BAHAN DAN METODE

Kimia dan Reagen

Sodium dihydrogen phosphate monohydrate kelas analitis dan metanol dan asetonitril HPLC
grade yang diperoleh dari Merck (Sa~o Paulo, Brazil). Air kromatografi kelas diproduksi oleh
Millipore Milli-Q sistem (Billerica, MA, USA). Standar referensi cefadroxil dibeli dari
Farmacope'ia Brasileira (Rio de Janeiro, Brazil) dan lamivudine (standar internal IS) yang ramah
disediakan oleh FURP (Sa~o Paulo, Brazil).

Solusi saham Standard

Larutan standar saham dari 1 mg = mL cefadroxil dan 100 mg = mL lamivudine (IS) disiapkan
dalam metanol dan disimpan pada? 20C.

Standar Kalibrasi dan Quality Control Plasma Sampel

Solusi standar saham dari cefadroxil (1 mg = mL) dan IS (100 mg = mL) diencerkan dengan
air: solusi metanol (90:10, v = v) untuk menghasilkan kerja solusi standar saham dari cefadroxil
pada konsentrasi 400, 320, 240, 160, 80, 40, 10, dan 4 mg = mL dan bekerja larutan standar
saham dari IS pada konsentrasi 10 mg = mL, yang disimpan di 6C.

Persiapan kalibrasi sampel plasma standar dicapai setiap hari oleh spiking jumlah dikenal (25
mL) dari solusi cefadroxil (4-400 mg = mL) ke 225 mL plasma bebas narkoba di 8 mL tabung
kaca. Konsentrasi efektif dari kurva kalibrasi untuk cefadroxil dalam sampel plasma 0,4; 1,0;
4.0; 8,0; 16,0; 24,0; 32,0, dan 40,0 mg = mL.

Kontrol kualitas (QC) sampel plasma dikumpulkan, pada konsentrasi 1 mg = mL (rendah), 16

mg = mL (menengah), dan 32 mg = mL (tinggi), sebagai batch tunggal pada setiap konsentrasi
dan kemudian dibagi menjadi Aliquot yang disimpan dalam freezer di? 20C sampai analisis.
Plasma sampel berduri (standar dan QCs) yang diproses mengikuti prosedur pada setiap batch
analitis bersama dengan sampel yang tidak diketahui.

Persiapan sampel

Bagian dari 250 mL kosong plasma, berduri plasma atau studi farmakokinetik plasma
dipindahkan ke 8-mL tabung kaca, dibubuhi 25 mL IS bekerja larutan standar saham (10 mg =
mL) dan pusaran dicampur selama 5 s. Protein presipitasi dicapai dengan menambahkan 200 mL
asetonitril untuk campuran. Setelah pusaran pencampuran selama 15 s pada suhu kamar dan D
pemusingan pada 10.000 g selama 15 menit, lapisan atas disaring melalui membran Durapore
(13 mm 0,45 mm) dalam tabung gelas bersih dan diuapkan sampai kering dengan menggunakan
evaporator di 40C di bawah aliran nitrogen. Kemudian, ekstrak kering dilarutkan dalam 300 mL
fase gerak dan 30 mL yang disuntikkan ke dalam sistem kromatografi.

Parameter instrumental dan Kondisi

Analisis dilakukan pada Instrumen Shimadzu Ilmiah sistem kromatografi cair (Kyoto,
Jepang) terdiri dari pompa LC-10ADvp, DGU-10ADvp degasser, SPD-10ADvp DAD detektor,
dan CTO-10ADvp kolom oven. Kromatografi fase-balik dilakukan pada analisis Phenomenex
Synergi MAX RP C18 kolom (4 mm, 150 mm 4.60 mm) (Torrence, CA, USA) dilindungi
dengan Phenomenex AJO-4287 C18 guard cartridge (Torrance, CA, USA).

Fase gerak terdiri dari larutan natrium dihidrogen fosfat monohidrat (20 mmol = L),
metanol, dan asetonitril dengan perbandingan 90: 8: 2 (v = v = v). Sebelum analisis, fase gerak
disaring melalui 0,22 mm filter, dan kemudian gasnya ultrasonically selama 15 menit. Uji ini
dijalankan pada 35C. Tingkat aliran 1 mL = min digunakan dan puncak dielusi dipantau pada
230 nm.

