkan 10 tetes asam sulfat 2 N, kocok perlahan

dan biarkan sampai terjadi pemisahan
4) Ambil lapisan asam dan pindahkan ke tabung reaksi lain, tambahkan
peraksi mayer (HgCl2+KI)
5) Jika timbul endapan atau kabut putih positif mengandung alkoloid.
b. Uji Flavonoid
1) Sebanyak 1 ml ekstrak kental masukkan pada tabung reaksi
2) Tambahkan 2 ml etanol, kocok, panaskan dan kocok lagi, kemudian
menyaring filtratnya
3) Menambahkan 0,2 gram Mg dan 3 tetes HCL pada masing-masing
filtrat
4) Amati masing-masing perubahan warna yang terjadi. Jika terjadi
warna merah positif flavonoid
c. Uji Saponin
1) Masukkan 1 ml ekstrak kental ke dalam tabung reaksi
2) Menambahkan 10 ml air
3) Mengocok larutan tersebut selama 10 detik
4) Hasil positif saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang
mantap tidak kurang dari 10 menit, setinggi lebih dari atau sama
dengan 1 cm.
d. Uji Tanin
1) Masukkan 1 ml ekstrak kental ke dalam tabung reaksi
2) Tambahkan 5 ml aquadest, kemudian didihkan dan disaring
3) Ambil filtratnya sebanyak 0,5 ml, tambahkan ferriklorida (FeCl3)
0,1% dan amati terjadinya perubahan warna. Jika timbul warna hijau,
merah ungu, biru atau hitam yang kuat maka dapat disimpulkan fraksi
tersebut positif mengandung tanin.
e. Uji Triterpenoid
1) Masukkan 1 ml ekstrak kental ke dalam cawan penguap
2) Larutkan ekstrak dengan kloroform secukupnya
3) Filtrat diuapkan diatas lampu spiritus
4) Setelah mengering tambahkan pereaksi Lieberman-Burchard yang
terdiri dari campuran 0,5 ml asam asetat anhidrat dan 2 ml asam sulfat
pekat melalui dinding tabung tersebut

49

5) Jika timbul warna merah, positif mengandung terpenoid. Jika timbul

warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau hijaubiru positif mengandung triterpenoid/steroid.
2. Persiapan Bahan Simplisia
Umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr) segar sebanyak 2
kilogram dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan di atas kertas perkamen,
lalu dirajang sehingga diperoleh ketebalan 1-2 mm dan ditimbang berat basahnya.
Kemudian dikeringkan tanpa terkena sinar matahari secara langsung hingga
kering dan rapuh (diremas menjadi hancur). Pembuatan simplisia dengan cara
pengeringan harus dilakukan dengan cepat, tetapi pada suhu yang tidak terlalu
tinggi. Pengeringan yang dilakukan pada suhu terlalu tinggi akan mengakibatkan
perubahan kimia pada kandungan senyawa aktifnya (Nur, 2011). Selanjutnya,
setelah simplisia kering diserbuk dengan menggunakan blender dan ditimbang
berat serbuk keringnya. Serbuk ditimbang sebanyak 1 kilogram.
3. Pembuatan Ekstrak Umbi Bawang dayak (Eleutherine palmifolia (L.)
Merr)
Pembuatan ekstrak pada penelitian ini dilakukan dengan menyari serbuk
umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr) dengan cairan penyari
etanol 96% menggunakan metode maserasi. Proses maserasi dilakukan sebagai
berikut :
a.

Timbang serbuk simplisia umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.)

Merr) sebanyak 1 kilogram dimasukkan ke dalam botol/bejana maserasi

50

b. Serbuk simplisia umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr)

diekstraksi dengan penyari etanol 96% yang sudah didestilasi hingga
seluruh serbuk simplisia terendam dan ada selapis penyari di atas serbuk
simplisia
c. Tutup rapat botol/ bejana maserasi simpan ditempat gelap terlindung dari
cahaya sambil sesekali dikocok tiga kali sehari selama 15 menit, biarkan
selama 5 hari (Voigt, 1995). Pengocokan berulang kali ini diharapkan bisa
mempercepat proses pelarutan komponen kimia yang terdapat dalam
sampel.
d. Kemudian, ekstrak dipisahkan dengan penyaringan, diperas ampas dan hasil
saringan diendapkan beberapa lama selanjutnya enap tuangkan ke wadah
lain. Pengendapan ini bertujuan untuk memisahkan dua cairan yang tidak
bercampur.
e. Ulangi perendaman etanol hasil destilasi beberapa kali sampai penyarian
sempurna atau sampai sampel tersari semua yang ditandai dengan pelarut
menjadi jernih kembali, setelah semuanya disaring maka didapatkan ekstrak
umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr)
f. Selanjutnya hasil maserasi (maserat) dipekatkan dengan destilasi vakum
pada suhu rendah hingga diperoleh ekstrak kental.
4. Fraksinasi ekstrak etanol umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia
(L.) Merr)
a. Ekstrak kental sebanyak 50 gram dilarutkan ke dalam 100 ml air hingga
seluruh ekstrak larut sempurna.
b. Selanjutnya difraksinasi menggunakan corong pisah dengan pelarut nheksan (jumlah pelarut yang digunakan untuk fraksinasi sebanding dengan
jumlah air yang ditambahkan ke dalam ekstrak etanol dengan perbandingan

