Penggunaan media padat selektif untuk menghitung lactobacilli di Cheddar

keju dijelaskan. Ini, telah terbukti berguna untuk tujuan ini, terutama pada periode awal
pematangan ketika banyak streptokokus membuat metode lain tidak praktis.
medium, dalam bentuk setengah padat, lebih sensitif untuk mendeteksi fermentasi hetero di
lactobacillus daripada media sebelumnya tersedia. Kemungkinan menggunakan
untuk menghitung lactobacillus heterofermentative dan Leuconostoc dibahas.

THELACTOBACILLI yang berkembang selama pematangan keju Cheddar telah

dianggap bertanggung jawab untuk produksi rasa khas (Hunter, 1950).
Dalam investigasi berkaitan dengan produksi rasa ini akan, oleh karena itu,
berguna jika pertumbuhan organisme ini bisa diikuti seluruh pematangan yang
periode.
Sampai sekarang satu-satunya metode yang tersedia adalah untuk pengenceran piring keju pada media
selektif (misalnya Yeastrel-glukosa agar) dan mengidentifikasi sampel yang representatif
koloni. Prosedur ini, selain menjadi membosankan, adalah praktis hanya ketika
lactobacilli relatif melimpah dan karena itu tidak dapat digunakan pada tahap awal
pematangan saat lactobacilli tersebut sangat kalah jumlah oleh streptokokus starter; sehingga tidak ada
informasi yang memadai tentang laju pertumbuhan lactobacilli
keju pada bulan pertama setelah menekan.
Media pertumbuhan selektif untuk silase lactobacilli telah dijelaskan oleh Keddie (1951)
dan untuk bakteri mulut dan feses oleh ROGOSA, Mitchell & Wiseman (1951). Saat ini
kertas melaporkan hasil yang diperoleh ketika media ROGOSA sedikit diubah adalah
digunakan untuk pencacahan lactobacilli di Cheddar cheese. Selain deskripsi
diberikan dari media, berdasarkan pada orang-orang dari Gibson & Abd-El-Malek (1945) dan
ROGOSA
et al. (1951), yang mungkin berguna dalam membuat perhitungan langsung dari heterofermentative
lactobacilli dalam keju.

BAHAN DAN METODE

Keju, kecuali dinyatakan lain, dibuat dari susu mentah di Institut
Dairy eksperimental.
Persiapan modi, fied menengah ROGOSA
modifikasi terdiri dalam penggunaan digest tryptic susu di tempat tryptic sebuah
kasein mencerna dan peningkatan konsentrasi akhir ofall bahan lainnya sebesar 10%.

Metode yang disukai persiapan adalah sebagai berikut.