Validasi Metode Bioanalytical

Metode yang dijelaskan divalidasi dalam hal linearitas, batas bawah kuantifikasi (LLOQ),
pemulihan, selektivitas, stabilitas, presisi, dan akurasi sesuai dengan pedoman internasional
mengenai metode validasi bioanalytical.

Selektivitas

Untuk mengevaluasi selektivitas metode, obat sampel plasma bebas dilakukan melalui
prosedur uji dan waktu retensi dari senyawa endogen dalam plasma dibandingkan dengan orang-
orang dari cefadroxil (0,4 mg = mL) atau IS. Selektivitas metode ini dinilai untuk menguji
pengaruh matriks enam sampel yang berbeda plasma: empat sampel plasma normal, satu sampel
plasma hemolized dan satu sampel plasma lipemic.

Batas bawah dari Kuantifikasi dan Linearitas

 Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) adalah konsentrasi analitis terkecil yang dapat diukur
dengan akurasi antara 80 sampai 120% dan presisi yang lebih rendah dari 20% linearitas an diuji
dengan kurva kalibrasi mulai 0,4-40,0 mg = mL dalam lima ulangan pada setiap konsentrasi.

Pemulihan

Pemulihan analitis dihitung dengan membandingkan luas puncak kromatografi dari sampel
standar terekstraksi dan dari diekstraksi sampel standar pada tiga konsentrasi QC dalam lima
ulangan.

Akurasi dan presisi

Intra akurasi uji presisi dan evaluasi dilakukan oleh analisis ulang dari cefadroxil dalam
plasma manusia. Jalankan terdiri dari kurva kalibrasi ditambah lima ulangan masing-masing
rendah, sedang, dan sampel kontrol kualitas yang tinggi. Akurasi uji Inter dan presisi yang dinilai
dengan analisis sampel yang terdiri dari kurva kalibrasi dan lima ulangan dari rendah, sedang,
dan sampel kontrol kualitas tinggi untuk cefadroxil pada lima hari terpisah. Ketepatan
keseluruhan metode ini dinyatakan sebagai standar deviasi relatif (RSD%) dan akurasi
dinyatakan sebagai rasio persentase antara konsentrasi eksperimental dan konsentrasi nominal
untuk setiap sampel.

Stabilitas

Stabilitas sampel plasma dalam kondisi yang berbeda dievaluasi melalui berduri sampel
kontrol kualitas pada tiga tingkat konsentrasi.

Stabilitas bangku-top diperiksa dengan menjaga ulangan sampel kontrol kualitas plasma pada
suhu kamar selama sekitar 4 jam. Stabilitas beku-mencair dari sampel diperoleh selama tiga
siklus beku-mencair, dengan pencairan pada suhu kamar selama 4 jam dan refreezing selama 12-
24 jam. Stabilitas auto-sampler cefadroxil diuji dengan analisis diproses dan dibentuk kembali
sampel kontrol kualitas plasma, yang disimpan dalam auto-sampler selama 48 jam pada suhu
kamar. Stabilitas jangka panjang dari cefadroxil dalam plasma manusia diuji setelah
penyimpanan pada? 20C selama 60 d. Untuk setiap konsentrasi dan setiap kondisi penyimpanan,
tiga ulangan dianalisis dalam satu batch analitis. Stabilitas di bawah kondisi yang berbeda
ditentukan oleh perbandingan dengan konsentrasi cefadroxil dalam sampel baru disiapkan (0 hr).

Aplikasi
Metode ini diterapkan untuk menentukan konsentrasi cefadroxil dalam sampel plasma dari 24
sukarelawan sehat, setelah pemberian oral dosis suspensi cefadroxil 450 mg (D1), 480 mg (D2),
500 mg (D3), Penentuan Cefadroxil di Sampel Manusia Plasma 1875 download oleh [Instituto de
Pesquisas e Estudos Florest] di 09:26 9 Agustus 2012 dan 520 mg (D4). Dosis yang berbeda
diberikan untuk setiap sukarelawan untuk mensimulasikan produk dengan ketersediaan hayati
yang berbeda

Studi in vivo dilakukan menurut aturan Baik Clinical Practice [17] dan protokol klinis telah
disampaikan dan disetujui oleh Komite Etik dari Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi, Universitas Sa~o
Paulo sesuai dengan Deklarasi Helsinki.

