JOURNAL READING

NFB activation in cutaneous lesions of leprosy

is associated with development of multibacillary
infection
Carlos G Wambier; Leandra Naira Z Ramalho; Marco Andrey C Frade

Pembimbing:
dr. Mia Sri Sumirat, Sp.KK

Disusun Oleh:
Hendra Rohmana
11711023

Kepaniteraan Klinik Ilmu Kulit dan Kelamin

Rumah Sakit dr. R. Goeteng Taroenadibrata Purbalingga
Fakultas Kedokteran
Universitas Islam Indonesia
2016
Journal of Inflammation Research

Aktivasi NFB pada lesi Kusta berkaitan dengan

perkembangan Infeksi Multibasiller
Carlos G Wambier1
Leandra Naira Z Ramalho 2
Marco Andrey C Frade1
Norma T Foss1
1
Division of Dermatology, Department of Internal Medicine, 2Department of
Pathology, Ribeiro Preto School of Medicine, University of So Paulo, Ribeiro
Preto, So Paulo, Brazil

Latar Belakang: Faktor transkripsi Faktor Nuklear kappa B (NFkB) memainkan peran
sentral dalam mengendalikan ekspresi gen yang terlibat dalam reaksi inflamasi, proliferasi,
dan kelangsungan hidup sel-sel manusia. Namun, evaluasi in situ dari aktivitas NFkB pada
Lepra sebelumnya belum selesai. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah
aktivitas NFkB berkorelasi dengan kerentanan atau ketahanan terhadap infeksi
Mycobacterium leprae pada biopsi dari lesi kulit 38 pasien dengan diagnosis klinis dan
laboratorium kusta.
Metode: Profil NFkB teraktivasi dievaluasi pada biopsi dari lesi kulit 38 pasien dengan
diagnosis klinis dan laboratorium kusta. NFkB teraktivasi dievaluasi dan dihitung oleh
histokimia Barat, dan indeks aktivasinya (kisaran, 0-4) dihitung sesuai dengan persentase
positif nuklear oleh histokimia tersebut. Indeks aktivasi > 1 dianggap mewakili aktivasi
NFkB.
Hasil: Lima belas pasien (39.5%) menunjukkan NFkB teraktivasi. Kusta multibasiller
dikaitkan dengan NFkB teraktivasi (54.5%, P = 0,028). Kusta borderline sangat terkait
dengan aktivasi NFkB (80%), dengan OR 32.7 (P = 0,016). Bentuk klinis ini ditandai dengan
peningkatan kerentanan terhadap M. leprae dan dengan ketidakstabilan imunologi. Aktivasi
NFkB tidak ditemukan dalam granuloma pada kusta tuberkuloid, yang merupakan pola reaksi
inflamasi yang efektif terhadap M. leprae.
Kesimpulan: Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi NFkB bisa mendukung kerentanan dan
ketidakstabilan imunologi terhadap infeksi M. leprae, berpotensi untuk stimulasi fagositosis
dan regulasi mekanisme apoptosis sel yang terinfeksi, menyebabkan proliferasi dari basil
intraseluler ini. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengevaluasi apakah penghambatan
aktivasi NFkB di kusta multibasiler bisa mendukung ketahanan dan respon efektif imun
granulomatosa.
Kata kunci: faktor transkripsi, Faktor Nuklear kappa B, immunomodulation, Mycobacterium
leprae, resistensi kusta, kusta kerentanan
Correspondence: Carlos G Wambier Division of Dermatology, Department of Internal
Medicine, Hospital of Clinics, Ribeiro Preto School of Medicine, University of So Paulo,
Avenue Bandeirantes 3900, 4th floor, Ribeiro Preto, So Paulo, Brazil, 14048-900Tel/Fax
+55 16 3602 2447Email cwambier@usp.br