51

1:1) yang bersifat non polar, kemudian dikocok, setelah itu di pisahakan
antara fraksi n-heksan dan air, dilakukan sebanyak 3 kali.
c. Kemudian fraksi air difraksinasikan dengan etil asetat (jumlah pelarut yang
digunakan untuk fraksinasi sebanding dengan jumlah air yang ditambahkan
ke dalam ekstrak etanol dengan perbandingan 1:1) yang bersifat semi polar
kemudian dikocok, setelah itu di pisahakan antara fraksi etil asetat dan
fraksi air, dilakukan sebanyak 3 kali.
d. Fraksi n-heksan, etil asetat dan air yang diperoleh kemudian ditampung dan
tiap-tiap fraksi dicuci dengan NaCl jenuh kemudian pekatkan dengan
destilasi vakum.
e. Fraksi n-heksan, etil asetat dan air yang diperoleh ditimbang beratnya
kemudian diuji kandungan kimianya dan dilakukan pengenceran dari
masing-masing fraksi untuk mendapatkan konsentrasi 50% b/v, 25% b/v,
12,5% b/v, 6,25% b/v, 3,12% b/v, 1,56% b/v, 0,78% b/v (Handayani, 2015).
5. Sterilisasi Alat
Seluruh alat yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri harus disterilkan
terlebih dahulu dengan cara :
a. Alat-alat seperti cawan petri, gelas ukur, tabung reaksi, dan pipet tetes
disterilkan dlam Dry Head Oven pada suhu 160oC selama 2 jam.
b. Alat logam seperti jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara membakar
ujungnya pada lampu spiritus.
c. Untuk medium, disk dan aquadest dalam alat autoclave pada suhu 121oC
selama 15 menit.
6. Pengukuran Diameter Hambat
a. Pembuatan Kertas Cakram

52

Cakram disediakan dengan cara membeli kertas cakram siap pakai,

kemudian kertas cakram disterilakan dahulu dalam autoclave pada suhu 121oC
selama 2 jam.
b. Penyiapan Cakram
1) Kertas cakram dicelupkan ke dalam fraksi n-heksan, fraksi etil asetat
dan fraksi air ekstrak bawang Dayak dengan berbagai konsentrasi,
larutan baku pembanding siprofloksasin dan blanko.
2) Kemudian dengan bantuan pinset, kertas cakram diambil dan
diletakkan di dalam cawan petri, biarkan kering dalam suhu kamar
3) Cakram yang belum digunakan disimpan didalam lemari pendingin.
c. Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Bahan-bahan Mueller Hinton Agar (MHA) yang terdiri dari beef bifusion 2
gr, basic amino acid 17,5 gr, starch 1,5 gr dan bacio agar 17 gr masukkan dalam
erlenmeyer dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu ukur pH sampai 7,3 tutup
dengan kapas. Tempelkan tape indicator pada wadah media. Kemudian disterilkan
pada suhu 121oC selama 15 menit. Bagikan dalam cawan petri steril secara aseptic
di Laminar Air Flow sebanyak 20-25 ml (ketebalan media 4 mm), beri nama
media dan tanggal pembuatan. Biarkan beku lalu disterilkan dalam autoclave
dengan suhu kamar (25C), setelah beku disimpan di lemari es pada suhu 2-8C
dengan posisi cawan petri dibalik.
d. Pembuatan suspensi Shigella boydii
1) Sediakan 10 ml NaCl 0,9% steril di dalam tabung reaksi.
2) Suspensikan bakteri Shigella boydii dengan menggunakan jarum ose
dari biakan bakteri ke dalam NaCl 0,9% steril sampai kekeruhannya
sama dengan suspensi standar yaitu 0,5 Mc.Farland yang setara
dengan 106-8 cfu/ml.
e. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi N-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air
Ekstrak Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr)

