Produk bioteknologi DAN PROSES ENGINEERING

Efek dari pasokan gliserol dan laju pertumbuhan spesifik pada produksi
metanol bebas dari CALB oleh P. pastoris:
karakterisasi fungsional dari promotor baru

Verena Looser 1 & Dominik Lthy 1 & Marcel Straumann 1 & Katrin Hecht 1 &
Karel Melzoch 2 & Karin Kovar 1

Menerima: 3 Oktober 2016 / Revisi: 3 Januari 2017 / Diterima: 10 Januari 2017 / Diterbitkan online: 27 Januari 2017
# Penulis (s) 2017. Artikel ini diterbitkan dengan akses terbuka di Springerlink.com

Abstrak Sebagai Pichia pastoris ( syn. Komagataella sp.) ragi dapat mensekresi mungkin dalam umpan curah tunggal, sehingga secara signifikan mengurangi masukan

protein rekombinan murni pada tingkat tinggi, itu adalah sistem produksi yang eksperimental pendekatan sebelumnya yang terdiri dari beberapa percobaan.

diinginkan. Fungsi dari varian sintetis novel promotor AOX1 ditandai

komprehensif menggunakan mensekresi regangan Candida antarctica lipase B
(CALB) sebagai model. Pendekatan menghemat waktu baru diperkenalkan untuk
menentukan, hanya dalam satu percobaan, hubungan yang sampai sekarang
belum antara laju pembentukan produk tertentu ( q p) dan laju pertumbuhan spesifik
( ). kontrol ketat pembentukan protein rekombinan mungkin tanpa adanya
Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176 DOI 10,1007 / s00253-017-8123-x
metanol, ketika menggunakan gliserol sebagai / sumber energi karbon tunggal.
CALB tidak disintesis selama kultivasi batch yang lebih gliserol (> 10 gl - 1) dan
pada tingkat pertumbuhan dekat dengan max ( 0,15 h - 1).
Antara 0,017 dan 0,115 h - 1 dalam budaya umpan curah gliserol terbatas,
tingkat basal q p> 0,4 mg g - 1 h - 1 CALB dicapai, independen dari di mana
budaya tumbuh. Di
> 0,04 h - 1, ditinggikan q p terjadi sementara selama pertama 20 jam setelah
mengubah ke mode umpan curah dan sesudah itu menurun ke basal. Dalam
rangka mempercepat penentuan q p ( ) hubungan (kinetika pembentukan produk),
seluruh yang kisaran ditutupi dalam percobaan umpan curah tunggal. Dengan
meningkatkan linear dan penurunan tingkat penambahan gliserol,
nilai-nilai yang berulang kali bergeser 0,004-0,074 h - 1 dan sebaliknya.
Perubahan dalam q p terkait dengan perubahan . Sebuah estimasi kasar Kisaran (Hartner et al. 2008 ), Atau yang baru diidentifikasi karbon alami
cocok untuk produksi adalah
Kata kunci Pichia pastoris. Candida antarctica lipase B. Bebas methanol.
produktivitas tertentu. Sekresi. kinetika pembentukan produk
pengantar
Pichia pastoris ( syn. Komagataella sp.) adalah tuan rumah yang penting
untuk produksi dan sekresi tingkat tinggi protein heterolog. Berbagai
promotor yang tersedia, yang paling umum digunakan menjadi promotor
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (P CELAH) untuk produksi konstitutif
dan alkohol oksidase 1 promoter (P AOX1) untuk produksi methanoldependent
diinduksi. Kedua sistem memiliki kelemahan mereka, terutama metanol
sebagai substrat dan P CELAH sebagai promotor noninducible (Kovar et al. 2010
; Mellitzer et al. 2014 ). Sistem dicari di mana produksi dapat diatur tanpa
menggunakan metanol induksi (Hartner et al. 2008 ; Prielhofer et al. 2013 ;
Stadlmayr et al. 2010 ; Vogl dan Glieder 2013 ; Vogl et al. 2016 ). promotor
karbon sourcedependent seperti yang baik varian sintetis dari P alami AOX1 promotor,
yang dihasilkan oleh yang dipilih (pendek) urut penghapusan / sisipan
sumber-diatur promotor (Prielhofer et al.

* Karin Kovar
2013 ; Stadlmayr et al. 2010 ; Vogl et al. 2016 ). Sebagai contoh, produksi protein
koka@zhaw.ch
rekombinan dapat ditekan selama fase batch dengan kelebihan gliserol, dan
1 ekspresi gen rekombinan dapat dimulai selama kultivasi umpan curah substrat
Institut Kimia dan Bioteknologi, Zurich University of Applied Sciences
(ZHAW), Kampus Grental, 8820 Wdenswil, Swiss terbatas dengan glukosa (Prielhofer et al. 2013 ). Peraturan P sintetis AOX1 varian
didasarkan pada prinsip-prinsip represi / derepresi, menggunakan glukosa
2 Departemen Bioteknologi, Universitas Kimia dan atau gliserol sebagai
Teknologi Praha, Technick 5, 166 28 Prague 6, Republik Ceko Appl Microbiol
3164
satu-satunya substrat (Capone et al. 2015 ; Mellitzer et al. 2014 ; Ruth et al. 2010 ). memakan proses umpan curah (Tunggu et al. 2008 ; Zhang et al.
Pada konsentrasi tinggi gliserol atau glukosa, semua P AOX1 varian ditekan
tetapi derepressed oleh ketersediaan substrat yang lebih rendah (juga
digambarkan sebagai substrat terbatas) selama kultur umpan curah (Capone
et al. 2015 ; Mellitzer et al. 2014 ; Ruth et al. 2010 ). Untuk ini P baru AOX1
varian, sedikit yang diketahui tentang fungsi mereka dan kemungkinan kontrol
dengan strategi proses, yaitu produktivitas spesifik dalam kaitannya dengan
pra-mengatur tingkat pertumbuhan tertentu. Misalnya, derepresi dari P AOX1 Varian
(yaitu pembentukan produk maksimum) ditentukan pada tingkat penyerapan
gliserol spesifik
0,054 gg - 1 h - 1, sesuai dengan tingkat pertumbuhan spesifik
0.024 h - 1 ( Capone et al., 2015 ). Namun, untuk diterapkan secara luas P. pastoris sistem,
secara umum pembentukan produk rekombinan maksimal, telah dilaporkan di
berbagai tingkat pertumbuhan tertentu (Barrigon et al. 2015 ; Looser et al. 2015 ).
Promotor yang sama dan kombinasi substrat cenderung memiliki pengaruh lebih
besar pada kinetika pembentukan produk dari kategori yang sama produk
rekombinan (Looser et al. 2015 ). tingkat tertentu P CELAH- produksi protein
dikendalikan dengan glukosa sebagai substrat biasanya meningkat dengan
tingkat pertumbuhan tertentu dekat dengan max ( Buchetics et al. 2011 ; Maurer
et al.
2006 ; Rebnegger et al. 2014 ). sebaliknya sering ditemukan untuk P AOX1- Tingkatpengujian kondisi proses dalam lingkungan umpan curah dapat mengungkapkan
tinggi pembentukan protein rekombinan dikendalikan disebabkan oleh
metanol, dimana maksimum tarif sekresi tertentu yang diamati pada jauh
di bawah max
(Kobayashi et al. 2000 ; Potgieter et al. 2010 ; Wu et al.
2010 ). Perbedaan utama antara sistem produksi yang ditetapkan adalah desain
regangan (yaitu menggunakan promotor diinduksi atau konstitutif) dan karbon /
energi substrat (metanol atau glukosa). Maksimum laju pertumbuhan spesifik jauh
lebih tinggi dengan glukosa ( max 0,28 h - 1 oleh Paulova et al. 2012 )
Dibandingkan dengan metanol; max 0,14 atau 0,035 h - 1 untuk pemanfaatan
metanol fenotip lambat (Mut S), masing-masing (Brierley et al.
1990 ). Untuk alasan ini, rentang operasional untuk desain proses
produksi berbeda dengan promotor yang berbeda.
P. pastoris strain dengan novel P AOX1 promotor varian, yang berbudaya
dengan gliserol, adalah kombinasi dari dua sistem sehubungan dengan fitur
promotor dan substrat. Secara umum, pembentukan produk tidak dapat
diprediksi apriori dan harus ditentukan secara empiris untuk setiap kombinasi
dari promotor dan gen heterolog (Potgieter et al. 2010 ). kinetika pembentukan
produk q p ( ), hubungan antara laju pembentukan produk tertentu ( q p) dan laju
pertumbuhan spesifik ( ), mencerminkan keseimbangan antara berbagai
langkah sampai produk disekresikan. produktivitas spesifik maksimum untuk
setiap protein heterolog yang diberikan dapat dicapai jika fluks yang dihasilkan,
dilipat dan disekresikan protein yang seimbang.
Dalam rangka untuk merancang proses produksi, q p ( ) hubungan harus
dibentuk. Ini adalah dasar dari beberapa upaya desain proses rasional dan
optimasi (d ' Anjou dan Daugulis 2001 ; Kobayashi et al. 2000 ; Maurer et al. 2006diintegrasikan ke dalam AOX1 lokus P. pastoris
; Ohya et al. 2005 ; Zhang et al. 2005 ). Secara umum, baik banyak waktu-
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
2005 ) Atau budidaya berkelanjutan (Curvers et al. 2001 ; Jungo et al.
2006 ; Khasa et al. 2007 ; Maurer et al. 2006 ) Dilakukan pada berbagai pre-set nilai-nilai
untuk membangun hubungan ini. Namun, untuk protein rekombinan produksi
dikendalikan oleh P AOX1 varian, sedikit informasi yang tersedia. Untuk
mempercepat dan merasionalisasi tugas yang sangat menuntut proses
pengembangan bioteknologi, di mana masing-masing konstruk harus ditandai
secara empiris, pendekatan generik efisien sedang dicari. Dalam hal ini,
penggunaan kondisi proses dinamis untuk cepat karakterisasi galur fisiologis telah
dijelaskan (Spadiut et al. 2013 ; Spadiut dan Herwig 2014 ). pendekatan umpan
curah dinamika yang berbeda saat ini sedang dikejar bisa memungkinkan seluruh
rentang produksi
q s ( dan ) untuk diselidiki dalam satu percobaan tunggal (Capone et al. 2015 ; Spadiut et
al. 2014 ; Zalai et al. 2012 ). Keuntungan utama dari teknik umpan curah adalah bahwa
laju pertumbuhan spesifik dikendalikan oleh laju penambahan substrat. Substrat
ditambahkan segera dimanfaatkan, dan sel-sel dapat karena itu hanya growas cepat
sebagai substrat ditambahkan. Secara teori, terus meningkat dan penurunan laju
penambahan substrat dalam budidaya umpan curah harus memungkinkan berbagai nilai
yang akan dianalisis berulang kali, sedangkan usia sel-sel dan konsentrasi biomassa
meningkat terus. Oleh karena itu pendekatan yang dinamis seperti memungkinkan
seluruh rentang produksi yang akan dibahas dalam percobaan tunggal. Selanjutnya,
fenomena dalam proses produksi kemudian bahwa eksperimen terus menerus akan
gagal untuk memprediksi (Zalai et al., 2012 ). Dalam studi ini, P. pastoris regangan
mensekresi Candida antarctica
lipase B (CALB), di bawah kendali sintetis P Novel AOX1
varian, ditandai fisiologis untuk menunjukkan fungsi novel promotor ini. Sebuah
pendekatan untuk secara dinamis bervariasi tingkat pertumbuhan tertentu dalam
percobaan umpan curah tunggal dibandingkan dengan beberapa budidaya umpan
curah eksponensial tunggal, yang dilakukan di beberapa berbeda pre-set nilai-nilai
untuk membangun yang diinginkan q p = f ( ) hubungan. Selama budidaya umpan
curah, P AOX1 Varian derepressed dan tingkat basal CALB dicapai independen dari
laju pertumbuhan spesifik diterapkan, sedangkan q p nilai lebih tinggi dari basal
bergantung pada waktu produksi, laju pertumbuhan spesifik dan ketersediaan
substrat.
Bahan dan metode
Ketegangan
Clone 13-H2 yang digunakan dalam penelitian ini dibangun dan disediakan oleh
VTU Teknologi GmbH (Raaba-Grambach, Austria). Dua salinan dari plasmid
pPZ (Naatsaari et al. 2012 ) Membawa kodon-dioptimalkan C. antarctica gen
lipase B ( calB) menyatu dengan kawin kodon-dioptimalkan - Pemimpin faktor
urutan sinyal dari Saccharomyces cerevisiae untuk sekresi produk ekstraseluler
CBS 7435 Mut S ketegangan. ekspresi gen dikontrol oleh
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176 3165