Pendahuluan
Kusta adalah infeksi mikobakteri kronis yang disebabkan oleh Mycobacterium leprae
yang dapat menghasilkan infeksi terbatas atau disebarluaskan di kulit dan saraf perifer,
menyebabkan spektrum manifestasi klinis berdasarkan tingkat sel imun termediasi (CMI)
terhadap basil. Pada salah satu ujung spektrum adalah tuberkuloid kusta (TT), ditandai
dengan pertumbuhan terbatas patogen, dan CMI yang tinggi. Pada ujung spektrum adalah
kusta lepromatosa (LL), ditandai dengan penyebarluasan basil, ketidakadaan CMI terlihat
mencolok, dan respon imun humoral dominan terhadap M. leprae. Antara dua bentuk polar
ini, ada kelompok borderline, yang dapat dibagi menjadi tiga kelompok sesuai dengan respon
CMI: borderline tuberkuloid (BT), borderline (BB), dan lepromatous borderline (BL).1,2
Aspek imunologi dari kusta telah diteliti secara luas, tetapi faktor-faktor yang
memfasilitasi atau merusak CMI dalam manifestasi puncak dari penyakit ini masih belum
sepenuhnya dipahami. Hal ini diketahui bahwa kelompok faktor transkripsi bernama Faktor
Nuklear kappa B (NFkB) mengontrol respon inflamasi global dengan memainkan peran
sentral dalam modulasi reaktivitas inflamasi. Pada sel yang istirahat, subunit NFkB tidak
teraktivasi di sitosol.3 Suatu sinyal sitokin, Faktor Nekrosis Tumor- alpha (TNFa), atau stres
lingkungan, NFkB teraktivasi dipicu untuk memodulasi reaktivitas inflamasi. 4 NFkB juga
bertindak sebagai faktor ketahanan penting bagi sel manusia, dengan mencegah apoptosis
yang diinduksi oleh TNFa. Efek anti-apoptosis ini dimediasi melalui transkripsi protein anti-
apoptosis tergantung-NFkB, seperti faktor TNFa reseptor-terkait 1 dan faktor 2 (TRAF-1 dan
TRAF-2) dan inhibitor selular apoptosis protein 1.5,6 Meskipun M. leprae mungkin
menginduksi apoptosis dari sel Schwann melalui reseptor Toll-like 2,7 kontak dari M.
Leprae yang memadai dalam sel Schwann juga telah terbukti menyebabkan kelangsungan
hidup sel-sel ini, bukannya apoptosis,8 yang bisa dikaitkan dengan mekanisme anti-apoptosis
tergantung-NFkB.
Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari pasien kusta multibasiller (MB) dan
donor darah yang sehat yang terkena M. leprae tidak aktif menginduksi translokasi nuklear
dari NFkB (p65 / p50 dan p50 / p50 dimer) pada kedua kelompok. Aktivasi seperti itu
dianggap penting untuk produksi TNFa oleh kultur in vitro dari PBMC dari kedua pasien dan
kontrol sehat.9 Dalam kultur in vitro sediaan PBMC dari donor yang sehat menunjukkan
tingkat yang lebih rendah dari aktivasi NFkB (p65) bila terkena M. leprae daripada ketika
terkena basil Calmette-Guerin, menunjukkan kemungkinan defisit sinyal NFkB dalam
merespon M. leprae.10
Penelitian in situ aktivasi NFkB bisa menjelaskan perannya dalam patofisiologi
manifestasi kulit kusta. Hal ini dapat dihipotesiskan bahwa manifestasi kulit pada ujung-
ujung spektrum kusta dapat dikaitkan dengan aktivitas NFkB. Misalnya, selama
perkembangan lesi TT, sinyal NFkB yang disebabkan oleh TNFa bisa menjadi salah satu
faktor yang mendukung efektivitas reaksi inflamasi dan kerusakan basil lengkap oleh CMI.
Di sisi lain, selama perkembangan lesi LL, aktivitas anti-apoptosis NFkB dapat
memungkinkan aktivitas parasit intraseluler dan penggandaan basil. Tujuan dari penelitian ini
adalah untuk menentukan apakah aktivitas NFkB berkorelasi dengan kerentanan atau
ketahanan terhadap infeksi M. leprae pada biopsi dari lesi kulit 38 pasien dengan diagnosis
klinis dan laboratorium kusta.

