17

BAB III

METODE PENELITIAN

Pada bab ini diuraikan tentang rancangan penelitian, waktu dan tempat penelitian,

alat & bahan, serta prosedur kerja, dan metode analisis data.

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental di laboratorium. Penelitian ini

bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif dari biji pepaya

yang berpotensi sebagai inhibitor lipase. Penelitian ini terdiri dari 2 tahap yaitu: 1)

isolasi senyawa flavonoid dan 2) identifikasi senyawa flavonoid. Isolasi senyawa

flavonoid dilakukan dengan: preparasi sampel, ekstraksi dengan metode maserasi

menggunakan pelarut aquadest, uji aktivitas inhibisi lipase serta analisis

kromatografi lapis tipis. Identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan cara: uji

fitokimia dan analisis menggunakan spektrometer GC/LC-MS.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Kimia Penelitian Kimia

MIPA Universitas Negeri Malang.

3.3 Alat dan Bahan Penelitian

3.3.1 Alat Penelitian

Penelitian ini menggunakan alat meliputi neraca analitik dengan ketelitian

0,01, peralatan kromatografi lapis tipis (KLT), ayakan 50 mesh, Erlenmeyer, gelas

17
 18

beaker, spatula, kaca arloji, pengaduk kaca, corong kaca, pipet tetes, pipet volume,

gelas ukur, waterbath, labu ukur, statif, kertas saring, indikator universal,

aluminium foil, tabung reaksi, magnetic strirer (Thermo Scientific), rotary

evaporator, dan GC/LC-MS.

3.3.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini merupakan bahan berlabel p.a.

(proanalyze), meliputi: biji pepaya, aquades, buffer fosfat pH 7,5 (dibuat dengan

mencampurkan 16 mL larutan NaH2PO4 dan 84 mL larutan Na2 HPO4), larutan

H2SO4 pekat, larutan NaOH 0,1 N, indikator pp, CHCl3, HCl pekat, plat

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254, Vitazym (Kalbe Farma) sebagai sumber

enzim lipase, minyak zaitun, Orlistat (Xenical), gum arabik, serbuk Magnesium,

NaCl, CaCl2.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Preparasi Sampel

Biji pepaya segar didapatkan dari pepaya varietas bangkok. Biji pepaya

segar dicuci dengan air dan dikeringkan dengan cara di jemur dibawah sinar

matahari. Kemudian biji pepaya yang telah dijemur disangrai sampai beratnya

konstan. Biji pepaya yang telah kering lalu dihaluskan dengan cara diblender.

Serbuk yang didapatkan ditempatkan di dalam gelas beaker dan ditutup rapat

dengan menggunakan plastik wrap.

3.4.2 Ekstraksi dan Uji Inhibisi

18
 19

Sebanyak 85 gram serbuk biji pepaya dimaserasi dengan pelarut aquadest

dengan alokasi waktu 3x24 jam disertai pengadukan dengan menggunakan

magnetic stirer. Disaring, filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator dengan

suhu 50C untuk mendapatkan ekstrak kental biji pepaya kemudian diuji secara

fitokimia dengan uji flavonoid dan diuji inhibisinya terhadap lipase pankreas.

3.4.3 Uji Flavonoid

Sebanyak 1,4 gram ekstrak kental air biji pepaya dilarutkan dalam 10 mL

metanol kemudian dibagi ke dalam empat tabung reaksi. Tabung pertama

digunakan seagai tabung kontrol, tabung kedua, ketiga, dan keempat berturut-turut

ditambahkan NaOH, H2SO4 pekat, dan serbuk Mg-HCl pekat. Warna pada

masing-masing tabung dibandingkan dengan tabung kontrol.

3.4.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak kental biji pepaya yang diperoleh dianalisis dengan kromatografi

lapis tipis (KLT). Pelat KLT dipotong dengan ukuran panjang 6,6 cm dan lebar 2

cm. Pada bagian atas dan bawah diberi tanda batas, batas atas 0,25 cm dan batas

bawah 1 cm. Analisis KLT dilakukan dengan cara menotolkan sampel pada pelat

KLT menggunakan pipa kapiler kemudian dimasukkan ke dalam bejana KLT

(chamber) yang berisi eluen. Proses KLT berakhir ketika eluen telah mencapai

batas atas. Selanjutnya pelat KLT diamati di bawah lampu UV untuk mengetahui

adanya noda yang tampak pada pelat KLT. Noda yang tampak diberi tanda

kemudian dihitung faktor retensinya (Rf). Bercak atau noda yang menunjukkan

19
 20

golongan flavonoid dari Rf dan warna bercak dipilih untuk diisolasi kemudian

diuji aktivitas sebagai inhibitor lipase.