AOX1 promotor varian (P AOX1 varian), yang merupakan variasi lebih lanjut Budaya bets berikutnya terdiri batch A dan B. Setelah fase angkatan
dari d6 promotor dijelaskan oleh Hartner et al. ( 2008 ). Selain itu, protein awal dimulai dengan konsentrasi gliserol dari 30 gl - 1, gliserol berulang kali
disulfida isomerase urut sintetis (PPK plasmid, dua salinan, Naatsaari et al. 2012berdenyut ke dalam budaya untuk menjaga konsentrasi terus-menerus
) Telah coexpressed di bawah kontrol promotor yang sama seperti CALB antara 10 dan 50 gl - 1. Untuk tahap kedua (B), budaya kaldu benar-benar
(tanpa urutan sinyal rekombinan, yang terletak di retikulum endoplasma). dihapus dan biomassa sisa dalam bioreaktor itu resupplied dengan media
Stock biakan dilestarikan di 24% gliserol di - 80 C. segar ( ~ 1 gl - 1 cell berat kering (CDW)).

Dua rezim budaya umpan curah berbeda digunakan, tergantung pada laju
pertumbuhan spesifik. budidaya umpan curah dengan laju pertumbuhan spesifik
konstan <0,02 h - 1 terdiri fase pertumbuhan biomassa dalam batch dan
media kultur
fedbatchmodes dan fase produksi dalam mode umpan curah. Budidaya dengan
konstanta laju pertumbuhan spesifik> 0,02 h - 1, serta bergeser eksperimen,
media kultur dan inokulum dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh
yang hanya terdiri dari fase pertumbuhan biomassa dalam modus batch dan
Hyka et al. ( 2010 ). Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian
tahap produksi dalam mode umpan curah. Tekanan parsial relatif oksigen (pO 2) dalam
ini adalah dari pa puriss kelas, dibeli dari Sigma-Aldrich bagian dari Merck
medium tidak diatur, yang mengakibatkan penurunan terus-menerus dalam pO 2 Tingkat
(sebelumnya Fluka, Buchs, Swiss), kecuali dinyatakan lain. Gliserol dibeli
selama budaya batch. Setelah peningkatan pesat dalam pO 2 karena penipisan
dari Hnseler AG (Herisau, Swiss). Untuk pra-budaya, yang buffered
gliserol, penambahan larutan gliserol dimulai. tingkat Selain eksponensial gram
gliserol kompleks menengah (BMGY) digunakan (Invitrogen 2002 ). Isinya
pakan per jam mendukung konstan laju pertumbuhan spesifik yang diinginkan
10 g gliserol, ekstrak ragi 10 g, 20 g pepton, 100 mM kalium fosfat
yang dihitung berdasarkan Persamaan. (1) .
penyangga (pH 6,0), 13,4 g dasar ragi nitrogen tanpa asam amino dan 0,4
mg biotin l - 1.

Untuk kedua budaya batch dan umpan curah, media mineral didefinisikan
disesuaikan fromHellwig et al. ( 2001 ) Digunakan mengandung 0,17 g CaSO 4 F t F 0 e t 1
2H 2 O, 2,86 g K 2 BEGITU 4, 0,64 g KOH, 2,3 g MgSO 4 7H 2 O, 0,2 g EDTA, 7.23
g H 3 PO 4 dan 0,1 ml polipropilena glikol (PPG), yang semuanya diautoklaf, dan F0 ms x0 V0 2
Yx=s w di

4,35 ml filter-steril PTM1 solusi l - 1 dan 0,87 mg biotin l - 1, yang ditambahkan

Nilai laju umpan awal F 0 ( Eq. (2) ) Diberikan oleh
secara terpisah. The PTM1 larutan stok (Invitrogen 2002 ) Yang terkandung
diinginkan (awal) laju pertumbuhan spesifik ( ), biomassa maksimum untuk hasil
5.0 ml 69% H 2 BEGITU 4,
gliserol 0,59 gg - 1 ( Y x / s), Tingkat pemeliharaan spesifik
3,84 g CuSO 4, 0,08 g NaI, 3,0 g MnSO 4 H 2 O, 0,2 g Na 2 Melenguh 4 2H 2 O,
0,005 g gliserol per biomassa gram per jam ( m s), konsentrasi awal CDW di
0,02 g H 3 BO 3, 0,92 g COCl 2 6H 2 O, 20,0 g ZnCl 2 dan 65,0 g FeSO 4 7H 2 O l - 1.
gram per liter ( x 0) dikalikan volume awal dalam liter ( V 0) dan fraksi massa
budaya Batch yang biasanya dilakukan pada 30 g gliserol l - 1. larutan
substrat dalam larutan umpan 0,58 gg - 1 ( w di). profil pakan eksponensial untuk
umpan untuk budaya umpan curah terkandung 588 g gliserol, 2,4 mg biotin
fase pertumbuhan biomassa (sebelum tahap produksi) dihitung dengan laju
dan 12 ml PTM1 solusi kg - 1.
pertumbuhan spesifik yang diinginkan dari 70% dari max ( 0,12 h - 1) dan
dengan waktu yang cukup untuk mencapai 60 sampai 70 gl - 1 dari berat
kering sel.
budidaya bioreaktor

Budidaya dilakukan baik dalam 14-l diaduk bioreaktor tangki (Mavag, - Percobaan pergeseran budaya umpan curah

Neunkirch, Swiss) pada 18 l min - 1 aliran udara (tanpa pengayaan oksigen),

1400-rpm kecepatan pengaduk dan sampai 0,5 bar overpressure; dalam Berdasarkan parameter pertumbuhan ( max, Y x / s) ditentukan selama budidaya batch,

18-l diaduk bioreaktor tangki (Bilfinger Industrietechnik, Salzburg, Austria) profil pakan untuk menentukan laju pertumbuhan spesifik optimum ( memilih) untuk

pada 18 l min - 1 aliran udara (tanpa pengayaan oksigen), 1000 - pembentukan produk dirancang. Dengan meningkatkan linier atau menurunkan
suku Selain pakan gliserol, tingkat pertumbuhan tertentu yang dinamis bergeser

kecepatan 1500-rpmagitator dan sampai 0,5 bar overpressure; atau dalam 50-l selama periode waktu tertentu. Karena ketersediaan substrat data per biomassa,

diaduk bioreaktor tangki (Mavag, Neunkirch, Swiss) di 57 - 65 l min - 1 aliran udara profil pakan linear mengakibatkan tingkat pertumbuhan tertentu berubah secara

(tanpa pengayaan oksigen), 800-rpm kecepatan pengaduk dan tanpa sigmoidal. Fungsi linear dari tingkat pakan F (t) dalam pakan gram larutan per jam

overpressure. Sebagai sekresi produk itu ditemukan lebih tinggi pada 25 C diberikan oleh Persamaan. (3) .

dibandingkan pada 30 C, semua tahapan produksi dilakukan pada 25 C.