larutan nutrisi. Hal ini dibuat dengan menambahkan 6,0 ml dari larutan yang mengandung
MgS0, .7H20, 11,5 g, MnS0, .4H20, 2,8 g dan FeS0, .7H20, 0,08 g dalam 100 ml
suling air untuk ekstrak ragi (Difco) 6,0 g, diamonium hidrogen sitrat, 2-4g,
kalium dihidrogen fosfat, 7,2 g, d-glukosa, 24,0 g, Tween 80, 1-2g, dilarutkan
dalam air suling, 100 ml. Bahan-bahan yang dipanaskan dengan lembut sampai larut. Kemudian
60 ml 4M natrium asetat penyangga asam asetat pada pH 5-37 & 0.02 (kaca elektroda) yang
ditambahkan dan volume dibuat sampai 200 ml dengan air suling, pH akhir menjadi 5.0.
Solusi ini tidak disterilkan tetapi disimpan dalam lemari es sampai dibutuhkan. tinggi
konsentrasi asetat dan rendah izin pH pendingin tidak berubah selama bertahun-
bulan. Larutan nutrisi kemudian ditambahkan ke digest tryptic susu disiapkan
sebagai berikut.
Susu digest. Satu liter susu mentah dipisahkan (disesuaikan dengan pH 8-5), 5 g tripsin
(B.D.H. lab. Reagen) dan 10 ml kloroform dicampur dan diinkubasi pada 37 "
selama 24 jam, dikukus selama 20 menit, disaring panas dan pH disesuaikan dengan 6 * 65 * 0,02
(kaca
elektroda) dengan asam asetat glasial (sekitar 0,5 ml / l) tanpa tindakan pencegahan aseptik.
menengah lengkap. Dalam 700 ml tryptic mencerna 19 g agar dilarutkan oleh
autoklaf pada 121 "selama 20 menit, dan selagi panas ini dicampur dengan 185 ml ofthe nutrisi
solusi sebelumnya dihangatkan sampai 50 ". Volume tersebut kemudian dibuat hingga 1 liter dengan air
panas
intisari. Sampel diencerkan dengan 3 bagian air hangat harus memiliki pH 5 * 35 * 0 * 05
pada 30 ".
media tersebut tubed di 10 ml quitntities dan disimpan di lemari es tanpa
sterilisasi. Ketika 1 ml pengenceran keju yang berlapis konsentrasi asetat di
media adalah tentang 0,24 M.
Ketika mempersiapkan piring medium dilebur dengan sedikit pemanasan mungkin
untuk menghindari gelap dan pembentukan endapan.
kaldu asetat. Ini disiapkan dengan cara yang mirip dengan media padat, agar-agar
yang dihilangkan.
asetat media semipadat. Ini juga disiapkan dengan cara yang sama dengan yang dimodifikasi
ROGOSA media tetapi konsentrasi glukosa meningkat menjadi 6% dan agar-agar
mengurangi to0-40, / ,. Hal ini tubed di 10 ml jumlah dan disimpan di lemari es tanpa
sterilisasi.
Tomat-glwoseagar (I'DA)
media ini dibuat seperti yang dijelaskan oleh Briggs (1953).
Persiapan pengenceran keju dan piring
Sampel dari 9 g keju diperoleh membosankan yang homogen dengan 80 ml 2%
natrium sitrat pada 40 "selama 3 menit dan pengenceran dibuat di kuartal-kekuatan Ringer
larutan. Salah satu jumlah ml pengenceran yang berlapis menggunakan lapisan ganda
medium.
HASIL
observasi awal .. Awalnya perbandingan dibuat antara medium
dari Keddie (1951) dan menengah ROGOSA dimodifikasi. Strain Lactobacillus casei

dan L. plantarum, sebelumnya terisolasi dari keju, tumbuh buruk t 30 "(3-7 hari)
pada mantan, pertumbuhan sedangkan yang baik diperoleh pada yang terakhir, yang oleh karena itu
dipekerjakan dalam pekerjaan berikutnya. Ini didukung pertumbuhan yang baik dari strain L.
acidophilus,
L. bulgaricus, L. delbruckii, L. fermenti, L. leichmannii, L. plantarum, L. casei var.
rhamnosus, L. misa dan L. brevis. Naylor (1956) telah melaporkan hasil rinci
studi pertumbuhan lactobacilli pada media ini dan dalam kaldu asetat.
Sifat selektif medium diuji dengan goresan piring dengan
pengenceran budaya organisme kemungkinan akan hadir di Cheddar cheese. Ini
termasuk budaya stok Streptococcus lactis, L. plantarum (4 strain), L. brevis
(7 strain), L. casei (2 jenis), dan beberapa isolat segar dari keju dari Micrococcus
sp., Leuconostoc spp. dan ragi, pertumbuhan Baik diperoleh dengan semua lactobacilli.
Beberapa Leuconostoc spp. membuat pertumbuhan sedikit dan semua organisme lain terhambat.
Pentingnya p H dan konsentrasi asetat. Ditemukan bahwa Strep. lactis dibentuk
koloni kecil pada media pada pH 5,6. pH yang dianjurkan 5-35f-05 adalah
cukup rendah untuk menghambat pertumbuhan mereka.
Meningkatkan konsentrasi asetat dengan 12% tidak mempengaruhi pertumbuhan L. msei,
L. plantarum dan L. brevis, satu-satunya spesies yang diuji. Di sisi lain penurunan
konsentrasi, mis sebesar 15%, memungkinkan pertumbuhan beberapa Leuconostoc spp.
Konsentrasi tripsin. Tiga tingkat konsentrasi tripsin, 0,01, 0,05 dan
0,1% (wlv), yang mencoba untuk persiapan digest, dan 0,05% ditemukan
optimal; itu memberi pencernaan yang cepat, meningkatkan kejelasan media akhir, dan
khususnya memungkinkan pertumbuhan yang lebih baik dari L. casei.
Suhu inkubasi. ROGOSA et al. (1951) menggunakan suhu inkubasi
dari 37 ". Dengan media dimodifikasi tidak ada perbedaan dalam tingkat pertumbuhan pada 30"
dan 37 "untuk L. plantarum (3 strain), L. casei var. rhamnosus (3 strain), L. casei (2
strain) dan L. brevis (1strain). Oleh karena itu inkubasi pada 30 "diadopsi seperti yang terlihat
lebih untuk pencacahan organisme dari keju Cheddar, yang matang
di 12-01 Mei ".