53

Media Mueller Hinton Agar (MHA) dituangkan kedalam cawan petri

masing-masing 20 ml dan biarkan memadat sebagai lapisan dasar. Setelah itu
suspensi bakteri Shigella boydii ditorehkan pada media Mueller Hinton Agar
(MHA) secara merata dan biarkan mengering. Kemudian kertas cakram
dicelupkan ke dalam ekstrak umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.)
Merr) fraksi n-heksan, etil asetat dan air dengan berbagai konsentrasi (50% b/v,
25%b/v, 12,5 b/v, 6,25 b/v, 3,12% b/v, 1,56% b/v, 0,78% b/v) dan dikering
anginkan. Sebagai kontrol positif digunakan siprofloksasin dan sebagai kontrol
negatif digunakan n-heksan, etil asetat dan air. Kemudian seluruh cakram
diletakkan di atas permukaan agar sambil ditekan. Kemudian diinkubasi pada
suhu 37oC selama 24-48 jam, setelah itu dilakukan pengamatan dan pengukuran
diameter zona hambat Shigella boydii dengan menggunakan penggaris milimeter
dan tentukan fraksi yang mempunyai KHM terkecil.

7. Kromatografi Lapis Tipis

a. Pembuatan Cairan Pengelusi
Siapkan cairan pengelusi yang terdiri dari toluen-etil asetat (C7H8 : C4H8O2)
dengan perbandingan (9:1) kemudian masing-masing dicampurkan ke dalam
corong pisah.
b. Penyiapan Bejana Pengembang
1) Bersihkan chamber kemudian di lap dan dikeringkan di oven
2) Lapisi chamber dengan kertas saring yang kering (yang telah
dikeringkan di oven).

54

3) Isikan cairan pengelusi ke dalam chamber setinggi 2-3 cm tutup dan

biarkan sampai jenuh dengan cairan pengelusi.
4) Chamber siap digunakan.
c. Penyiapan Plat KLT
1) Aktifkan plat KLT di oven lalu digaris dengan pensil 2-3 cm dari tepi
atas dan tepi bawah. Pengaktifan plat dilakukan dengan cara
pemanasan dalam oven pada suhu 100C selama 1 jam (Purba, 2010).
2) Buat cuplikan dengan kadar 1-5% (di dalam cairan pengelusi yang
mudah menguap)
3) Totolkan cuplikan, dengan pipet kapiler dengan jarak 1-2 cm.
Usahakan jangan sampai melebar, dikipasi atau dengan bantuan Hair
4)
5)
6)
7)

Dryer
Masukkan ke dalam chamber, segera tutup.
Biarkan eluen naik sampai garis batas.
Amati dibawah lampu UV atau dengan pereaksi penampak noda.
Tentukan nilai RF (Retardian Factor).
RF = Jarak yang ditempuh substansi
Jarak yang ditempuh oleh pelarut

8. Uji Aktivitas Fraksi Aktif Dari Ekstrak Etanol Umbi Bawang Dayak
(Eleutherine palmifolia (L.) Merr) Menggunakan Uji Bioautografi
Media Mueller Hinton Agar (MHA) dituangkan ke dalam cawan petri
masing-masing 20 ml dan dibiarkan memadat sebagai lapisan dasar. Setelah itu
suspensi bakteri Shigella boydii ditorehkan pada media Mueller Hinton Agar
(MHA) secara merata dan biarkan mengering. Setelah media memadat, kemudian
noda dari fraksi teraktif yang ada di plat KLT dipotong dan dikering anginkan.
Kemudian plat KLT yang telah dipotong diletakkan di atas permukaan agar
sambil ditekan. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 - 48 jam.

55

Setelah itu dilakukan pengamatan dan pengukuran diameter zona hambat

Shigella boydii dengan menggunakan penggaris milimeter.

F. Variabel Penelitian
1. Konsentrasi ekstrak umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr)
fraksi n-heksan, etil asetat, air
2. Diameter zona hambat aktivitas antibakteri terhadap bakteri Shigella boydii
3. KHM aktivitas antibakteri terhadap bakteri Shigella boydii
4. Hasil kromatografi lapis tipis fraksi aktif umbi bawang Dayak (Eleutherine
palmifolia (L.) Merr)

G. Definisi Operasional
1. Konsentrasi
a. Definisi
: Fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, fraksi air dari ekstrak
umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L.) Merr)
yang dibuat dengan berbagai konsentrasi akan
menunjukkan daya hambat yang mempengaruhi
b. Alat Ukur
c. Cara Ukur

pertumbuhan bakteri Shigella boydii

: Alat ukur yang digunakan adalah menggunakan labu takar
: Cara ukur yang digunaan adalah Self asessment dengan
menghitung konsentrasi fraksi n-heksan, fraksi etil asetat,
fraksi air dari ekstrak umbi bawang Dayak (Eleutherine

d. Hasil Ukur

palmifolia (L.) Merr)