larutan amonia (12,5%) dan asam fosfat (8,5%) digunakan untuk
mempertahankan pH pada nilai konstan 5.0.
F t Sebuah t F 0 3
3166
Nilai laju umpan awal, F 0, ditentukan oleh tingkat pertumbuhan yang
diinginkan awal tertentu ( ) dan dihitung seperti yang dijelaskan oleh
Persamaan. (2) . Perubahan laju pertumbuhan spesifik ditentukan oleh nilai
lereng ( Sebuah). Nilai ini dipilih sesuai dengan perubahan yang diinginkan
di ( t)
(Eq. (6) ). Untuk ini, tingkat produksi biomassa teoritis ( r x) ( Eq. (4) ) Dibagi
dengan terintegrasi r x ( Eq. (5) ). Untuk perencanaan umpan curah dengan
mendekati r x ( t), lebih rendah hasil biomassa-ke-substrat pada tingkat
pertumbuhan tertentu yang lebih rendah tidak diperhitungkan.
r x t F t w di Y x = s
x Vt x 0 V 0 t t0r x t
dt
t r x t
x Vt
Sebuah peningkatan linear profil umpan curah dimulai setelah waktu
adaptasi beberapa jam pada tingkat yang konstan rendah. Waktu
ketergantungan budidaya, serta densitas sel, juga dipertimbangkan dalam
desain profil pakan sebagai rentang dipelajari berulang kali (di kedua
peningkatan dan penurunan arah). Kedua durasi percobaan dan jumlah
pengulangan dari fase dengan peningkatan dan penurunan tingkat
pertumbuhan tertentu yang secara teknis dibatasi oleh pasokan oksigen dan
peningkatan maksimum volume. Hanya menurun profil linear yang layak pada
konsentrasi biomassa yang tinggi.
Pengukuran data budidaya online dan offline
Pengukuran dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Hyka et al.
( 2010 ). Tekanan parsial relatif oksigen (pO 2) dalam medium, konsentrasi
dari kedua CO 2 dan O 2
dalam gas buang (diperpanjang gas analyzer proses; Aman Sel
sebelumnya Biospectra AG, Schlieren, Swiss), pH, temperatur,
overpressure reaktor dan berat reaktor semua dipantau secara online.
Konsentrasi biomassa ditentukan secara gravimetri sebagai CDW. Sampel
disentrifugasi selama 5 menit pada 13.000 rpm (5415R, Eppendorf,
Hamburg, Jerman) dalam pra-ditimbang 2-ml tabung Eppendorf yang telah
dikeringkan sampai berat konstan pada suhu 105 C (Heraeus Instrumen,
Zurich, Swiss). Konsentrasi gliserol dan metabolit lainnya ditentukan
dengan kromatografi tekanan tinggi cairan (HPLC) menggunakan
perangkat LC-20AB dilengkapi dengan autosampler SIL-20A, kolom
thermostated oven CTO-20A dan refraktometer detektor RID-10A (semua
diproduksi oleh Shimadzu). Kolom Aminex HPX-87H, dengan diameter (id)
dari 7,8 mm (Bio-Rad, Munich, Jerman), dijalankan pada 40 C pada laju
alir 0,6 ml min - 1 di bawah kondisi isokratik, dengan 2,5 mmol H 2 BEGITU 4 dan
volume injeksi 25 l.
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
Analisis data
konsentrasi biomassa
konsentrasi biomassa diberikan sebagai berat kering sel gram per liter
kaldu budaya (suspensi). Kegiatan produk, konsentrasi protein total dan
konsentrasi gliserol dinyatakan per liter dari supernatan. Untuk perhitungan
nilai diturunkan, semua konsentrasi yang dikalikan dengan volume yang
sesuai (baik total volume kaldu atau volume supernatan).
4
tarif spesifik dan koefisien yield
5
Untuk tahap budidaya dengan laju pertumbuhan spesifik konstan, nilai integral
untuk spesifik koefisien laju pertumbuhan dan hasil diperkirakan dengan regresi
6
linier. tingkat pembentukan produk tertentu diperoleh dengan perkalian dari hasil
produk-to-biomassa oleh laju pertumbuhan spesifik yang sesuai. Kesalahan bar
menunjukkan 95% confidence interval diperkirakan dengan regresi linier. kursus
saat tingkat konversi tertentu dihitung berdasarkan data merapikan menggunakan
mode kuat algoritma Loess (Software Igor Pro; WaveMetrics, Lake Oswego, OR,
USA). Setiap fase pertumbuhan yang dihaluskan secara terpisah, kursus waktu
merapikan yang disajikan bersama-sama dengan data mentah.
Perhitungan karakteristik biomassa dari data secara online
Waktu tentu saja produktivitas biomassa teoritis r x di gram biomassa dihitung dengan
karbon menyeimbangkan data online yang tersedia sesuai dengan Persamaan. (7) .
r x t r s - r BERSAMA 2 wx= C 7
tingkat produksi karbon dioksida, karbon gram per jam ( r CO2), dikurangkan
dari substrat tingkat mengambil-up, karbon gram per jam ( r s). Tingkat yang
dihasilkan (karbon h - 1) dikalikan dengan rasio biomassa karbon 2,11 gCDWper
gram karbon ( w x / c), yang berasal dari komposisi biomassa unsur CH 1,665 N 0,134 HAI
0,602 S 0,0039 ditentukan oleh Carnicer et al. ( 2009 ) Untuk Fab mengekspresikan P.
pastoris ketegangan. Untuk mendapatkan biomassa teoritis, r x terintegrasi dari
waktu ke waktu (Persamaan. (5) ), Dan kehilangan biomassa melalui
pengambilan sampel dianggap. kursus waktu teoritis biomassa skala untuk
offline sel diukur berat kering. Untuk fase umpan curah, yang diukur CDW ke
teoritis (dihitung) biomassa adalah dalam 100 15%.
Semua angka diciptakan dengan Igor software Pro (WaveMetrics, Lake
Oswego, OR, USA).
kegiatan CALB
aktivitas hidrolitik dari CALB dikuantifikasi dengan menggunakan
spektrofotometri yang p- nitrophenylbutyrate (PNBP) assay (Morawski et al. 2000 ).
Dalam 96-baik piring mikro, 180 l substrat
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176 3167

solusi ditambahkan ke 20 l dari supernatan kultur diencerkan dan dikocok Metode untuk memperkirakan kisaran yang tepat dari tingkat pertumbuhan tertentu di

selama 15 s sebelum rilis p- nitrophenolate diukur spektrofotometri pada 405 mana pembentukan produk yang optimal dirancang.

nm selama 5 menit pada 25 C (DTX 880, Beckman Coulter Fullerton, CA,

USA). Karena autolisis dari PNBP, larutan substrat baru dibuat untuk setiap
Pengaruh pertumbuhan biomassa dengan kelebihan gliserol pada pembentukan produk
pengukuran. Untuk 10.1 ml larutan substrat yang mengandung 4,17 mM
PNBP, 10 ml Tris / HCl penyangga (pH 8, 300 mM) dan 0,1 ml PNBP larutan
stok (468 mM dalam DMSO) yang dicampur (emulsi) ultrasonically dan
produksi CALB di bawah kendali P AOX1 Varian diteliti dalam budidaya batch
digunakan segera. supernatan sampel diencerkan di atas es dengan Tris /
dengan gliserol lebih (10 sampai 50 gl - 1). Kelebihan dari gliserol
HCl penyangga (pH 8, 300 mM) untuk mencapai peningkatan kepunahan
dipertahankan selama dua budaya berikutnya angkatan (batch A dan B)
antara
oleh pulsa gliserol (Gambar. 1 ). Batch Awas dilakukan analog dengan
percobaan batch-umpan curah dijelaskan kemudian. Sepanjang tahap
0,1 dan 0,4 per menit (hanya pengukuran sampel dengan kemiringan dalam
kedua bets (B), konsentrasi karbon dioksida dalam gas off terus meningkat
kisaran ini dianggap). Peningkatan kepunahan terdaftar lebih dari 5 menit.
hingga 40 h, menunjukkan gliserol yang selalu berlebihan. Dengan kondisi
Sebuah lereng linier dipastikan dengan hanya mengambil nilai sampai dengan
tersebut, sel-sel tumbuh pada 25 C dengan laju pertumbuhan spesifik
maksimum 2 ke rekening. Untuk penentuan aktivitas, kemiringan kosong itu
maksimum 0,15 0,01 h - 1 dan biomassa untuk gliserol hasil biomassa 1,52
dikurangi dari lereng sampel sebelum perkalian dengan faktor pengenceran
0,15 g per karbon gramof (Tabel 1 ). Selama budidaya batch dengan
sampel. Untuk p- nitrophenolate, koefisien kepunahan molar
gliserol lebih, tidak ada produk disintesis sejak aktivitas CALB tidak
terdeteksi dalam supernatan atau intraseluler (data tidak ditampilkan).
9,595 ml mol - 1 cm - 1 ( 405 nm, pH 8) digunakan. Satu unit didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang menghidrolisis 1 mol PNBP ke p- nitrophenolate
per menit pada 25 C dan pH 8. Kegiatan nilai-nilai mean dari penentuan
tiga diencerkan secara individu dinormalisasi ke standar internal dengan
faktor normalisasi. Internal standar berturut-turut (25, 20, 15, 10, 5,
pembentukan produk dalam budaya umpan curah di bawah

2,5, 0 gl - 1 bubuk lyophilised dari CALB tersedia secara komersial) diukur pertumbuhan gliserol terbatas

dengan masing-masing piring microtiter baru, dan lereng itu selaras

dengan kemiringan rata-rata 2555 U per gram lyophilised CALB tersedia Potensi promotor sintetis untuk mengontrol pembentukan produk
secara komersial (c-Lecta, Leipzig, Jerman, yang berisi 10 - protein 20% rekombinan dianggap bergantung pada gliserol
menurut
informasi disediakan oleh pabrikan ). bets (A) bets (B)