Tabel 1. Pemulihan Lactobacillus casei dan L. plantarum

.from Cheddar cheese homogenat rjn tomat dextrose agar (PDA)
dan modi $ ed menengah ROGOSA

Pemulihan lactobacilli pada modi $ ed ROGOSA menengah. Jumlah lactobacilli

di homogenates keju sebelum dan setelah penambahan nomor yang dikenal dari L. cmei
dan L.plantarum ditentukan oleh jumlah langsung pada dimodifikasi ROGOSA menengah dan

diperiksa oleh picks acak dari piring TDA cocok. kesepakatan yang baik diperoleh
oleh dua metode (Tabel 1).
menengah Comparisonof modiJied ROGOSA dengan TDAfor cou.ntingluctobacilli. unggul
kesepakatan diperoleh antara jumlah yang dibuat pada dua media menggunakan pengenceran
budaya stok L. cmei, L.planhru? mand L. brevis. Hal itu terutama melihat bahwa
L. brevis dan L. plantarum tumbuh sangat jauh lebih baik pada media asetat; itu
koloni sekitar 4 mm setelah 4 hari di 30 ". L. cmei koloni
ukurannya sama pada dua media. Leuconostoc spp. tumbuh buruk atau tidak sama sekali pada
asetat agar.

Ara. 1. perubahan dengan waktu jumlah lactobacilli dan streptococci

hadir dalam keju Cheddar dibuat dari susu mentah.
C'OU? L ~ Sof lactobacilli dalam keju dwing pematangan. Ara. 1 menggambarkan hasil yang diperoleh
ketika jumlah lactobacilli dibuat pada ROGOSA medium diubah pada interval
selama proses pematangan. Hal ini terlihat bahwa bahkan di hadapan sejumlah besar
streptokokus jumlah yang memuaskan dari lactobacilli dapat diperoleh. Dalam percobaan ini
semua koloni pada lempeng yang diperiksa secara mikroskopis dan hanya lactobacilli
ditemukan.
Pertumbuhan organisme keju lainnya pada media ROGOSA moclijed. Penggunaan lebih luas
medium telah menunjukkan bahwa kadang-kadang micrococci (non-hemolitik, katalase
cocci positif) dapat ditemukan di piring. Mereka awalnya ditemukan di
pengenceran pertama dari keju tua 3 hari. Pemeriksaan tiga belas keju yang dibuat di
Midlands mengungkapkan micrococci di piring asetat dalam dua kasus, sejauh
dari sekitar 6x106 / g. Dengan demikian 37 strain micrococci diisolasi dari Cheddar
keju pada tahun 1946 diuji pada media dan 7 strain ditemukan tumbuh. Sana
adalah, oleh karena itu, kemungkinan salah tafsir jika micrococci tertentu yang hadir.