Bahan dan metode

Penelitian ini menggunakan spesimen biopsi kulit yang telah diarsipkan sebelumnya
dalam larutan formalin dan ditanam dalam parafin, dan data dari rekam medik pasien kusta
diikuti di Klinik Rawat Jalan Kusta dari Pusat Referensi Nasional Sanitasi Dermatology
dengan Penekanan pada Kusta dari Klinik Rumah Sakit di Fakultas Kedokteran Ribeiro
Preto, Universitas Sao Paulo. Selama rutin kontrol di klinik rawat jalan, semua pasien
diklasifikasikan menurut spektrum Ridley-Jopling (TT, BT, BB, BL, dan LL) dan oleh
Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) klasifikasi operasional (MB, lebih dari lima lesi kulit,
dan kusta pausibasiller (PB), hingga lima lesi kulit).
Komite etik di Klinik Rumah Sakit, Fakultas Kedokteran Ribeiro Preto, Universitas
Sao Paulo, menyetujui penelitian ini dengan nomor persetujuan 2763/2011. Pasien juga tidak
diharuskan untuk memberikan persetujuan tertulis sebagai data dianalisis tanpa nama; catatan
informasi medis, semua sampel (termasuk biopsi), dan hasil tes sebelumnya dikumpulkan dan
tidak diperoleh secara khusus untuk penelitian ini.
Para pasien yang dimasukkan dalam penelitian ini memiliki diagnosis klinis kusta dan
memiliki biopsi kulit pada saat dilakukan diagnosis, dengan klasifikasi kusta yang memadai
oleh Ridley-Jopling spektrum (TT, BT, BB, BL, dan LL). Data epidemiologis dan klinis
diperoleh dari catatan medis pasien, termasuk klasifikasi dengan kriteria Ridley-Jopling,
klasifikasi operasional WHO, komorbiditas, dan penggunaan alkohol, tembakau, dan obat-
obatan. Kriteria seleksi yang didasarkan pada semua pasien yang biopsi pertama oleh Klinik
Rawat Jalan Kusta dilakukan antara tahun 2006 dan 2010.
Pasien dikeluarkan dari penelitian jika catatan medis menunjukkan: penggunaan obat
anti-inflamasi non-steroid atau kortikosteroid 14 hari sebelum tanggal biopsi; reaksi kusta di
perjalanan penyakit; penyakit radang; erupsi obat dalam 3 bulan terakhir; dosis yang lebih
tinggi dari pada terapi multidrug standar untuk pengobatan kusta atau pengobatan lengkap
sebelumnya; komorbiditas parah atau keadaan mengancam jiwa dalam 6 bulan terakhir;
pasien hamil atau menyusui; dan penyakit kronis yang mungkin mengganggu mekanisme
inflamasi seperti diabetes mellitus, lymphedema, penyakit ginjal kronis, gagal jantung kronis,
merokok, alkohol, dan kekurangan gizi. Sebanyak 24 pasien awalnya terpilih dikeluarkan dari
studi berdasarkan pada satu atau lebih kriteria eksklusi ini, (sembilan BB, enam BL, lima LL,
dua BT, dan dua TT). Bentuk klinis diluar spektrum khas kusta seperti kusta tak tentu dan
kusta saraf murni juga tidak dimasukkan dalam penelitian ini.
Biopsi kulit dilakukan dengan biopsi tekanan sekali pakai ke kulit (diameter 4 mm)
setelah dianestesi lokal (lidokain 2% ditambah epinephrine tartrat 1: 200.000 IU). Semua
spesimen yang ada difiksasi formalin dan tertanam di parafin. Pemeriksaan histopatologi
dengan standar pewarnaan hematoxylineosin, dan teknik pewarnaan Fite-Faraco digunakan
untuk mendeteksi basil M. leprae.
Hasil biopsi menjalani pemeriksaan histokimia Barat untuk dideteksi keberadaan dan
distribusi aktivitas DNA-pengikat dari NFkB. Persiapan jaringan kulit untuk deteksi non-
radioaktif NFkB teraktivasi di dalam parafin dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya, 11
menggunakan pelabelan digoksigenin dan deteksi kits (Roche Applied Science, Indianapolis,
IN, USA). Sintetis DNA (Imprint Genetics Corporation, Hialeah, FL, USA), yang berisi
urutan NFkB, digunakan sebagai probe. Setelah anil dengan urutan komplementer, DNA
Probe 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 'diberi label dengan digoksigenin. Bagian
tersebut kemudian diinkubasi dengan probe berlabel selama 12 jam pada suhu 37 C. Mereka
kemudian diinkubasi dengan antibodi anti-digoksigenin terkonjugasi dengan alkaline
phosphatase dan dideteksi menggunakan tetrazolium nitro-biru dan solusi 5-bromo-4-chloro-
3-indolylphosphate. 5'-AGTTGAGGCTCCTTTCCCAGGC-3 '(bentuk mutan dari probe)
digunakan sebagai kontrol negatif. Hanya sel yang menunjukkan homogen yang berbeda
pewarnaan nukleir ungu dianggap positif. Jumlah inti sel NFkB-positif diperkirakan
persentase dalam sepuluh bidang daya tinggi yang dipilih secara acak (400 ) di masing-
masing sampel, yang nilai rata-ratanya dihitung. Indeks aktivasi NFkB (kisaran, 0-4)
ditetapkan untuk mengukur persentase positif akhir, yaitu, "0" ketika 0% dari inti yang
positif, "1" ketika 1% -10% dari inti yang positif, "2" ketika 11% -25% dari inti yang positif,
"3" ketika 26% -50% dari inti yang positif, dan "4" ketika >50% dari inti yang positif, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 1. Kriteria untuk NFkB teraktivasi adalah kehadiran indeks
aktivasi >1 (yaitu, indeks aktivasi 2, 3, dan 4). Pewarnaan Hematoxylin-eosin tidak dilakukan
dengan teknik ini; Oleh karena itu, pewarnaan violet hanya menunjukkan inti dengan NFkB
teraktivasi. Ahli patologi yang mencetak indeks NFkB dibutakan mengenai klasifikasi kusta
sebelumnya dari subjek.
Di antara 38 pasien yang dipilih, usia rata-rata adalah 47.4 21,2 tahun, dan 22
(57.9%) adalah laki-laki. Dua puluh dua pasien (57.9%) diklasifikasikan sebagai MB: lima
memiliki BB (13.1%), delapan memiliki BL (21.1%), dan sembilan memiliki LL (23.7%).
Enam belas pasien (42.1%) diklasifikasikan sebagai PB: tujuh memiliki TT (18.4%), dan
sembilan memiliki BT (23.7%).
Fisher test digunakan untuk mengevaluasi signifikansi hubungan antara kategori
variabel. Regresi logistik digunakan untuk menentukan kekuatan hubungan (odds rasio [OR])
antara aktivasi NFkB dan klasifikasi klinis kusta, disesuaikan dengan usia dan jenis kelamin.
Nilai P <0.05 dianggap signifikan secara statistik. Analisis statistik dilakukan dengan
menggunakan software STATA 12 (StataCorp LP College Station, TX, USA).