5 70

100
konsentrasi protein 60
4

)
-1
80 50
konsentrasi protein dalam supernatan kultur ditentukan dengan metode
)
-1
BERSAMA 2 (%)

gliserol pekat. (gl

Bradford menggunakan protein Quick Start 3
40
CDW (gl

60

Bradford Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). pengujian ini

30
dilakukan sesuai dengan produsen ' s petunjuk, berdasarkan protokol 2
40

lempeng tertentu dan dengan bovine gamma-globulin sebagai standar 20

protein relatif. 1
20
10

Fraksi CALB dalam kaitannya dengan total protein disekresikan ke

0
supernatan ditentukan elektroforesis kapiler bymicrofluidic (LabChip 90 0 0
- 30 - 20 - 10 30 20 10 0 40
Elektroforesis Sistem, PerkinElmer sebelumnya Caliper Life Sciences,
saat setelah fase bets inital (h)
Waltham, MA, USA).
Gambar. 1 budidaya Batch dengan gliserol lebih. Budidaya terdiri dua budaya bets
berturut-turut (fase A dan B) dengan beberapa pulsa gliserol, seperti yang ditunjukkan oleh panah.
Awal bets ( Sebuah) dilakukan pada 30 C. Setelah menyelesaikan batch ini, sejumlah

hasil
P AOX1 Varian adalah promotor baru untuk digunakan dengan P. pastoris
untuk memproduksi protein heterolog yang dapat dikendalikan tanpa
besar budaya (sekitar 1 gl - 1) dihapus dan volume diganti dengan media segar untuk
memulai batch yang B pada 1 gl - 1 CDW dan 25 C (suhu produksi). Terbatas,
pertumbuhan biomassa eksponensial dengan kelebihan gliserol selama fase bets B
ditunjukkan dengan program saat simulasi konsentrasi biomassa, diberikan sebagai baris. kursus
saat sel berat kering (CDW, konsentrasi biomassa) yang disimulasikan sesuai dengan

bymethanol induksi. Menggunakan strain mengeluarkan CALB, hubungan tahapan dan nilai-nilai yang tercantum dalam Tabel 1 . Baik aktivitas CALB atau
konsentrasi protein ditunjukkan, karena di bawah kondisi ini, tidak ada produk rekombinan
antara pembentukan produk dan pertumbuhan biomassa, serta pengaruh
disekresikan
konsentrasi gliserol eksternal, pada pembentukan produk itu dijelaskan.
Selanjutnya, efisien
 Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176

Tabel 1 Karakteristik pertumbuhan dan pembentukan produk

simbol terkait pertumbuhan eksponensial sekresi produk yang stabil

( h - 1) Waktu b ( h) n ( -) q p ( mg g - 1 h - 1) Y p / x ( mg g - 1) Waktu b ( h) n ( -)

Angka 3 umpan curah 1 0,017 0,001 22 - 68 16 0,43 0,04 c 25,5 2,0 30 - 68 14

umpan curah 2 0.038 0.001 0 - 71 15 0.93 0.06 24,6 1,3 8 - 61 13

umpan curah 3 tahap 1 0,049 0,001 0 - 41 22 1,15 0,15 23,7 3,0 5 - 19 8

tahap 2 0.40 0.06 c 8,3 1,3 19 - 39 11

Angka 2 umpan curah 4 tahap 1 0,067 0,003 2 - 40 21 1,03 0,14 15,3 2,0 6 - 23 10

tahap 2 0,44 0,03 c 6,5 0,4 23 - 38 8

umpan curah 5 0,094 0,002 0 - 25 12 0,58 0,05 c 6.1 0,5 11 - 25 11

umpan curah 6 0.115 0.004 0 - 25 12 0,48 0,07 c 4.2 0,6 11 - 25 11

Angka 1 setumpuk MAXA 0,15 0,005 6 - 33 19 ND ND 6 - 33 19

Untuk budidaya
tercantum dalamumpan
Tabelcurah berbeda
1 (Umpan dengan
curah penambahan gliserol eksponensial pada 25 C, fase kedua laju pertumbuhan spesifik konstan ( ) dan produksi ( q p) diidentifikasi. Nilai untuk sekresi produk yang stabil
1) 3168
didasarkan pada total protein (disekresikan) yang berkorelasi dengan aktivitas enzim. Kesalahan dari nilai yang dihitung ditampilkan sebagai interval kepercayaan 95%

ND tidak terdeteksi, n jumlah nilai-nilai pengukuran

Sebuah Mengulangi fase budidaya bets B

b Waktu awal setelah fase bets awal

c tingkat basal q p 0,4-0,6 mg g - 1 h - 1 menjadi independen dari

tersedianya. Percobaan budidaya untuk menunjukkan kontrol pembentukan tingkat pertumbuhan tertentu dikendalikan oleh laju penambahan spesifik
perjalanan waktu konsentrasi produk simulasi sesuai dengan tahapan dan nilai-nilai yang
produk terdiri dari fase angkatan awal diikuti oleh dua tahap umpan curah dengan substrat ( q s).
dua tingkat pertumbuhan tertentu yang berbeda (Gambar. 2 ). Gliserol Sebagian besar biomassa diproduksi selama batch awal dan fase umpan
ditambahkan selama budidaya umpan curah segera digunakan ke <1 gl - 1, dan curah pertama. Fokus dari umpan curah kedua adalah pada pembentukan
dengan demikian, produk. Produksi dimulai selama fase umpan curah pertama. Setelah fase umpan
curah kedua, pada 68 jam,
setumpuk umpan curah 4.2 gl - 1 CALB diukur dalam supernatan kultur (Gambar. 2 ), Sesuai dengan
)
-1

5000 30 kegiatan dari 83.000 U l - 1.

pembentukan produk di bawah P AOX1 promotor varian dikendalikan oleh
gliserol pekat. (gl

100
25
umpan4000 substrat (gliserol) ketersediaan. Dengan mengubah antara gliserol kelebihan dan
)

curah. Tahap pembentukan produk konstan ( q p) diindikasikan oleh garis tipis, sesuai dengan
-1

80
20
keterbatasan gliserol, pembentukan produk bisa dinyalakan dan dimatikan tanpa
)
-1

menggunakan metanol sebagai inducer.

conc protein. (Mg l

3000
CDW (gl

60
15
)

2000
-1

40 10
pakan tingkat (gC h

1000
20
- Ketergantungan pembentukan produk rekombinan
5

0 0 0 Hubungan antara tingkat tertentu pembentukan produk disekresikan (CALB) dan

curah kedua terutama untuk
- 20 membangun produk),
0 dengan
20 produksi
40 enzim aktif 60
selama kedua fase
laju pertumbuhan spesifik diselidiki dalam upaya konseptual dengan beberapa
waktu umpan curah (h)
budidaya umpan curah eksponensial di berbagai pre-set nilai-nilai dan dengan
Gambar. 2 Kinerja P sintetis AOX1 varian dalam budaya umpan curah. Konsentrasi bertekad
gliserol sebagai sumber karbon dan energi tunggal (Gambar. 3 , Meja 1 ).
ditampilkan sebagai simbol, dan kursus waktu simulasi yang diberikan sebagai baris. Budidaya
terdiri tahap-tahap berikut: Setelah fase angkatan awal dengan lebih dari gliserol, larutan umpan
bets: unlimited, pertumbuhan biomassa eksponensial pada 25 C dengan kelebihan gliserol ditambahkan pada tingkat eksponensial meningkat. Dalam semua budidaya
menghasilkan tingkat pertumbuhan spesifik maksimum 0,15 h - 1; umpan curah, gliserol terus ditambahkan dimanfaatkan segera dan konsentrasi
pembentukan enzim CALB aktif itu ditekan umpan curah: Pertumbuhan biomassa carbonlimited dengan
penambahan eksponensial dari gliserol (laju umpan ditunjukkan oleh garis tebal) untuk mendukung tingkat
gliserol sisa adalah 1 gl - 1 ( Ara. 3 c), mengemudi tingkat pertumbuhan tertentu
pertumbuhan tertentu rata-rata 0,09 h - 1 pre-set pada nilai konstan selama setiap budidaya. nilai-nilai from0.017 ke
(Tahap pertama umpan curah terutama untuk meningkatkan biomassa) dan 0,017 h - 1 ( fase umpan 0.115 h - 1 diselidiki. Fase pertumbuhan eksponensial (dengan konstan ) diidentifikasi
oleh regresi linier dari data biomassa (Gambar. 3 a, b, nilai-nilai yang diberikan
pada Tabel 1 ). Untuk semua
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176 3169

setumpuk umpan curah setumpuk umpan curah

Sebuah b
100

80
)
-1

ln CDW (-)
60
CDW (gl

40 5

20
4

25

c 1400 d
20
1200
tahap 2

)
)

-1
-1

1000
15

conc protein. (Mg l

gliserol pekat. (gl

800

10 600
tahap 1
400
5

200

0 0

- 10 50 40 30 20 10 0 60 - 10 50 40 30 20 10 0 60

waktu umpan curah (h) waktu umpan curah (h)