Upaya untuk membedakan lac, tobacilli dan micrococci pada media ROGOSA dimodifikasi. Di
sebuah eksperimen beberapa upaya dilakukan untuk menekan pertumbuhan salah satu organisme ini
pada asetat agar sementara memungkinkan yang lain untuk tumbuh normal. Langkah-langkah mencoba
termasuk meningkatkan konsentrasi asetat 0,4 M dan natrium klorida untuk 6%,
menambahkan hidrogen peroksida hingga 1000 PLM dan dinitrophenol hingga 100 PLM (Beech &
Carr, 1955), tetapi tidak berhasil: juga adalah penambahan 0,1% dari asetat thallous
seperti yang direkomendasikan oleh Sharpe (1955) dari setiap nilai selektif.
Sebuah usaha juga dilakukan untuk memanfaatkan katalase karakter positif micrococci tersebut. Ia
berpikir bahwa jika pengenceran keju dalam kaldu asetat diinkubasi dengan
Kehadiran micrococci cenderung tumbuh di asetat agar akan terungkap dengan menambahkan
peroksida. Eksperimen untuk memeriksa hipotesis ini tidak menggembirakan. Memuaskan
jumlah pengenceran micrococci ini bisa dibuat dalam kaldu asetat dengan menguji dengan
hidrogen peroksida. Tapi ketika ini dicoba pada campuran L. brevis dan
a Micrococcus dari keju (angka berada di rasio 200: l) ditemukan
yang terakhir ini dihambat oleh lactobacilli dan tidak ada katalase dapat dideteksi.
Penggunaan media asetat semipadat untuk menguji kemampuan heterofermentative dari
lactobacilli. The semipadat media Gibson & Abd-El-Malek (1945), yang berisi
6% glukosa, telah Terlihat banyak digunakan untuk membedakan bersifat homofermentatif dari
organisme heterofermentative. Kelarutan karbon dioksida dikurangi dengan tinggi
konsentrasi gula dan heterofermentative organisme menyebabkan pembentukan gelembung di
agar-agar atau, jika fermentasi cepat, segel dari 294 agar dapat mendorong tabung.
Untuk mendapatkan tes positif baik inokulum besar (0,2 ml) dari budaya vigorouR digunakan.
Diharapkan bahwa media yang sama, disiapkan dengan menggantikan kaldu acetate untuk
susu dari media Gibson, akan selektif untuk lactobacilli dan akan memungkinkan
hitungan organisme laktat heterofermentative dibuat dengan teknik pengenceran.
Banyak lactobacilli dari keju diuji untuk heretofermentation di media ini
dan di media Gibson. Setelah inokulasi, tabung agar-agar asetat semipadat
WA5 disegel dengan plug media ROGOSA dimodifikasi dan diinkubasi pada 30 ". Dalam
semua kasus hasil positif yang jelas diperoleh dalam asetat agar setengah padat setiap kali
tabung Gibson sesuai positif. Ketika pengujian budaya tak dikenal,
Namun, itu sering diamati bahwa reaksi positif sedikit tapi pasti yang
diperoleh dalam agar asetat semipadat ketika hasil negatif ditunjukkan oleh
Gibson tabung selama periode inkubasi diperpanjang 14 hari. Pada kesempatan lain
hasil positif yang diperoleh lebih cepat dengan media asetat (2 bukannya
14 hari).
Ketika upaya dilakukan untuk membuat jumlah pengenceran nomor yang dikenal dari L. brevis
di media asetat semipadat hasil yang rendah. jumlah akurat hanya bisa
dilakukan jika, setelah inkubasi 48 jam pada 30 , budaya yang hangat untuk 50 "dan
terguncang untuk membubarkan koloni. Dengan cara ini tabung berisi hanya satu koloni
diberi inokulasi yang efektif. Dengan menggunakan teknik ini jumlah juga terbuat dari
L. brevis di hadapan organisme bersifat homofermentatif (L. cmei, L. plantarum).
hasil yang memuaskan diperoleh menyediakan organisme bersifat homofermentatif yang
tidak hadir dalam jumlah yang relatif tinggi. Misalnya ketika rasio jumlah
L. cmei dengan yang L. brevis adalah 1500: l jumlah akurat dicatat tetapi ketika
Rasio i.he adalah 30, OOO: l count itu 100 kali terlalu rendah.