3.4.5 Identifikasi Senyawa Flavonoid Menggunakan GC/LC-MS

Untuk mengetahui struktur senyawa flavonoid yang bertindak sebagai

inibitor lipase, dilakukan identifikasi dengan menggunakan GC/LC-MS. Hasil

yang diperoleh berupa spektrum lalu dicocokan dengan senyawa yang telah ada di

library pada spektrometer massa.

3.4.6 Uji Aktivitas Lipase Pankreas dan Inhibisi Lipase Pankreas

Pengujian aktivitas lipase dimulai dengan membuat substrat minyak dan

substrat kontrol. Substrat minyak dibuat dengan cara 2,5 mL minyak zaitun+ 22,5

mL larutan gum arabik 10 % dihomogenkan selama t=10 menit, ditambah 20 mL

H2O, 15 mL CaCl2 0,075 M, dan 10 mL NaCl 3M kemudian dihomogenkan

kembali, dan dimasukkan dalam labu ukur 100 mL serta ditambah aquades hingga

tanda batas. Sedangkan substrat kontrol dengan mengganti 2,5 ml minyak zaitun

menggunakan air 2,5 ml.

a. Uji Aktivitas Lipase Pankreas

Pengujian aktivitas lipase dengan cara diambil 25 mL substrat minyak dan

ditempatkan dalam Erlenmeyer. Kondisi pH substrat diatur dengan buffer fosfat

sampai pH 7,40 tablet. Vitazym (sumber lipase pankreas) yang telah dihaluskan

ditambahkan ke dalam substrat, kemudian dikocok selama 30 detik. Campuran

diinkubasi pada T= 37C selama 25 menit. Hidrolisis substrat oleh enzim lipase

20
 21

dihentikan dengan memanaskan Erlenmeyer ke dalam penangas air mendidih

selama 10 menit. Campuran substrat-enzim ditambah 3 tetes indikator pp

kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah muda (pink).

Langkah yang sama dilakukan terhadap substrat kontrol (air).

b. Uji Inhibisi Orlistat terhadap Lipase Pankreas

Pengujian aktivitas lipase dengan cara diambil 25 mL substrat minyak dan

ditempatkan dalam Erlenmeyer. Kondisi pH substrat diatur dengan buffer fosfat

sampai pH 7,5. Serbuk dari 1 kapsul Orlistat dimasukkan ke dalam larutan

campuran, selanjutnya 1 tablet Vitazym (sumber lipase) yang telah dihaluskan

ditambahkan ke dalam substrat, kemudian dikocok selama 30 detik. Campuran

diinkubasi pada T= 37C selama 25 menit. Hidrolisis substrat oleh enzim lipase

dihentikan dengan memanaskan Erlenmeyer ke dalam penangas air mendidih

selama 10 menit. Campuran substrat-enzim ditambah 3 tetes indikator pp

kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah muda (pink).

Langkah yang sama dilakukan terhadap substrat kontrol (air).

c. Uji Inhibisi Sari, Serbuk, Ekstrak Kental, dan Flavonoid Hasil KLT

Pengujian aktivitas lipase dengan cara diambil 25 mL substrat minyak dan

ditempatkan dalam Erlenmeyer. Kondisi pH substrat diatur dengan buffer fosfat

sampai pH 7,5. Sari, serbuk, ekstrak air, ekstrak kental dari 50 g biji pepaya atau

hasil KLT dimasukkan dalam larutan campuran, selanjutnya 1 tablet Vitazym

(sumber lipase) yang telah dihaluskan ditambahkan ke dalam substrat, kemudian

dikocok selama 30 detik. Campuran diinkubasi pada T= 37C selama 25 menit.

21
 22

Hidrolisis substrat oleh enzim lipase dihentikan dengan memanaskan Erlenmeyer

ke dalam penangas air selama 10 menit. Campuran substrat- enzim ditambah 3

tetes indikator pp kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Langkah sama

dilakukan terhadap substrat kontrol (air).

d. Perhitungan Analisis Data

Aktivitas enzim dengan metode titirimetri, daya inhibisi dari sampel biji

pepaya dan Orlistat dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

( VmtVa ) x N x 1000
Aktivitas lipase tanpa inhibitor=
Vs x 25 menit

( Vmd Va ) x N x 1000
Aktivitas lipase denganinhibitor=
Vs x 25 menit

Keterangan :

Va = Volume titran NaOH dengan substrat air

Vmt = Volume titran NaOH dengan substrat minyak tanpa inhibitor

Vmd = Volume titran NaOH dengan substrat minyak dengan inhibitor

Aktivitas lipase tanpainhibitor Aktivitas lipase dengan inhibitor

Dayainhibisi sampel= x 100
aktivitas lipase tanpainhibitor

daya inhibisi sa mpel

Dayainhibisi terhadapOrlistat= x 100
daya inhibisi Orlistat

22