Gambar. 3 budidaya umpan curah di berbagai pre-set nilai-nilai, karena selain pakan konsentrasi (grafik Sebuah) dan konsentrasi produk (grafik d) diberikan sebagai
eksponensial. simbol dan budidaya yang sesuai didefinisikan dalam Tabel 1 . Konstan tingkat baris. kursus waktu disimulasikan sesuai dengan tahapan dan nilai-nilai ditentukan sebagaimana
pertumbuhan tertentu mulai from0.038 ke 0.115 h - 1
tercantum dalam Tabel 1 . baris dalam grafik b mewakili regresi linear, sedangkan lereng sesuai
didukung selama lima budidaya umpan curah individu, masing-masing dengan penambahan dengan laju pertumbuhan spesifik konstan
eksponensial dari gliserol. Fase pertumbuhan konstan ( ) dan pembentukan produk ( q p) ditunjukkan
dengan kursus waktu simulasi biomassa

nilai-nilai diuji, konsentrasi produk dalam supernatan terus meningkat
antara 5 dan 11 jam setelah awal dari budidaya umpan curah (Gambar. 3 d).
Fase sekresi produk yang stabil diidentifikasi oleh penetapan suku sekresi
spesifik rata-rata ( q p), yaitu jumlah produk yang dikeluarkan per gram
biomassa per jam (Tabel 1 ).
sekresi produk pada tingkat pertumbuhan spesifik rendah
0,038 0,001 h - 1 stabil selama 53 jam (Tabel 1 , Umpan curah 2). Untuk budidaya umpan curah
Tingkat (ditentukan oleh CDW) adalah konstan selama seluruh fase umpan curah
(Gambar. 3 b).
Berdasarkan data tersebut, kinetika pembentukan CALB q p ( )
dengan gliserol sebagai sumber karbon dan energi tunggal didirikan (Gambar. 4 Sebuah).
Setiap simbol dalam hubungan ini merupakan nilai rata-rata yang diperoleh dari
budidaya umpan curah individu (Gambar. 3 , Meja 1 ). Hubungan ini
mengungkapkan, sekresi produk yang stabil tinggi 0,93 0,06 mg g - 1 h - 1 untuk
tingkat pertumbuhan spesifik dari 0.038 h - 1 ( Ara. 4 ). Untuk budidaya umpan

dengan tingkat pertumbuhan spesifik yang lebih tinggi, q p
nilai-nilai yang tidak stabil selama fase produksi secara keseluruhan dan dua
fase konstan q p dibedakan (Gambar. 3 d, Table 1 ). pertumbuhan sel dari 0,067
0,003 h - 1 menghasilkan pembentukan produk tertentu konstan 1,03 0,14
mg g - 1 h - 1 untuk 23 jam pertama (tahap 1, sesuai dengan 19,1 U g - 1 h - 1).
Setelah itu, pembentukan produk berkurang 57% ke level konstan 0,44 0,03
mg g - 1 h - 1 ( fase 2). Sebuah efek yang sebanding ditemukan untuk dari 0,049
0,001 h - 1 ( Meja 1 , Umpan curah 3). perubahan dalam kinerja produksi ini tidak
dapat dikaitkan dengan perubahan dalam pertumbuhan sejak pertumbuhan
spesifik
curah dengan dari 0,049 dan 0,067 h - 1, dua fase produksi yang berbeda
ditentukan. Awalnya, tinggi tetapi sementara tingkat sekresi 1,03-1,15 mg g - 1 h - 1 diamati,
sebanding dengan stabil dan masih cukup tinggi, tingkat sekresi ditemukan
ketika sel-sel yang tumbuh pada = 0.038 h - 1. Menariknya, tingkat basal q p nilai
antara 0,4 dan 0,6 mg g - 1 h - 1 ditemukan untuk pertumbuhan lambat pada 0,017 h -
1 serta untuk tahap kedua dari fedbatches 3 dan 4 ( dari 0,049 dan 0,067 h - 1) dan
untuk pertumbuhan cepat ( dari 0,094 dan 0,115 h - 1; Ara. 4 , Meja 1 ). Dengan
demikian, tingkat basal besar> 0,4 mg g - 1 h - 1 CALB yang
3170
Sebuah umpan curah
1.4
tahap 1
h )
-1
1.2
-1
1.0
Tingkat sekresi khusus (mg g
0,8
0,6
0,4
tahap 2
0,2
0.0
0.00 0,04 0,08
laju pertumbuhan spesifik (h
Gambar. 4 pembentukan produk rekombinan dalam kaitannya dengan laju pertumbuhan spesifik.
simbol dan budidaya yang sesuai didefinisikan dalam Tabel 1 . Sebuah CALB sekresi kinetika.
Setiap simbol dalam hubungan ini merupakan nilai rata-rata yang diperoleh dari budidaya
individu, baik yang didirikan selama kultivasi gliserol-terbatas (umpan curah) atau kelebihan
gliserol (batch, segitiga terbuka sebesar 0,15 h - 1 sebagai laju pertumbuhan spesifik maksimum
0,15 h - 1).
Menurut didirikan q p ( ) hubungan, kisaran produksi optimum adalah 0,04 h - 1 ( dicapai pada 27%
dari laju pertumbuhan spesifik maksimum) dan ditandai oleh garis vertikal. Pergeseran dari
pembentukan produk awal yang tinggi (tahap 1) diikuti oleh lebih rendah tetapi juga stabil
tahap kedua
independen disekresikan dari mulai 0,017-0,115 h - 1.
Stabil q p nilai-nilai yang lebih tinggi dari tingkat basal ini ditentukan selama
budidaya umpan curah di sekitar 0.038 h - 1, sesuai dengan 25% dari max. sementara
lebih tinggi q p nilai-nilai dari tingkat basal ini ditentukan selama budidaya umpan
curah pada tingkat pertumbuhan spesifik yang lebih tinggi 0,049-0,067 h - 1.
Untuk membandingkan hasil dari strain diselidiki dalam penelitian ini dengan
data yang diterbitkan dalam literatur, tingkat sekresi juga dihitung sebagai
konsentrasi protein berkorelasi dengan aktivitas enzim (Gambar. 4 b). Untuk
budidaya umpan curah, CALB aktivitas enzim meningkat dengan konsentrasi
protein dalam supernatan. Namun, korelasi itu lebih baik untuk budidaya durasi
pendek di mana konsentrasi protein yang lebih rendah dicapai. Kegiatan CALB
tertentu, ditentukan sebagai rata-rata semua budidaya umpan curah dengan
penambahan gliserol eksponensial, adalah 19,3 0,8 UMG - 1 protein. Lebih dari
98% dari total protein disekresikan selama fase produksi adalah CALB
(ditentukan untuk umpan curah 1 dan umpan curah 2).
desain eksperimen pergeseran budaya umpan curah
Hubungan antara pembentukan produk dan laju pertumbuhan spesifik adalah
dasar untuk desain yang rasional untuk proses produksi umpan curah. Untuk
membangun yang diinginkan q p ( ) hubungan, sebuah umpan curah tunggal
dilakukan bukan banyak budidaya umpan curah melelahkan di setiap ditetapkan
nilai. Dalam pendekatan baru kemudian, bervariasi secara dinamis dalam satu
percobaan (pendekatan dinamis), sedangkan untuk didirikan
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
setumpuk b
30x10 3
25
)
-1
20
Kegiatan CALB (U l
15
10
5
0
0,12 0,16 1200 800 400 0 1600
-1 -1
) konsentrasi protein (mg l )
(Fase 2) ditunjukkan dengan panah. Basal tingkat sekresi spesifik 0,4 untuk
0,6 mg g - 1 h - 1 ditunjukkan oleh daerah yang teduh. kesalahan bar menunjukkan interval
kepercayaan 95%. b Kegiatan CALB dalam supernatan diberikan sebagai fungsi dari
konsentrasi protein dalam supernatan budaya. Kegiatan produk diukur sebagai aktivitas
hidrolitik (PNBP) dalam uji spektrofotometri, dan konsentrasi protein ditentukan dengan
metode Bradford. Linear kemiringan setara dengan aktivitas CALB spesifik
19,3 0,8 U mg - 1. Kesalahan dinyatakan sebagai interval kepercayaan 95% (tidak terlihat dalam skala
tertentu,) dan band prediksi ditampilkan sebagai garis putus-putus
Pendekatan (kedua), tingkat pertumbuhan spesifik konstan dipertahankan selama
seluruh percobaan umpan curah.
Dalam percobaan umpan curah tunggal, dengan sistematis memvariasikan laju
pertumbuhan spesifik, kisaran produksi di bawah 50% dari
max berulang kali diuji (Gambar. 5 ). Terus ditambahkan gliserol
dimanfaatkan segera, dan dengan demikian, konsentrasi gliserol sisa
adalah 1 gl - 1 ( untuk semua fase B1 - B5). Oleh karena itu pertumbuhan
dikontrol oleh laju penambahan gliserol (yang sesuai dengan q s) selama
seluruh budidaya umpan curah. Selama fase adaptasi awal 18 h (B1) dan
fase menengah 4 h (B3), tingkat penambahan substrat dipertahankan pada
tingkat yang konstan (Gambar. 5 Sebuah). Selama berikut
' diagnostik ' fase (masing-masing 12 jam, Gambar. 5 a), tingkat penambahan
substrat meningkat (fase B2 dan B4) dan kemudian secara linear menurun (fase
B5). Dengan meningkatkan linier atau menurunkan gliserol tingkat Selain pakan,
tingkat pertumbuhan tertentu yang dinamis bergeser selama periode ini sementara
sel-sel penuaan terakumulasi dalam kapal bioreaktor dan konsentrasi biomassa
meningkat (Gambar. 5 b). Karena ketersediaan substrat, profil pakan linear
mengakibatkan tingkat pertumbuhan tertentu berubah secara sigmoidal. Oleh
karena itu konsentrasi biomassa meningkat terus, tapi laju pertumbuhan spesifik
berubah antara 0.004 dan
0,074 h - 1. Selama fase B1, B2 dan B4, laju pertumbuhan spesifik meningkat,
sedangkan penurunan selama fase B3 dan B5. dinamis pergeseran juga
digambarkan dalam sinyal secara online karbon dioksida di off gas (Gambar. 5 Sebuah).
Menggunakan set-up, beberapa yang berbeda nilai diselidiki selama percobaan
tunggal.
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176 3171

B1 B2 ( ) B3 B4 ( ) B5 ( ) 0,06

)
-1
h
50 1.2

-1
Sebuah 0,05
1.0
40
)
-1

spesifik tingkat substrat serapan (gC g

0,8 0,04

BERSAMA 2 (%)
pakan tingkat (gC h

30
B5
0,6
0,03
20

0,4
0.02
10
0,2
B4
0.01
0 B2

100 0,08 0.00

b 0.00 0.02 0,04 0,06 0,08

)
-1

-1
80 laju pertumbuhan spesifik (h )
0,06
laju pertumbuhan spesifik (h Gambar. 6 Karakterisasi pertumbuhan dengan menerapkan perubahan dinamis untuk laju
)
-1

pertumbuhan spesifik. Untuk kursus waktu yang ditentukan pada setiap tahap karakterisasi (B2,
60
B4 dan B5) dari pergeseran percobaan (Gambar. 5 b), nilai-nilai tingkat substrat serapan
CDW (gl