pekerjaan awal menunjukkan bahwa media asetat setengah padat didukung baik
pertumbuhan Leuconostoc spp. diperoleh dari keju, A hitungan heterofermentative yang
organisme dalam keju dengan teknik yang dijelaskan oleh karena itu akan mencakup ini
organisme serta lactobacilli heterofermentative.
DISKUSI
Media dijelaskan oleh ROGOSA et al. (1951) adalah cocok untuk budidaya selektif
laktobasilus lisan dan feses, dan itu menunjukkan bahwa proporsi garam ini,
terutama dari sitrat, adalah penting untuk pertumbuhan yang memuaskan mereka. Itu dianggap
bahwa beberapa modifikasi akan diperlukan untuk memungkinkan pertumbuhan yang baik dari
lactobacilli susu, L. lactis, L. bulgaricus dan L. helveticus.
Pekerjaan yang dilaporkan di atas menunjukkan bahwa pertumbuhan yang baik dari semua lactobacilli
kemungkinan
dapat ditemukan di Cheddar cheese terjadi ketika susu tryptic digest digunakan sebagai pengganti
trypticase. medium menghambat pertumbuhan streptokokus starter. pematangan yang
keju Cheddar disertai dengan variasi dalam populasi bakteri
signifikansi diketahui. Tampaknya kemungkinan bahwa tingkat dan laju pertumbuhan
flora pada periode awal pematangan memiliki efek mendalam pada berikutnya
pengembangan mikro-organisme. media ROGOSA dimodifikasi memungkinkan memuaskan
estimasi jumlah lactobacilli dalam periode ini. Sebuah studi dari jenis dan mereka
interaksi dengan streptokokus starter keju, dan faktor-faktor mengendalikan mereka
pertumbuhan, sekarang harus mungkin. Sebelumnya ia berpikir bahwa lactobacilli
hanya tumbuh setelah beberapa minggu pematangan. Hasil yang sudah didapat, namun,
menunjukkan bahwa mereka tumbuh perlahan dan terus menerus dari beginnning pematangan yang
periode.
Ini akan dicatat bahwa media tidak disterilkan sebelum digunakan, meskipun
bahan semuanya telah dipanaskan pada beberapa tahap persiapan. Ini bisa jadi
Kerugian jika media terkontaminasi dengan lactobacilli. Tidak seperti
Kesulitan telah muncul dalam pengalaman kami. Ini bisa, dalam hal apapun, harus dihindari dengan
menginkubasi
media sebelum digunakan. Sumber lain yang mungkin dari kesalahan adalah bahwa ketika lactobacilli
dipetik dari piring asetat ke dalam kaldu non-selektif untuk pemeriksaan microscopjc
pertumbuhan mungkin terjadi dari organisme lain dibawa dalam potongan-potongan kecil asetat yang
agar. Fenomena ini belum pernah diamati. Sebagai perlindungan koloni mungkin
mengambil ke dalam kaldu asetat, di mana pertumbuhan beberapa lactobacilli lebih unggul
bahwa dalam tomat-dextrose broth.
Fakta bahwa beberapa micrococci keju dapat tumbuh pada media ROGOSA yang dimodifikasi
akan mengurangi kegunaannya, sebagai koloni kadang-kadang memerlukan konfirmasi. Ini bukan
kerugian ketika lactobacilli yang sedang diklasifikasikan, tetapi begitu dengan rutin
jumlah. Namun, belum ada kesulitan yang serius karena kehadiran micrococci pada periode awal
pematangan saat media telah ditemukan mampu
menghilangkan semua streptokokus starter. Meskipun kegagalan upaya untuk memanfaatkan
katalase karakter positif dari micrococci untuk membedakan mereka dari lactobacilli pada media,
dianggap bahwa solusi untuk masalah terletak pada ini
pendekatan.
Keberhasilan penggunaan media ROGOSA yang dimodifikasi dalam penyelidikan keju

menyarankan bahwa modifikasi lebih lanjut mungkin mengizinkan perhitungan langsung dari
heterofermentative
lactobacilli. Media asetat semipadat yang dirancang untuk pencacahan
organisme ini dan / atau Leuconostoc spp. adalah, t menyajikan diragukan lagi dari terbatas
aplikasi. Rupanya itu lebih sensitif dibandingkan dengan media yang dijelaskan oleh
Gibson & Abd-El-Malek (1945) untuk mendeteksi lactobacilli heterofermentative.