I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme
yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau
transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup
sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri.
Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri. Dalam taksonomi mikroba alat yang paling
ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan
anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang
relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara
struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung
lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang
menyebabkan penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan
spesies gram-positif Oleh karna itu, penting adanya pelaksanaan praktikum pengujian guna untuk
mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada bakteri yang bergram positif
dan gram negative, dengan cara pewarnaan gram dan uji KOH.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan mempelajari cara pewarnaan..
II. TINJAUAN PUSTAKA
Lebih dari 120 tahun yang lalu Hans Christian Gram menemukan metode diferensiasi yang paling
penting dalam bakteriologi yaitu pewarnaan gram.Sampai sekarang metode ini tidak banyak
berubah sejak 1884 walaupun telah dilakukan beberapa modifikasi untuk meningkatkan
efisiensi.Prosedur pewarnaan gram dinilai relatif sulit dalam prakteknya. Selain sukar memutuskan
warna ungu atau merah, cara ini juga membutuhkan banyak biaya, waktu, reagen harus diganti
secara berkala dan seringkali berantakan (Winarni, 2007).

Kekurangan ini disebabkan oleh adanya beberapa tahap yang membutuhkan perlakuan zat warna
dan reagen selama satu menit lalu dilakukan pembilasan yang mungkin dapat tumpah di meja.
Tahap krusial lain yang mungkin setiap orang berbeda adalah tahap dekolorisasi. Bisa saja
kelebihan penambahan etanol menghasilkan sifat gram yang berbeda antara lab satu dengan lab
yang lainnya.Kurang lebih 60 tahun yang lalu dikembangkan metode lain yang lebih simpel dan
cepat (tanpa menggunakan zat warna) untuk menentukan sifat gram dari suatu literatur di Jepang
(Syamsuri, 2007).
Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk mengobservasi bakteri maupun
kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi
(bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji
sifat morfologi mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji
sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji katalase
(Subandi, 2009).
Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri
apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek,
kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan
kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering
anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak
terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna
safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri
menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Michael,
2008).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu Gram positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur, sifat kimia,
dan fisik dinding sel bakteri. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, seorang ilmuwan
Denmark bernama Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Qiqi, 2008).
III. METODE PRAKTIKUM

A. Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Agroteknologi Unit Ilmu Hama dan Penyakit Tumbuhan
Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo. Pada hari Rabu, pukul 13.00 WITA selesai.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah lampu bunsen, tabung reaksi, kaca benda, jarum
ose, pipet dan tissue. Bahan yang digunakan adalah biakan murni, alkohol dan larutan KOH 3%.
C. Prosedur Praktikum
Prosedur praktikum kali ini adalah sebagai berikut: - Mengambil satu ose biakan bakteri Bacillus dan
mencampurkan dengan 2 tetes larutan KOH 3%, diatas gelas objek. - Mengaduk secara merata
dengan jarum ose, tarik jarum ose ke atas gelas objek dan amati pembentukan lendir. Jika terbentuk
lendir mengindikasikan bakteri Gram-negatif, jika tidak berlendir, mengindikasikan bakteri Grampositif. - Melakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolat isolat lainnya.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil

No
Kode Isolat
1
2
3
4
5
6

AGT A 2014
AGT B 2014
AGT C 2014
AGT D 2014
AGT 013
RALSONIA

Hasil Pengamatan
Uji KOH 3%
Reaksi Gram
Bakteri Gram
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Positif
Negatif

Keterangan
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Berlendir

B. Pembahasan
Untuk menentukan Gram suatu bakteri dapat dilakukan uji KOH, jikasuspensi (campuran bakteri
dengan KOH) menjadi berlendir maka dinyatakan sebagai gram negatif, jika tidak tampak seperti
lendir maka dinyatakan sebagai gram positif. Dalam praktikum, langkah-langkah yang dilakukan
untuk uji gram yaitu pertama-tama inokolum bakteri diambil mengunakan jarum ose dan letakan
pada tetesan larutan KOH 3%. Inokolum diaduk selama 5-10 detik dan kemudian jarum ose

diangkat ke atas dari tetesan tadi. Bila larutan KOH menjadi kental dan cairan mengikuti jarum ose
sampai 0,5-2 cm saat jarum ose diangkat, hal ini menunjukan bakteri yang diperiksa adalah gram
negatif, sebaliknya bila cairan tidak mengikuti jarum ose maka bakteri yang diperiksa gram positif.
Dari hasil praktikum uji Gram dengan KOH yang telah dilakukan dengan mengunakan isolate bakteri
AGT A 2014, AGT B 2014, AGT C 2014, AGT D 2014, AGT 013 dan RALSONIA, menunjukkan
reaksi gram yang positif, artinya semua isolate bakteri yang diuji dengan KOH 3% adalah bakteri
Gram-nagatif. Hal ini dikarenakan gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis
sedangkan gram negatif berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma.
KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram negatif pecah. Pecahnya sel
melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri.Molekul
DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket)
yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum ose. Pada umumnya jarang atau
tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan adanya lendir atau tidak meskipun beberapa kultur
bereaksi secara lambat. Namun jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya
akan salah. Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam.
Metode ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu.Dari uraian tersebut, dapat
dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memiliki hasil
yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan
tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:
1. Tidak dapat sekaligus mengecek morfologi selnya sehingga tidak dapat mengetahui adanya
kontaminan pada kultur yang tidak diketahui jenisnya. 2. Kultur (sel) yang digunakan lebih banyak
daripada pewarnaan gram. Hal ini akan menimbulkan masalah jika bakteri uji memiliki koloni tunggal
yang kecil dan adapula yang merekat dengan agar. 3. Tidak dapat mendeteksi gram variabel (telah
dijelaskan). - Lalu bagaimana bisa berlendir. Secara teoretis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal
dan lemak yang tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di
ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah.
Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel
bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat
berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum (Edwin,
2011).
V. PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan pengamatan dari praktikum kali ini, maka dapat disimpulkan, sebagai berikut: 1. Gram
memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram berlemak tebal dan berdinding
sel tipis yang berada di ruang periplasma. penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH
string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. 2. Isolate bakteri AGT A 2014, AGT B
2014, AGT C 2014, AGT D 2014, AGT 013 dan RALSONIA, menunjukkan reaksi gram yang positif,
artinya semua isolate bakteri yang diuji dengan KOH 3% adalah bakteri Gram-nagatif.
B. Saran
pada praktikum ini banyak prosedur yang harus dilakukan secara teliti dan tepat, sehingga
disarankan agar setiap perlakuan dilakukan sesuai rosedur dan aturan- aturan agar hasil
pengamatan sesuai dengan yang diharapkan.
DAFTAR PUSTAKA
Pelczar, M.J dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Ui-Press. Jakarta
Qiqi. 2008. Kumpulan Hasil-hasil Penelitian Mikroba. Pusat Penelitian Mahluk Hidup. Jakarta.
Subandi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press,Bandung. Syamsuri, Istamar. 2007.
Biologi untuk SMA kelas X Semester 1. Penerbit Erlangga : Malang. . Winarni, Endang Widi. 2007.
Biologi 3 Esis. Jakarta.