0,04 tertentu diplot terhadap nilai-nilai pasangan yang sesuai dari laju pertumbuhan spesifik. Nilai-nilai
yang berasal baik dari data offline ( lingkaran) atau dari biomassa konsentrasi dihitung dengan
40
karbon secara online balancing ( baris). Arah Perubahan pada setiap tahap diindikasikan oleh panah,
penunjukan fase dan sesuai simbol. Dengan regresi linier, berarti tingkat pemeliharaan tertentu ( m
0.02
s) ditentukan dari nilai-nilai secara offline sebagai y intercept sumbu (0,0031 0,0008) gC g - 1 h - 1
20

0 0.00 dan ditunjukkan oleh garis putus-putus

50 40 30 20 10 0 60

waktu umpan curah (h)

Gambar. 5 Desain umpan curah untuk eksperimental melakukan pergeseran. Profil pakan
(grafik Sebuah) dan pertumbuhan biomassa (grafik b) ditampilkan untuk satu yang dipilih bergeser
percobaan. Setelah budidaya bets awal (fase A, tidak ditampilkan), tingkat penambahan gliserol
bervariasi secara sistematis selama umpan curah (beberapa fase B). Fase dengan mengubah
tingkat pertumbuhan tertentu (B2, B4, B5) untuk menyelidiki kinerja budaya di berbagai ( yaitu
screening untuk q p) dan fase adaptasi (B1, B3) dibedakan. Offline nilai yang terukur diberikan
sebagai simbol. Waktu perjalanan laju pertumbuhan spesifik (grafik b, putus-putus area) berasal
dari konsentrasi biomassa, yang dihitung oleh karbon balancing (grafik b, garis hitam)
0,0047 0,0001 gC g - 1 h - 1, masing-masing. Tingkat pemeliharaan khusus adalah
sekitar 2,5 kali lebih tinggi untuk tahap terakhir, B5, daripada untuk tahap pertama
(yaitu semua perhitungan berdasarkan data online yang sangat sering).
Berdasarkan data offline, m s nilai untuk fase yang berbeda tidak berbeda nyata
(dalam interval kepercayaan 95%). Themean tingkat penyerapan substrat yang
spesifik untuk pemeliharaan sel dihitung dari nilai-nilai secara offline dari ketiga
fase adalah 0,0031 0,0008 gC g - 1 h - 1.

Karakterisasi sekresi produk dengan eksperimen pergeseran

Potensi pendekatan yang dinamis untuk menggantikan padat karya

Pengaruh peningkatan konsentrasi biomassa dan waktu budidaya (atau usia karakterisasi strain didirikan dan untuk mempercepat penentuan q p ( ) Hubungan
sel) pada pertumbuhan biomassa diuji dengan mendirikan q s ( ) hubungan selama dievaluasi dalam tiga identik eksperimen pergeseran menggunakan
tiga pergeseran fase dari data budidaya umpan curah dinamis (data mentah gliserol sebagai sumber karbon dan energi tunggal.
yang diberikan pada Gambar. 5 ). Untuk semua tiga fase (B2, B4, B5), laju
pertumbuhan spesifik diikuti peningkatan dan penurunan serapan substrat pertumbuhan sel diikuti perubahan dinamis dalam jumlah tambahan substrat
tertentu (Gambar. 6 ). Pertama fase pergeseran, B2, menunjukkan serapan per gram biomassa. Jumlah produk yang disekresikan (CALB) juga dipengaruhi
substrat awal lebih rendah dari tahap-tahap berikut, B4 dan B5. Penyerapan oleh perubahan dinamis dalam kondisi pertumbuhan (Gambar. 7 ). Perubahan
substrat tanpa pertumbuhan biomassa (yaitu intercept pada y axis) sesuai dengan yang diulang dalam ketersediaan substrat dalam satu budidaya tunggal
tingkat penyerapan substrat yang spesifik untuk pemeliharaan sel ( m s) di gC g - 1 h - 1 menunjukkan efek pada jumlah produk yang disekresikan (aktivitas CALB dalam
( Ara. 6 ). Selama tiga fase pergeseran konstitutif B2, B4 dan B5, supernatan). Selama tiga yang berbeda menggeser eksperimen dengan sama
eksperimental set-up, q p Data yang buruk direproduksi dalam nilai numerik
mutlak.
m s nilai-nilai meningkat 0,0019 0,0001, 0,0029 0,0001 dan
3172 Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176

B1 B2 ( ) B3 B4 ( ) B5 ( )
tingkat sekresi produk (Gbr. 7 b - d) dan ditunjukkan dengan anak panah.
50x10 3
Penurunan tingkat sekresi khusus diamati untuk semua tiga percobaan
Sebuah
menjelang akhir fase B2 pada tingkat pertumbuhan spesifik yang tinggi.
40 Mengukur aktivitas CALB mengalami stagnasi, dan berasal q p nilai-nilai
)
-1

menurun sebelum penambahan substrat tiba-tiba berkurang pada awal fase

30 B3. Pada akhir fase B3 menengah dan pada awal meningkat Selain substrat
Kegiatan CALB (U l

(dan ) selama fase B4, produk yang dikeluarkan meningkat secara

20 substansial tetapi segera (setelah sekitar 3 jam) meningkat lagi untuk semua
tiga percobaan. Tahap B4, dengan meningkatnya laju pertumbuhan spesifik,
adalah pengulangan fase B2, yang penurunan sekresi produk tertentu juga
10
diamati. Menariknya, setelah terus menurun laju umpan pada awal fase
terakhir, B5, semua tiga percobaan kembali menunjukkan tajam
0
meningkatkan aktivitas produk dan akibatnya meningkatkan tingkat sekresi
25
b produk tertentu.
20
15
10
5 diukur konsentrasi / kegiatan produk dan waktu disekresikan kursus yang

0 berbeda untuk eksperimen individu (masing-masing pada konstan ), tetapi

spesifik tingkat sekresi CALB (U g- 1 h- 1)

25 kecenderungan umum dalam mengubah tingkat sekresi tertentu, seperti yang dipicu
c
20 dengan mengubah tingkat pakan dan laju pertumbuhan spesifik, yang direproduksi;
15 penurunan tingkat pakan (dan dengan demikian laju pertumbuhan spesifik)
10
menunjukkan efek sebaliknya pada q p sebagai peningkatan harga pakan selama
5
fase B2 dan B4. Meskipun sekresi produk dipengaruhi oleh perubahan dinamis
0
dalam kondisi pertumbuhan, kursus waktu
25
d
20
q p yang sangat sensitif, yang memungkinkan direproduksi q p ( ) hubungan yang akan
15
didirikan dari percobaan yang berbeda. Sebagian besar dari q p nilai-nilai, sebagaimana
10
5 ditentukan oleh pendekatan dinamis, sebanding dengan tingkat basal ditentukan di

0 tempat lain (daerah yang diarsir pada Gambar. 4 dan 7 ). Berbeda dengan budidaya
50 40 30 20 10 0 60 umpan curah tunggal dengan penambahan pakan eksponensial, di mana tingkat

waktu umpan curah (h) sekresi spesifik ditentukan sebagai rata-rata selama periode waktu jelas lagi beberapa

jam, dalam percobaan yang dinamis, q p ( t) mencerminkan perubahan langsung (Gbr. 7 b),
Gambar. 7 Saring dan karakterisasi promotor dengan bergeser percobaan. konsentrasi produk
(grafik Sebuah) dan tingkat pembentukan produk tertentu (grafik b - d) ditunjukkan selama tiga menggeser yang secara sementara lebih tinggi atau lebih rendah dari basal yang q p tingkat.
percobaan dengan setup yang sama seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5 . laju pertumbuhan
spesifik meningkat selama skrining fase B2 dan B4 dan penurunan selama fase B5. kegiatan CALB
ditampilkan sebagai simbol ( grafik Sebuah). kursus waktu aktivitas produk (ditampilkan sebagai baris dalam
grafik Sebuah) dihaluskan oleh algoritma rata-rata bergerak. Dihitung tingkat sekresi produk tertentu
Karakterisasi dinamis dari q p ( ) Hubungan diuji di sini berbeda dengan
ditampilkan dalam grafik b - d. pendekatan menggunakan beberapa budidaya tunggal umpan curah pada
tingkat pertumbuhan spesifik konstan. Hubungan antara laju pembentukan
Grafik b sesuai dengan lingkaran terbuka dan tipis garis hitam grafik Sebuah
produk tertentu dan
(Dan data ditunjukkan pada Gambar. 5 ). Grafik c sesuai dengan segitiga terbuka dan
adalah direproduksi sebagai q p berbanding terbalik dengan . Sebuah perkiraan kasar dari
garis abu-abu tebal. Grafik d sesuai dengan kotak terbuka dan garis hitam tebal. kecenderungan
umum dari perubahan q p ditunjukkan dengan panah tebal dalam grafik b - d. tingkat sekresi spesifik yang cocok kisaran untuk produksi optimum karena itu mungkin dengan secara
7,4-12,1 U g - 1 h - 1, yang sesuai dengan 0,4-0,6 mg g - 1 h - 1 ( tingkat basal didefinisikan dalam Gambar 4 signifikan mengurangi upaya eksperimental.
a), ditandai dengan daerah yang diarsir, dan y sumbu adalah skala sesuai dengan y

sumbu Gambar 4 Sebuah. q p pada tingkat pertumbuhan spesifik optimum dari 0.038 h - 1, di mana
pembentukan produk tertentu maksimum dicapai ( garis vertikal pada Gambar 4 a), diindikasikan sebagai lingkaran.