Hasil
Indeks aktivasi NFkB rata-rata adalah 1 (kisaran, 0-4). NFkB teraktifasi (indeks
aktivasi >1) pada 15 lesi kulit (39.5%), dengan indeks aktivasi 4, 3 dan 2 masing-masing
dalam satu, lima, dan sembilan pasien. Dalam 23 lesi yang tersisa (60.5%) NFkB tidak
teraktifasi, dengan indeks aktivasi 1 dan 0 di masing-masing 22 dan tujuh pasien. Keberadaan
NFkB teraktivasi di lesi kulit yang bervariasi sesuai dengan bentuk klinis kusta. Lesi TT
memiliki 0% NFkB teraktivasi, BT memiliki 33% NFkB teraktivasi, BB memiliki 80% NFkB
teraktivasi, BL memiliki 50% NFkB teraktivasi, dan LL memiliki 44% NFkB teraktivasi.
Indeks NFkB teraktivasi lebih tinggi pada pasien MB (median = 2; kisaran, 0-4),
dibandingkan pada pasien PB (median = 1; kisaran, 0-2), dengan frekuensi yang lebih tinggi
dari NFkB teraktivasi pada pasien MB (54.5%) dibandingkan pada pasien PB (18.8%; P =
0.028), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Ketiga pasien PB dengan NFkB teraktivasi
memiliki bentuk klinis BT. TT dikaitkan dengan tidak adanya aktivasi NFkB (P = 0,019),
dengan indeks aktivasi dari 1 pada enam pasien dan 0 pada satu pasien. BB kusta memiliki
frekuensi tertinggi NFkB diaktifkan (80%), dengan OR 32.7 (P = 0.016; Tabel 2), dan indeks
aktivasi 4 pada satu pasien (indeks aktivasi tertinggi pada penelitian ini), 3 di salah satu
pasien, 2 dalam dua pasien, dan 1 pada satu pasien (Tabel 3).