: Didapatkan berbagai konsentrasi 50% b/v, 25% b/v,
12,5% b/v, 6,25% b/v, 3,12% b/v, 1,56% b/v, 0,78%b/v

2. Diameter Zona Hambat

a. Definisi
: Diameter zona hambat yang terbentuk karena adanya
aktivitas antibakteri ekstrak umbi bawang Dayak
(Eleutherine palmifolia (L.) Merr) fraksi n-heksan, etil

56

asetat dan fraksi air yang diukur dari sisi sebelah kiri
sampai sisi sebelah kanan dan dari sisi atas sampai sisi
b. Alat Ukur

bawah zona bening dari kertas cakram.

: Alat ukur yang digunakan dalam penelitian ini adalah

c. Cara Ukur

penggaris millimeter atau jangka sorong.

: Cara ukur yang digunakan adalah self assessment
berdasarkan kategori kekuatan antibakteri.

d. Hasil Ukur
:
Ardiansyah dalam penelitian Darmawi dkk, 2013. mengemukakan bahwa
ketentuan kekuatan antibakteri sebagai berikut :
1) Jika zona hambat < 5 mm maka daerah hambatan termasuk kategori
lemah
2) Jika zona hambat 5-10 mm maka daerah hambatan termasuk kategori
sedang
3) Jika zona hambat 10-20 mm maka daerah hambatan termasuk kategori
kuat
4) Jika zona hambatan > 20 mm maka daerah hambatan termasuk
kategori sangat kuat

3. Kadar Hambat Minimum

a. Definisi
: Konsentrasi terendah dari ekstrak umbi bawang Dayak
(Eleutherine palmifolia (L.) Merr) yang masih dapat
b. Alat Ukur

menghambat pertumbuhan bakteri Shigella boydii

: Alat ukur yang digunakan dalam penelitian ini adalah
penggaris milimeter.

57

c. Cara Ukur

: Melihat konsentrasi terkecil yang masih mempunyai

d. Hasil Ukur

diameter hambat
: Konsentrasi terkecil yang masih mempunyai diameter

hambat dinyatakan sebagai KHM.

4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Aktif
a. Definisi
: Fraksi aktif yang diperoleh dengan cara menotolkan
b. Alat Ukur
c. Cara Ukur

sampel ekstrak ke plat KLT.

: Alat ukur yang digunakan adalah plat KLT
: Cara ukur yang digunakan adalah self assessment dengan

d. Hasil Ukur

melihat harga RF noda di plat KLT.

: Didapatkan beberapa noda profil KLT.

58

H. Kerangka Operasional
Umbi Bawang Dayak
(Eleutherine palmifolia (L.) Merr)
Maserasi Etanol 96 %
Maserat
Destilasi vakum

Ekstrak Kental Umbi Bawang Dayak

(Eleutherine palmifolia (L.) Merr)

Fraksinasi

Fraksi n-Heksan

Fraksi Air

Fraksi Etil Asetat

Hasil Fraksi n-Heksan

Hasil Fraksi Air

Hasil Fraksi Etil Asetat

Destilasi vakum

Ekstrak Kental Etil Asetat

Ekstrak Kental n-Heksan

Ekstrak Kental Air

Konsentrasi Ekstrak Bawang Dayak Dalam fraksi

Kontrol Positif

n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air (50%,

Siprofloxasin

25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%b/v)

Kontrol Negatif nHeksan, etil Asetat,

dan Air

Uji Mikrobiologi

Diameter Zona Hambat

KHM fraksi n-heksan,

fraksi n-heksan, fraksi etil

fraksi etil asetat, dan

asetat, dan fraksi air

fraksi air

Keterangan :

Fraksi Aktif

: Menuju
: Menghasilkan

KLT
Noda KLT

59

: Tidak Dilakukan

Uji Bioautografi

I. Cara Pengolahan dan Analisis Data

Cara pengolahan dan analisisDiameter
data Zona
padaHambat
penelitian ini yaitu dengan
menyajikan data dalam bentuk tabel yang dilakukan dengan cara melakukan
pengukuran diameter hambat antibakteri ektrak umbi bawang Dayak (Eleutherine
palmifolia (L.) Merr) fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air terhadap
bakteri Shigella boydii yang dibandingkan dengan kontrol positif dan kontrol
negatif kemudian menentukan nilai KHM (Kadar Hambat Minimum) dan
menentukan fraksi aktif dari ektrak umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifolia
(L.) Merr) terhadap bakteri Shigella boydii.