Diskusi

Pola sebanding perubahan sekresi produk itu, namun, diamati di
semua tiga pergeseran budaya: sekresi menurun menjelang akhir fase
B2 dan selama fase B4 serta sekresi meningkat pada awal fase B5
(Gambar. 7 Sebuah). Perubahan umum di semua tiga Percobaan
pergeseran juga tercermin dalam kursus waktu tertentu
Beberapa promotor untuk produksi metanol bebas dari protein rekombinan
oleh P. pastoris baru-baru ini telah dikembangkan, dan prinsip umum
peraturan oleh represi / derepresi dengan glukosa atau gliserol sebagai
satu-satunya substrat telah diteliti (Capone et al. 2015 ; Hartner et al. 2008 ;
Mellitzer et al.
2014 ; Prielhofer et al. 2013 ; Ruth et al. 2010 ; Vogl et al.
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
2016 ). Namun, sedikit yang diketahui di luar kondisi dinamis untuk menyalakan
dan mematikan untuk mengontrol ini promotor dimodifikasi menggunakan
strategi proses yang tepat. Sebuah P baru AOX1 varian, yang merupakan variasi
dari promotor d6 dijelaskan oleh Hartner et al. ( 2008 ), Adalah, untuk pertama
kalinya, ditandai komprehensif dalam penelitian ini.
Hubungan antara produksi CALB dikendalikan oleh P AOX1 varian
dan laju pertumbuhan spesifik
Untuk P AOX1 varian, represi lengkap pembentukan produk telah dicapai
selama budidaya batch dengan kelebihan gliserol, di mana konsentrasi
gliserol tetap di atas 10 gl - 1
dan aktivitas CALB terdeteksi baik dalam supernatan atau intraseluler. Prinsip
represi / derepresi diusulkan oleh Egli et al. ( 1980 ) Untuk kegiatan alkohol
oksidase asli di Hansenula polymorpha Sel-sel tumbuh dengan glukosa
berhubungan dengan laju pertumbuhan spesifik. Dalam penelitian ini, hubungan
antara tingkat sekresi CALB spesifik dan laju pertumbuhan spesifik didirikan
untuk P. pastoris tumbuh dengan gliserol bawah terbatas ( 1 gl - 1) ketersediaan
substrat dalam budaya umpan curah dan, dengan demikian, dengan ekspresi
gen dikendalikan oleh sintetis P baru AOX1
varian. Ini q p ( ) Hubungan mencerminkan keseimbangan antara berbagai
proses intraseluler sampai produk disekresikan (yaitu induksi ekspresi gen,
terjemahan, protein folding, translokasi, potensi degradasi dalam retikulum
endoplasma, fluks protein dilipat keluar dari ER dan perdagangan melalui
mesin sekretori).
Max kontra imum t sebuah t spesifikasi ificpr oduc tivityof
0.93 0.06 mg g - 1 h - 1 dicapai pada 25% dari max atau di
nilai sekitar 0.038 h - 1. Maksimum tingkat sekresi khusus di
jauh di bawah max sering ditemukan untuk sekresi protein tingkat tinggi yang
dikendalikan oleh yang kuat P AOX1 promotor diinduksi oleh methanol (Kobayashi et
al. 2000 ; Potgieter et al. 2010 ; Wu et al. 2010 ), Sedangkan sebaliknya ditemukan
untuk P CELAH- pembentukan produk dikendalikan (Looser et al. 2015 ). tingkat tertentu
P CELAH-
sekresi protein dikendalikan dengan glukosa sebagai substrat biasanya increasewith tingkat
pertumbuhan tertentu dekat dengan max ( Buchetics et al.
2011 ; Maurer et al. 2006 ; Rebnegger et al. 2014 ). Sekresi ditemukan digabungkan ke
laju pertumbuhan spesifik dan siklus sel untuk P CELAH- ekspresi diatur; untuk P CELAH- ekspresitripsinogen babi (P AOX1, campuran substrat metanol-glukosa, = 0,07 h - 1,
diatur, sekresi ditingkatkan pada tingkat pertumbuhan spesifik yang lebih tinggi, dan
pada lebih tinggi
, sebagian besar dari sel-sel berada di G2 dan M fase siklus sel (Buchetics
et al. 2011 ). Perbedaan utama antara dua sistem (P AOX1 atau P CELAH) adalah
substrat (metanol atau glukosa) dan desain regangan (yaitu diinduksi atau
promotor konstitutif).
Promotor yang sama dan kombinasi substrat cenderung memiliki pengaruh yang
lebih besar pada kinetika pembentukan produk dari kategori yang sama produk
rekombinan (Looser et al. 2015 ). analisis terbaru dari kapasitas yang keluar dari P.
pastoris pada tingkat sel tunggal menunjukkan bahwa meningkatnya jumlah salinan
gen di bawah kendali P AOX1 promotor menurunkan tingkat sekresi untuk
3173
protein dari berbagai kompleksitas, sementara peningkatan jumlah copy
tampaknya tidak jenuh kapasitas sekresi dari strain menggunakan P GAP ( Cinta et
al. 2012 ).
Selain itu, studi banding dengan 48 gen sintetis yang berbeda
codonoptimised coding untuk urutan protein yang sama dan di bawah kontrol
dari empat promotor yang berbeda (P CELAH,
P AOX1 dan dua lainnya sintetis P AOX1 varian: P en dengan produksi
ditingkatkan dengan metanol dan P des dengan transkripsi kuat karena
derepresi tanpa induksi dengan metanol) menunjukkan bahwa dosis gen
tinggi negatif dipengaruhi produksi protein (selama budidaya umpan curah)
(Mellitzer et al.
2014 ). Beberapa penulis mengusulkan kelebihan dari jalur sekresi dari sel
karena tingkat transkrip tinggi, yang dapat hasil dari promotor yang kuat,
urutan gen dioptimalkan atau dosis gen tinggi (Glick 1995 ; Hohenblum et al. 2004
; Cinta et al. 2012 ; Mellitzer et al. 2014 ). Selanjutnya, untuk ekspresi gen
heterolog di bawah kontrol dari P sintetis AOX1
Varian (P des) dan menggunakan gliserol sebagai substrat, efek negatif pada
produksi protein diamati jika dosis gen terlalu tinggi (> 4 - 9 salinan gen) (Mellitzer
et al. 2014 ). Namun, menggunakan sama P des promotor varian, efek ini lebih jelas
dengan metanol sebagai substrat dibandingkan dengan gliserol (Mellitzer et al. 2014
). Itu P. pastoris regangan digunakan dalam penelitian ini terdapat dua salinan gen
dari calB dan ditumbuhkan pada gliserol. Untuk meningkatkan kapasitas lipat,
sebuah coding gen dioptimalkan untuk protein disulfida isomerase diungkapkan di
bawah kontrol promotor yang sama seperti calB. Dengan mencapai tingkat sekresi
tertentu yang stabil sekitar
> 0,4 mg g - 1 h - 1, ini P. pastoris regangan mencapai tinggi q p nilai-nilai. tingkat sekresi
spesifik protein rekombinan sering di bawah ini
0,4 mg g - 1 h - 1 untuk P. pastoris menggunakan P AOX1 atau P GAP ( Barrigon et al. 2015 ;
Looser et al. 2015 ). Misalnya, diterbitkan tingkat sekresi tertentu (dihitung ulang pada
produk mg dibangun per berat kering g sel dan per jam) adalah 0.17mg g - 1 h - 1 dengan
glycoengineered sebuah
P. pastoris regangan memproduksi IgG1 antibodi rekombinan (P AOX1,
metanol, = 0.014 h - 1, Potgieter et al. 2010 ), 0,26 mg g - 1 h - 1
rekombinan manusia serum albumin (P AOX1, metanol,
= 0,002 h - 1, Kobayashi et al. 2000 ), 0,42 mg g - 1 h - 1 rekombinan - galaktosidase
(P AOX1, metanol, = 0,03 h - 1, Zhang et al. 2005 ) Dan 0,69 mg g - 1 h - 1 rekombinan
Paulova et al. 2012 ).
Untuk strain dalam penelitian ini, 0,4-0,6 mg g - 1 h - 1 mewakili tingkat basal
CALB sekresi, yang independen dari laju pertumbuhan spesifik diterapkan
(Gambar. 4 ). Namun, pada tingkat pertumbuhan spesifik 0,049 dan 0,067 h - 1, tingkat
produksi jauh lebih tinggi tertentu antara 1,03 dan 1,15 mg g - 1 h - 1 diamati pada
sekitar 20 jam pertama dari budidaya umpan curah. Setelah itu, tingkat
sekresi tertentu menurun 57-65% ke level basal dari 0,40-0,44 mg g - 1 h - 1 ( Meja
1 ). Ini secara sementara tinggi tetapi tidak stabil tingkat sekresi tertentu dapat
diartikan sebagai indikasi produksi terbatas atau capacitywith sekretori
meningkatkan waktu budidaya dan pada tertentu yang lebih tinggi
3174
tingkat pertumbuhan. Hal ini dapat diasumsikan bahwa transkripsi kuat dan karena
beban protein berlebih dalam jalur sekretori dapat mengakibatkan daur ulang yang
tidak efisien dengan mesin ekspor protein (Cinta et al. 2012 ), Yang lebih diucapkan
pada tingkat pertumbuhan spesifik yang tinggi dari pada yang lebih rendah. Selain
itu, salah lipat dari rekombinan konsensus manusia interferon mutan (intraseluler
dan disekresikan) pada tingkat pertumbuhan tertentu yang lebih tinggi (0,027 h - 1) denganditerapkan, tetapi tingkat penambahan substrat (dan karena itu spesifik
metanol, di bawah kendali P AOX1, Dilaporkan, sementara produk itu benar dibentuk
pada rendah
= 0,01 h - 1 ( Wu et al. 2010 ).
Penyelidikan kami tingkat pertumbuhan spesifik yang berbeda untuk P AOX1 varian P AOX1- dikontrol pembentukan produk (Dietzsch et al. 2011a ; Spadiut et al. 2013 ).
menunjukkan bahwa kinetika sekresi diamati tidak didominasi oleh peraturan
promotor melainkan oleh kapasitas produksi / sekresi. Pembentukan produk
maksimum pada jauh di bawah max ( 25% dari max), ditampilkan di sini dengan P AOX1dan Herwig ( 2014 ) Berspekulasi bahwa sel-sel dapat mengeluarkan lebih banyak
varian, lebih terkait erat dengan P AOX1- dikontrol kinetika sekresi dengan metanol