Diskusi
Berdasarkan data dari penelitian ini, pasien dengan reaktivitas imun yang paling
efektif terhadap basil M. leprae (TT) memiliki NFkB yang paling aktif, dengan 0% NFkB
aktif. BT memiliki frekuensi rendah dari NFkB teraktivasi sebesar 33.3%. Temuan ini
mungkin menggambarkan profil inflamasi yang rendah pada reaksi granulomatosa kronis dan
stabil, yang berhubungan dengan kerusakan basil sebelumnya dan antigen mikobakteri yang
kurang efisien. Di sisi lain, bentuk klinis dengan ketidakstabilan imunologi memiliki
frekuensi yang lebih tinggi dari NFkB teraktivasi : BB (80%), dan BL (50%). Perlu dicatat
bahwa dalam MB, bentuk-bentuk yang biasanya hadir dengan peningkatan atau penurunan
reaksi kusta (BB dan BL) memiliki lebih banyak sel dengan NFkB teraktivasi dari LL
(44,4%). Demikian juga, dalam PB bentuk yang lebih tidak stabil dan resiko reaksi kusta
diperlihatkan dengan peningkatan NFkB teraktifasi BT (33,3%), sedangkan TT, yang
merupakan bentuk paling stabil disajikan dengan aktifasi nol (0%).
MB menunjukkan frekuensi yang lebih tinggi dari NFkB teraktifasi daripada PB (P =
0.028), menunjukkan kemungkinan peran antigen bacillary dalam proses modulasi, yang
dapat diaktifkan melalui reseptor Toll-like, sitokin modulasi, dan/atau produk mikobakteri
intraselular. NFkB teraktivasi juga mengatur fisiologi saraf dengan modulasi plastisitas
sinaptik dan dengan mengatur pertumbuhan dendrit,12 menunjukkan bahwa pasien MB
mungkin memiliki aktivitas yang lebih tinggi dalam perbaikan atau mekanisme adaptif
terhadap kerusakan yang disebabkan oleh respon inflamasi, atau aktivitas intraseluler basil
M. leprae.
TNFa juga dapat memicu regulasi protein anti-apoptosis tergantung-NFkB.5 NFkB
teraktivasi dapat menghambat jalur apoptosis dan menstimulasi proliferasi sel,
memungkinkan kelangsungan hidup sel yang cukup untuk menjadi tempat proses duplikasi
mikobakteria ini secara perlahan. Aktivasi NFkB dan kaitannya modulasi transkripsi yang
mungkin salah satu dari berbagai mekanisme adaptif basiler untuk memungkinkan infeksi
kronis, yang mungkin dalam hasil akhir berupa kekebalan inang yang kurang efektif. Sebagai
contoh, jika status inflamasi dimediasi oleh NFkB di kusta MB tidak cukup efisien untuk
menghancurkan M. leprae, ini bahkan bisa merangsang fagositosis dan infeksi intraseluler,
mirip dengan apa yang telah dilaporkan dengan Trypanosoma cruzi,13 di mana invasi
mikroorganisme dan kelangsungan hidup disukai oleh aktivasi NFkB yang diinduksi oleh
TNFa. Apoptosis telah terbukti lebih sering di PB daripada di MB, menunjukkan mekanisme
yang mungkin untuk mengandung multiplikasi basiler. 14,15
Meskipun usia >60 tahun dikaitkan dengan aktivasi NFkB (66.7%, P = 0.025; Tabel
1), itu bukan merupakan faktor risiko tunggal dengan analisis regresi logistik (OR = 1.2, P =
0,905; Tabel 2). Tujuh puluh lima persen dari pasien yang lebih tua menunjukkan kusta MB,
dan juga mayoritas pasien LL (55,6%) berusia >60 tahun.
Penelitian ini mengulas pasien yang dirawat di pusat rujukan kusta antara tahun 2006-
2010 dan diikuti kriteria eksklusi yang ketat, sehingga oleh karena itu dibatasi oleh ukuran
sampel yang kecil. Namun, kami merasa bahwa ini temuan awal yang signifikan, dan penting
dalam memperoleh pemahaman yang lebih baik dari respon kekebalan yang bervariasi pada
penderita kusta, dan kami berharap bahwa penelitian ini akan merangsang penelitian serupa
dengan ukuran sampel yang lebih besar.

Kesimpulan
Studi kami menunjukkan bahwa aktivasi NFkB berhubungan dengan peningkatan
kerentanan terhadap infeksi M. leprae, serta ketidakstabilan imunologi. Hasil menunjukkan
peningkatan aktivasi NFkB pada lesi kulit MB dan BB pasien, berbeda dengan aktivasi yang
sedikit di lesi kulit PB, dengan tidak ada aktivasi di TT. Penelitian selanjutnya diperlukan
untuk menganalisis peran NFkB dalam reaksi inflamasi kusta akut, aktivasi setelah terapi
multidrug, dan kemungkinan inhibisi NFkB untuk mendukung perlawanan dan respon efektif
imun granulomatosa terhadap basil.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis berterima kasih kepada Mark A Cappel, MD, Departemen Kulit, Klinik
Mayo, Jacksonville, Florida, atas bantuannya dengan revisi bahasa Inggris. Para penulis juga
berterima kasih kepada Nona Auristella de Melo Martins untuk bantuan laboratoriumnya
yang sangat baik. Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih FAEPA (Fundacao de Apoio
ao Ensino, Pesquisa e Assistncia, Rumah Sakit Klinik, Fakultas Kedokteran Ribeiro Preto,
Universitas So Paulo) untuk pendanaan dan dukungan.

Pemberitahuan
Para penulis melaporkan tidak ada konflik kepentingan yang terkait dengan pekerjaan ini.