BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kemajuan dibidang teknologi saat ini sudah berkembang sangat pesat,

banyak penemuan baru tentang biologi molekular, diantaranya yaitu adanya
sistem kloning. Sistem kloning itu sendiri merupakan suatu proses
menghasilkan individu-individu dari jenis yang sama identik secara genetik.
Pada hewan atau tumbuhan tertentu pengkloningan terbentuk secara alami
yaitu kebiasaan proses hewan atau tumbuhan bereproduksi aseksual.
Sedangkan dalam bioteknologi, kloning merujuk pada berbagai usaha yang
dilakukan manusia untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau gen, sel atau
organisme.
Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan tersebut, muncullah ilmu
yang mempelajari mengenai pembentukan kombinasi materi genetik yang
baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan dalam
suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang yang dikenal sebagai
teknologi DNA rekombinan atau biasa disebut rekayasa genetika. Teknologi
ini memungkinkannya diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam
waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara
konvensional serta memadukan sifat dari dua jenis organisme yang berbeda
(organisme transgenik) dan lain-lain.
Untuk lebih jelas mengenai DNA rekombinan, akan di bahas pada
pembahasan makalah ini.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan
permasalahan sebagai berikut:
1. Apakah yang dimaksud DNA rekombinan?
2. Apakah yang dimaksud teknologi DNA rekombinan?
3. Apakah yang dimaksud dengan vektor kloning dan vektor ekspresi?
4. Apakah yang dimaksud isolasi DNA?
5. Apakah manfaat Teknologi DNA Rekombinan?
1.3 Tujuan
Tujuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut:
 1. Untuk mengetahui pengertian dari DNA rekombinan.
2. Untuk mengetahui pengertian dari teknologi DNA rekombinan.
3. Untuk mengetahui pengertian dari vektor kloning dan vektor ekspresi.
4. Untuk mengetahui isolasi DNA.
5. Untuk mengetahui teknologi DNA rekombinan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi DNA Rekombinan

Menurut Cohen dan Boyer (1980) DNA rekombinan (rDNA) adalah
bentuk DNA buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih
sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama. Dalam hal
modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang
relevan ke dalam DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk
kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti
resistensi antibiotik.
Robert (2009) mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA
yang mengalami perubahan karena penyisipan suatu sekuens
 deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul DNA yang
sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. Rekayasa genetika adalah
serangkaian teknik untuk memodifikasi dan merekomendasi gen dari berbagai
organisme yang berbeda yang juga disebut teknologi DNA rekombinan.
Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau
dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya
perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya
sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah
diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan.
Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan
bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi
genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel
inang. Rekayasa genetika dapat memberikan hasil yang sangat
menguntungkan. Sebagai contoh pasien yang menderita diabetes tidak
mampu membentuk dengan insulin manusia.

2.2 Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik kejuruteraan genetik
yang melibatkan penggunaan DNA rekombinan, yaitu DNA yang
menggabungkan maklumat genetik dua species organisme yang berlainan.
Jika gen-gen ini digabungkan dalam sel telur atau sel sperma supaya
maklumat genetik ini boleh diturunkan kepada progeni, maka hasil daripada
gabungan ini dinamakan organisme transgenik.
Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika merupakan suatu
metode yang dilakukan untuk memanipulasi DNA suatu makhluk hidup
tertentu guna memperoleh sifat-sifat tertentu dalam organisme tersebut. Pada
umumnya dalam teknologi DNA rekombinan, peneliti berusaha
menambahkan sifat-sifat unggul ke dalam suatu organisme, sehingga
diharapkan organisme yang menguntungkan kehidupan manusia.
 2.3 Vektor Kloning dan Vektor Ekspresi

A. Vektor kloning

Vektor kloning adalah agen pembawa fragmen DNA masuk ke dalam

sel makhluk hidup yang berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA.
Beberapa vektor kloning yang umum digunakan adalah plasmid, vektor
lamda, virus, kromosom bakteri buatan, kromosom khamir buatan, dan
cosmid. Suatu vektor kloning harus dapat disambungkan atau menyatu
dengan fragmen DNA yang ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke
dalam sel. Di dalam sel tersebut, fragmen DNA akan diperbanyak jumlahnya.
Untuk memilih vektor kloning yang cocok dalam penelitian, beberapa hal
yang harus dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA yang akan
ditransfer, jumlah salinan, inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka
pemilihan (selectable marker) untuk seleksi, situs kloning, dan fungsi khusus
dari suatu vektor.