Parameter farmakokinetik berikut ini dihitung menggunakan model non-kompartemen: Cmax

(konsentrasi plasmatic maksimum), Tmax (waktu untuk Cmax), dan AUC0-t (area di bawah
konsentrasi-waktu kurva plasma dari nol untuk sampel saat cefadroxil terukur terakhir
konsentrasi). Cmax dan Tmax diperoleh langsung dari kurva konsentrasi-waktu dan AUC0-t
dihitung menggunakan metode trapesium linear.

HASIL DAN DISKUSI

Kinerja Assay

HPLC digabungkan dengan deteksi ultraviolet adalah metode yang paling sering digambarkan
untuk mengukur cefadroxil dalam sampel biologis. HPLC digabungkan dengan spektrometri
massa digunakan dengan frekuensi kurang, [10] dan tidak rutin tersedia di semua laboratorium,
terutama di negara-negara berkembang.

Tes mikrobiologi digambarkan, [11,12] namun kini mereka tidak umum karena mereka tidak
memiliki sensitivitas dan spesifisitas.

Langkah persiapan sampel sangat penting untuk akurasi dan sensitivitas metode uji. Beberapa
metode untuk kuantifikasi cefadroxil dalam plasma dijelaskan dalam literatur sebagai presipitasi
protein (PPT), ekstraksi fase padat (SPE), dan ultrafiltrasi. PPT adalah metode persiapan sampel
yang paling banyak digunakan untuk cefadroxil, menggunakan solusi kuat asam [1,5,8] atau
asetonitril. [6,9] PDF sering memberikan pemulihan yang lebih tinggi dibandingkan dengan
metode lainnya, terutama untuk senyawa yang memiliki polaritas tinggi. Prosedur ini
memberikan kromatogram bersih untuk sampel plasma kosong dan menghasilkan pemulihan
tertinggi untuk analit dari plasma. Teknik SPE digunakan oleh Samanidou dan rekan, [7] tetapi
melibatkan dua langkah yang membuatnya sangat rumit dan memakan waktu untuk aplikasi di
tes rutin. Selain itu, mahal, terutama mengingat bahwa salah satu kartrid diperlukan per sampel.
Metode ultrafiltrasi dijelaskan dalam literatur [3] tidak divalidasi dan tidak menggunakan standar
internal

Dibandingkan dengan yang dijelaskan sebelumnya metode persiapan sampel untuk

cefadroxil, prosedur yang disajikan dalam pekerjaan ini lebih sederhana, lebih ekonomis, dan
lebih cepat. Kelompok yang sama mengembangkan metode untuk kuantifikasi cefadroxil dalam
plasma, [6] tetapi hasil dari metode baru kinerja hadir baik dalam hal jangkauan linearitas,
pemulihan, dan waktu retensi untuk cefadroxil dan IS. Selanjutnya, metode yang digunakan
sebelumnya 3 mL asetonitril untuk persiapan sampel. Penggunaan pelarut organik dalam
prosedur ekstraksi dalam pekerjaan ini juga diminimalkan hanya 200 mL asetonitril per sampel.

Hanya dua metode dilaporkan sebelumnya digunakan laju aliran dalam sistem kromatografi
sama atau kurang dari 1 mL = min. Barbhaiya [3] dijelaskan metode dengan laju alir 1 mL =
menit, tapi waktu retensi cefadroxil lebih besar dari 5 menit. Piotrovskij dan rekan [5] disajikan
sebuah metode dengan laju alir 0,6 mL = min, tapi waktu retensi cefadroxil adalah 13,4 menit.
Meskipun penggunaan laju alir rendah 1 mL = min dalam metode ini, waktu retensi singkat
untuk cefadroxil (3,3 menit) dan IS (4,6 menit) diperoleh. Di bawah kondisi kromatografi ini,
jangka waktu untuk setiap sampel adalah 10 menit. Itu menunjukkan bahwa penentuan analit itu
tidak diganggu oleh zat endogen dalam plasma pemisahan kromatografi. Gambar 1 merupakan
kromatogram dari cefadroxil dan IS dari plasma manusia.

