PEMBAHASAN

Praktikum kali ini yaitu melakukan isolasi DNA kromosom dari bakteri E.coli.
Tahapan isolasi DNA yang dilakukan yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding dan membran sel;
(3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5) Presipitasi. Prinsip isolasi DNA yaitu
presipitasi dan sentrifugasi. Teknik sentrifugasi dilakukan dengan menggunakan sentrifuse
dengan kecepatan yang dapat diatur, dimana pada isolasi DNA kromosom E.Coli
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 4 menit. Prinsip sentrifugasi ialah
memisahkan substansi berdasarkan berat molekulnya. Substansi yang memiliki berat molekul
rendah akan berada diatas atau mengapung atau terlarut dan substansi yang memiliki molekul
rendah akan mengendap.
Tahap awal dalam mengisolasi DNA kromosom dari bakteri E.Coli yaitu dengan
membiakan koloni tunggal bakteri E.coli diambil dari media LB padat lalu dibiakkan pada 5
ml media LB cair dan diinkubasi selama 18 jam dengan suhu 37 oC di shaker incubator.
Shaker incubator atau inkubator goyang berfungsi agar bakteri ter-aerasi dengan baik. Tahap
kedua isolasi DNA yaitu pemisahan DNA kromosom dan plasmid dengan cara sentrifugasi.
DNA kromosom akan mengendap atau berbentuk pelet sedangkan DNA plasmid akan terlarut.
1,5 ml biakan bakteri dimasukkan dalam mikrotube 1,5 ml lalu di sentrifugasi pada dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 4 menit. Hasil sentrifuse berupa supernatan dan pellet dimana
supernatan dibuang dan langkah ini dilakukan hingga biakan bakteri tak bersisa. Pelet yang
mengandung DNA kromosom kemudian dicuci dengan phospat buffer saline (PBS) sebanyak
1 ml sebanyak 3 kali pengulangan dan di sentrifuse lagi dengan kecepatan dan waktu yang
sama yaitu 12.000 rpm selama 4 menit dimana supernatan dibuang dan pelet disimpan dalam
freezer pada suhu -20oC selama 24 jam. Pencucian menggunakan PBS ini bertujuan untuk
mempertahankan pH protein atau osmolaritas sel. Tahap ke tiga yaitu pemecahan dinding sel
menggunakan metode lisis secara fisik, yaitu dengan metode freeze and thaw. Prinsip metode
ini yaitu isolasi DNA genom dilakukan dengan cara heat stock yaitu dengan membekukan
bakteri kemudian dipanaskan secara tiba-tiba sehingga diharapkan sel akan pecah dan DNA
genom akan lisis dari sel. Metode ini memiliki keuntungan yaitu lebih cepat, mudah dilakukan
dan DNA yang dihasilkan cukup baik. Pelet atau DNA kromosom yang sudah disimpan
selama 24 jam dalam freezer diekstraksi dengan mendidihkan pelet beku selama 4 menit
kemudian dilarutkan dengan 50 L aquabidest steril dan diresuspensikan dengan cara
micropipetting dan vortex. Suspense tersebut disentrifus selama 5 menit 4 oC 13.000 rpm.
Supernatant yang diperoleh dipindahkan dalam tabung mikrosenrifus yang baru. Supernatant
tersebut mengandung DNA kromosom dan disimpan -20oC hingga digunakan untuk analisis
selanjutnya. Tujuan ekstraksi yaitu agar didapat DNA dengan kemurnian yang tinggi.

DAPUS
Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta : Gramedia
Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. IPB.