B. Vektor Ekspresi

Vektor ekspresi adalah salah satu teknik yang digunakan untuk

mempelajari fungsi protein. Pada teknik ini, potongan DNA penyandi protein
yang diinginkan ditransplantasikan ke suatu plasmid (DNA sirkular yang
biasanya ditemukan pada bakteri; dalam teknik ini, plasmid disebut sebagai
vektor ekspresi). Plasmid yang telah mengandung potongan DNA yang
diinginkan tersebut kemudian dapat disisipkan ke dalam sel bakteri atau sel
hewan. Penyisipan DNA ke dalam sel bakteri disebut transformasi, dan dapat
dilakukan dengan berbagai metode, termasuk elektroporasi, mikroinjeksi dan
secara kimia. Penyisipan DNA ke dalam sel eukaryota, misalnya sel hewan,
disebut sebagai transfeksi, dan teknik transfeksi yang dapat dilakukan
 termasuk transfeksi kalsium fosfat, transfeksi liposom, dan dengan reagen
komersial. DNA dapat pula dimasukkan ke dalam sel dengan menggunakan
virus (disebut transduksi viral). Setelah penyisipan ke dalam sel, protein yang
disandi oleh potongan DNA tadi dapat diekspresikan oleh sel bersangkutan.

2.4 Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis
DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel,
yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan
langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran
inti, yang dilanjutkan dengan memisahkan DNA dari berbagai komponen sel
yang lainnya. Pada saat melakukannya DNA harus dijaga agar tidak rusak dan
didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.
Mekanisme DNA Rekombinan:
1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta
penghilangan dinding sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara
mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel telah
dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan
dengan menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti
triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang
diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan melakukan sentrifugasi
sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak serta organel target yang
pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan pemurnian
dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.
2. Retriksi
Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilaku
kan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi merupakan proses
pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang diinginkan
dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang
bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti
diketahui, di dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang
berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan
 dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul
DNA dikombinasikan).
Adadua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan en
zim restiksitipe II. Enzim restriksi tipe II mempunyai sifat-sifat umum
yang penting sebagai berikut:
a. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang bas
a di dalam molekul DNA.
b. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di
dekat tempat pengenalannya.
c. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan
urutan basa. Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen
DNA memiliki dua macam ujung yaitu:
a) Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pe
motongan pada kedua untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang
basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5
yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya tidak sama
panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung runcing akan mudah
disambungkan satu sama lain.
b) Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pad
a posisi yangsama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan m
empunyai ujung 5 yang tumpul karena masing- masing untai
tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung
tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan,
misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau
penambahan enzim deoksinukleotidil transferae.
3. Ligasi
Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA
dengan fragmen DNA lainnya. DNA ligase merupakan suatu enzim yang
berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan genetik dengan bahan
genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung
dengan DNA atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara
DNA atau RNA yang satu dengan lainnya.
Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim
Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan
fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen
 DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang
sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat
saling berkomplemen.
Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa
adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang
berperan sebagai gunting untuk memotong DNA pada situs spesifik dan
DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul
DNA.
Tahap selanjutnya adalah penyambungan molekul DNA. Ada tiga
cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara
in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri.
Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah di
infeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.
Ketiga yaitu pemberian enzim deoksi nukleoridil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Suhu optimum bagi
aktivitas DNA ligase sebenarnya 37oC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan
hydrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan
menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat
ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antar
4 dan 15oC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang di perpanjang (sering
kali hingga semalam).
4. Setelah tahap penyambungan molekul DNA, dilakukan analisis terhadap
hasil pemotongan DNA genomic dan DNA vector serta analisis hasil ligasi
molekul-molekul DNA tersebut menggunakan teknik elektroforesis. Jika
hasil elektroforesis menunjukan bahwa fragmen-fragmen DNA genomic
telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul
DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalamm sel
inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan campuran
reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformsi karena sel inang
diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki
molekul DNA rekombinan.
5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi
rekombinan. Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang
bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk
 memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan.
Selanjutnya, diantara sel-sel transforman yang membawa DNA
rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang
DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah
transformasi dilakukan, yaitu:
a. Sel inang tidak dimasuki DNA apapun atau berarti transformasi gagal.
b. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan
c. Sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan
atau gen yang diinginkan.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang di
inginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan
fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro
menggunakan teknik reaksi polimerasi berantai atau polymerase chain
reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat
dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni.
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui
tiga cara yaitu:
a. Transformasi: transfer DNA yang umumnya berasal dari satu sel bakteri
ke dalam sel yang berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri
pecah atau lisis maka DNA sirkular akan terlepas ke lingkungan. Efisiensi
transformasi bergantung pada kompetensi sel.
b. Konjugasi: merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara
langsung melalui kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan
diantara dua sel bakteri yang berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri
gram negatif.
c. Transduksi: transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya
dengan menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini
menggunakan prinsip dasar dari galur donor yang menyediakan DNA bagi
galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA lain DNA
ditransfer melalui perantaraan bakteriofag.
Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid Pemotongan DNA
plasmid, DNA asing, dan DNA rekombinan dilakukan menggunakan enzim
restriksi tertentu dengan kondisi tertentu. Enzim restriksi yang dipergunakan
adalah enzim HindIII untuk memotong DNA plasmid dan DNA asing. Hasil
pemotongan DNA dengan enzim restriksi diamati dengan elektroforesis gel
agarosa.
Ligasi DNA kromosom ke dalam DNA vector (pHB201). Ligasi
fragmen DNA asing ke dalam vector plasmid PHB201 dilakukan
menggunakan enzim T4 ligase. Hasil ligasi ini merupakan DNA plasmid
rekombinan yang siap untuk ditransformasikan ke dalam E coli JM 109.
Transformasi ke E.coli JM109 dengan DNA rekombinan. Terdapat dua
tahap penting dalam prosedur transformasi, yaitu penyiapan sel kompeten dan
pemasukkan DNA ke dalam sel inangnya. Pembuatan sel kompeten E.coli JM
109 dilakukan menurut metode Mendel dan Higa yang telah dimodifikasi.
Hasil transformasi ditandai dengan tumbuhnya koloni biru dan putih.
Koloni warna putih menandakan adanya vektor dengan DNA sisipan,
sedangkan koloni warna biru menandakan tidak terdapatnya DNA sisipan
pada vektor pHB201.
Adanya koloni biru dan putih disebabkan DNA sisipan dimasukkan
pada daerah pengkode gen lacZ. Gen lacZ tersebut merupakan daerah
pengkode enzim galaktosidase. Enzim ini dapat menguraikan senyawa mirip
laktosa yaitu X-gal, dan adanya IPTG sebagai penginduksi dihasilkan
senyawa galaktosa dan 5-bromo-4-kloroindigo yang berwarna biru. DNA
sisipan yang masuk pada daerah pengkode gen lacZ menyebabkan gen
tersebut akan rusak dan sebagai hasilnya tidak ada aktivitas enzim yang
dikode oleh gen lacZ. Enzim galaktosidase tidak diproduksi dankoloni warna
putih dihasilkan .
6. Seleksi hasil cloning
Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang
diinginkan dengan cara X-gal atau pemotongan dengan enzim restriksi.
Seleksi dengan X-gal dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasmid
rekombinan dengan komplementasi. Sedangkan pemotongan dengan enzim
restriksi dapat digunakan untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil
kloning. Hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dan memperlihatkan pita
fragmen DNA sisipan yang terpisah dari pita vektor kloning.
 Dalam tataran aplikasi, rentetan proses kloning dapat dilakukan
dengan mengikuti beberapa langkah berikut ini:
a. Mempersiapkan sel stem, yaitu sel awal yang akan tumbuh menjadi
berbagai sel tubuh. Sel ini diperoleh dari makhluk hidup yang hendak
dikloning.
b. Sel stem diambil inti selnya yang mengandung informasi genetik
kemudian dipisahkan dari sel.
c. Mempersiapkan sel telur, yaitu sebuah sel yang diambil dari makhluk
hidup dewasa kemudian intinya dipisahkan.
d. Inti sel dari sel stem diimplimentasikan ke sel telur.
e. Sel telur dipicu supaya terjadi pembelahan dan pertumbuhan. Setelah
membelah menjadi embrio.
f. Sel embrio yang terus membelah (blastosis) mulai memisahkan diri dan
siap diimplementasikan ke dalam rahim.
g. Embrio tumbuh dalam rahim menjadi janin dengan kode genetik persis
sama dengan sel stem donor.
2.5 Manfaat Teknologi DNA Rekombinan
Berbagai penelitian tentang DNA rekombinan banyak gunakan dan
dimanfaatkan dalam berbagai bidang, diantaranya :
1. Bidang industri