Penyesuaian pH fase gerak yang diperlukan dalam beberapa metode. [1,5,6,8,13]

Penyusunan fase gerak yang disajikan dalam pekerjaan ini tidak memerlukan penyesuaian pH.
Selain itu kami tidak termasuk aditif dalam fase mobile seperti agen trietilamina,
tetrabutlyammonium, atau pasangan ion.

Metode yang diusulkan adalah linier antara 0,4-40,0 mg = mL untuk cefadroxil dan kurva
kalibrasi dapat dijelaskan oleh persamaan y 0.0739x 0,0049 (r2 0,9993) (Gambar 2). The
LLOQ dari 0,4 mg = mL dalam plasma diperoleh dengan 250 ml plasma adalah salah satu yang
terendah dilaporkan dalam literatur. Piotrovskij dan rekan [5] memperoleh LLOQ 0,2 mg = mL
menggunakan 500 mL sampel plasma. Rata-rata recovery adalah 102,21% untuk cefadroxil dan
97,94% untuk lamivudine (Tabel 1). RSD% nilai kurang dari 15% dan menggambarkan baik
intra dan inter-assay presisi metode ini. The intra dan inter-assay akurasi berkisar 97,01-104,79
(Tabel 2)
 Cefadroxil dalam sampel plasma terbukti stabil selama minimal 4 jam pada suhu kamar.
Pembekuan dan pencairan siklus tidak mengubah tingkat konsentrasi analit secara signifikan.
Penyimpangan dibandingkan dengan sampel baru disiapkan (1, 16, dan 32 mg = mL) ditemukan?
7.70%, 1,60%, dan? 2,33%, dari nilai nominal masing-masing setelah setiap siklus beku-
mencair. Empat puluh delapan jam hasil stabilitas auto-sampler dari ekstrak sampel plasma pada
suhu kamar menunjukkan tidak ada perubahan yang signifikan dalam tingkat konsentrasi analit
(misalnya, lebih dari 15%). Konsentrasi cefadroxil dalam sampel plasma tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan setelah 60 d di? 20C.

Metode ini memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan metode dilaporkan

sebelumnya seperti prosedur sederhana dan cepat untuk sampel pra-perawatan, mudah persiapan
fase gerak, penggunaan laju aliran rendah dalam sistem kromatografi, dan, akibatnya, penurunan
penggunaan pelarut organik dalam fase gerak. Waktu jangka pendek memiliki keuntungan
memfasilitasi dan meningkatkan efisiensi pengolahan sejumlah besar sampel plasma yang
diperoleh dari studi farmakokinetik = bioavailabilitas = bioekivalensi dalam subyek manusia
yang sehat.

Aplikasi

Metode ini divalidasi diterapkan untuk memantau konsentrasi plasma cefadroxil pada
sukarelawan sehat yang diberikan dosis oral tunggal. Batas bawah kuantifikasi dan linearitas
yang baik yang diperoleh dengan menggunakan metode ini yang memadai untuk cefadroxil
kuantifikasi dalam plasma manusia setelah pemberian dosis yang berbeda dari cefadroxil.
Kromatogram perwakilan yang diperoleh dari salah satu relawan di 1,5 jam setelah pemberian
obat ditunjukkan pada Gambar 1D. Mean konsentrasi plasma-time kurva cefadroxil setelah
pemberian oral empat dosis yang berbeda untuk 24 relawan sehat ditunjukkan pada Gambar 3.
Hasil Cmax rata adalah D1 17,39 mg = mL, D2 18,53 mg = mL, D3 19,35 mg = mL, dan
D4 19,63 mg = mL. Tmax tidak berbeda secara signifikan antara dosis dan berkisar 1,04-1,2
jam, dan AUC0-t adalah D1 48,28 mg.h = mL, D2 52,88 mg.h = mL, D3 56,08 mg.h =
mL, dan D4 59,41 mg.h = mL

KESIMPULAN

Sebuah metode HPLC sederhana dan efisien isokratik fase terbalik diusulkan ditemukan akurat,
tepat, dan linear di berbagai analitis. Semua parameter validasi untuk cefadroxil kuantifikasi
memenuhi kriteria pedoman internasional untuk validasi metode bioanalisis. [15,16] Metode ini
bisa karena itu direkomendasikan untuk studi farmakokinetik, termasuk bioavailabilitas dan
bioekivalensi studi