Penelitian rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat

dengan cepat. Berbagai usaha yang telah giat dilakukan misalnya :
a. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam langsung dari
dalam bumi
b. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia

Mencipatkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia

seperti etilen yang diperlukan untuk pembuatan plastic
2. Bidang Pertanian

Beberapa manfaat rekayasa genetika dalam bidang pertanian

diantaranya adalah:
a. Mengganti pemakaian pupuk nitrogen yang banyak dipergunakan tapi
mahal harganya, oleh fiksasi nitrogen secara alamiah. Bakteri tanah
Rhizobium sp dapat mengadakan infeksi ke dalam akar dari tanaman
family Leguminosae. Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan bakteri
 yang terdapat di dalamnya dapat mengikat zat lemas bebas dari udara
untuk di ubahnya menjadi nitrogen yang dapat diambil dan digunakan
oleh tanaman tersebut.
b. Teknik rekayasa genetika mengusahakan tanaman-tanaman (terutama
yang mempunyai arti ekonomi) yang tidak begitu pekah terhadap
penyakit yang disebabkan oleh bakteri, jamur dan cacing.
c. Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida
sendiri.

3. Bidang Peternakan
a. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas
yang dapat mematikan anak-anak babi
b. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan
mulut, yaitu penyakit ganas dan sangat menular pada sapi, domba,
kambing, rusa dan babi
4. Bidang Kedokteran

Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang

kedokteran yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yaitu pembuatan
insulin manusia oleh bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan penyakit
diabetes.