dari P CELAH- pembentukan produk dikendalikan dengan glukosa. pembentukan
produk yang tinggi pada tingkat pertumbuhan tertentu rendah adalah
menguntungkan untuk desain proses produksi umpan curah untuk produktivitas
yang tinggi (Buchetics et al. 2011 ). Secara umum, produktivitas tinggi dan titer
akhir tinggi dicapai jika penanaman terjadi pada konsentrasi biomassa yang
tinggi, untuk waktu yang lama, dan pada yang diinginkan untuk pembentukan
produk sebelum batas sistem bioreaktor tercapai (Looser et al. 2015 ).
Karakterisasi sekresi produk dengan pendekatan umpan curah
dinamis ( bergeser)
The budidaya umpan curah dinamis diuji coba dalam penelitian ini
mengungkapkan informasi tentang efek dinamis dari perubahan tingkat
pertumbuhan tertentu dan ketersediaan substrat pada sekresi produk.
Menariknya, setelah terus menurun laju umpan pada awal fase terakhir, B5
(Gambar. 7 ), Ketiga percobaan menunjukkan tajam meningkatkan aktivitas
produk dan meningkatkan tingkat sekresi produk tertentu. Penurunan terus
menerus di tingkat pakan dan laju pertumbuhan spesifik memiliki efek
sebaliknya sebagai terus meningkatkan tingkat pakan dan laju pertumbuhan
spesifik selama fase B2 dan B4. Meskipun reproduktifitas mutlak rendah
selama tiga tunggal eksperimen pergeseran dengan yang sama set-up, pola
sebanding perubahan sekresi produk diamati untuk semua tiga percobaan
dinamis (Gambar. 7 ). Sebuah respon yang unik untuk masing-masing strain
telah diamati untuk adaptasi awal untuk pemanfaatan metanol (Dietzsch et al. 2011b
menguntungkan untuk desain proses umpan curah produktivitas yang tinggi sejak
; Hesketh et al. 2013 ). Independen dari produksi aktual dari protein
rekombinan, respon stres (termasuk respon protein dilipat) ditemukan
diinduksi dalam waktu 3 jam setelah metanol berdenyut menjadi budaya
terus-menerus dengan sorbitol (Hesketh et al. 2013 ). Menurut Hesketh et al. ( 2013masa depan akan fokus pada penyempurnaan dari model dengan menyelidiki strategi
), Sel-sel tidak lagi dipamerkan stres pada tingkat transkripsi sekali
pertumbuhan yang stabil-negara telah didirikan pada kombinasi substrat baru
(metanol / sorbitol), meskipun mereka terus memproduksi rekombinan yang
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
protein. Adaptasi pemanfaatan metanol mapan tampaknya ' lebih stres ' pada
tingkat transkripsi dari produksi protein rekombinan itu sendiri. jenis respon
strain-spesifik dikaitkan dengan beralih dari substrat non-inducing (sorbitol,
glukosa atau gliserol) dengan substrat merangsang, metanol. Namun, dalam
pendekatan dinamis penelitian ini, gliserol adalah satu-satunya substrat
tingkat pertumbuhan dan fisiologi sel) berubah terus menerus.
makan berosilasi telah digambarkan sebagai memiliki efek positif pada produktivitas
Kenaikan bertahap dalam tingkat pakan digambarkan sebagai lebih menguntungkan
daripada peningkatan linear landai Selain substrat tertentu (Spadiut et al. 2014 ). Spadiut
produk ketika mereka ditantang oleh peningkatan bertahap di tingkat pakan, tapi setelah
setiap kenaikan, mereka masih punya waktu untuk beradaptasi dengan kondisi budaya.
Waktu untuk beradaptasi, bagaimanapun, adalah sulit untuk menentukan. Signaling,
menurut Almquist et al. ( 2014 ), Terjadi selama rentang skala waktu 0,001 sampai 1
detik, ekspresi gen lebih skala waktu 1 sampai 500 s, sekresi protein selama rentang 8
sampai 167min dan siklus sel selama skala waktu 0,3 sampai 28 jam. Perubahan
tingkat pertumbuhan tertentu selama budidaya umpan curah dinamis antara 0.004 dan
0.074 h - 1 berhubungan dengan waktu rata-rata siklus sel (Waktu penggandaan) dari
173,3-9,4 h. Oleh karena itu, pada setiap tahap karakterisasi dari 12 h (Gambar. 5 dan 7 ,
B2, B4, B5), waktu penggandaan terus berubah 173,3-9,4 h (untuk rata-rata biomassa).
Dalam hal perubahan ini, sampling rate yang tinggi dan / atau pengukuran online adalah
penting untuk mengevaluasi dan menafsirkan dampak terus berubah ketersediaan
substrat dan laju pertumbuhan spesifik pada fisiologi sel dan sekresi produk
rekombinan.
Meskipun diinginkan q p ( ) Hubungan tidak bisa secara akurat didirikan
oleh variasi dinamis dalam tingkat pertumbuhan tertentu dalam percobaan
umpan curah tunggal, estimasi kasar cocok rentang untuk produksi
dioptimalkan dicapai sesuai dengan q p ( ) Hubungan didirikan dari beberapa
budidaya umpan curah eksponensial. Maksimum stabil spesifik tingkat
sekresi produk ditemukan pada tingkat pertumbuhan tertentu rendah 0.038
h - 1, sesuai dengan 25% dari max.
pembentukan produk yang tinggi pada tingkat pertumbuhan tertentu rendah adalah
pembentukan produk dapat berlangsung pada diinginkan ,
untuk jangka waktu yang lama pada konsentrasi biomassa tinggi sebelum batas sistem
tercapai. Untuk mengaktifkan P baru AOX1 varian untuk mencapai titer maksimal, studi
produksi yang optimal.
Pendekatan yang lebih hemat waktu dan informatif?
Sehubungan dengan waktu-ke-themarket, proses bioteknologi masih
persaingan dengan ekstraksi yang ramah lingkungan kurang bahan hewan
atau tumbuhan atau dengan sintesis kimia.
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
perbaikan sistematis dalam metode untuk pengembangan proses
bioteknologi karena itu penting.
Pembentukan komprehensif q p ( ) hubungan untuk strain baru biasanya
terdiri dari beberapa eksperimen di berbagai pre-set nilai-nilai dan akan
membutuhkan lima kali atau lebih upaya eksperimental dari pergeseran
percobaan, di mana diubah atas seluruh jangkauan (Gambar. 5 ).
Penggunaan kondisi proses dinamis untuk cepat karakterisasi galur fisiologis
digambarkan oleh Spadiut et al. ( 2013 ) Dan Spadiut dan Herwig ( 2014 ). The
umpan curah dinamika yang berbeda pendekatan saat ini sedang dikejar bisa
memungkinkan seluruh rentang produksi q s ( dan ) untuk diselidiki dalam satu
percobaan (Capone et al. 2015 ; Spadiut et al. 2014 ; Zalai et al. 2012 ). Meskipun
kurang akurat, informasi yang diperoleh dalam satu seperti Percobaan
pergeseran berharga sebagai perkiraan pertama dari kondisi yang sesuai
sehubungan dengan laju pertumbuhan spesifik optimum untuk produksi
maksimum ( memilih). Khususnya,
memilih dapat diturunkan dari q p ( t) maxima (Gambar. 7 b - d), dan pemahaman
tentang dinamika sistem bawah berubah dapat diperoleh. Meskipun sangat
relevan, informasi terakhir pada dinamika sistem, yang mencerminkan
peningkatan kemampuan produksi (Spadiut dan Herwig, 2014 ), Akan hilang
selama percobaan umpan curah konvensional pada konstan atau terus
menerus (chemostat) budaya biasanya digunakan untuk membangun q p ( ) hubungan.
Dengan menerapkan Pendekatan pergeseran dijelaskan di sini, paradigma baru
untuk pengembangan bioproses rasional didirikan: kompleksitas Proses dan data
mentah evaluasi peningkatan, namun beban eksperimental di laboratorium
menurun.
The derepressible P baru AOX1 Varian memungkinkan produktivitas yang spesifik yang
tinggi dari protein heterolog disekresikan seperti CALB di
P. pastoris tanpa metanol induksi. Selama karakterisasi komprehensif dari
promotor baru, fase produktivitas yang stabil dan direproduksi diidentifikasi,
dan berbagai tingkat sekresi diamati dan dijelaskan. protein rekombinan
umumnya tidak diproduksi ketika ada kelebihan substrat, dan strategi
pengendalian proses yang tepat menggabungkan fase pertumbuhan
biomassa dan produksi protein karena itu layak. Menariknya, tingkat
sekresi basal yang diamati selama pertumbuhan substrat terbatas,
independen dari berbagai tingkat pertumbuhan tertentu.
Penemuan baru ini sangat signifikan karena pengetahuan dari kinetika
produksi merupakan prasyarat untuk desain proses produksi, dimana
penggunaan metanol (dan promotor AOX1 konvensional) mungkin
bermasalah. Informasi lebih lanjut tentang kontrol promotor oleh strategi
budidaya yang tepat akan maju P. pastoris sistem produksi di masa depan.
Ucapan Terima Kasih Para penulis mengucapkan terima kasih VTU Teknologi
(Raaba-Grambach, Austria) untuk menyediakan pastoris Pichia
ketegangan. Terima kasih kepada Chantal Stenger, Matthias Barmettler dan Christian Meier
untuk membantu mereka dalam melakukan budidaya jangka panjang serta Roger Fehr dan
Edith Lang untuk analisis HPLC dan siswa di lapangan Bioproses Informatika tahun 2013 dan
2014 untuk pembahasan dinamis pendekatan umpan curah. Dukungan logistik dengan Alex
3175
Mathis selama fase terakhir sebelum pengajuan versi revisi untuk cetak sangat
diakui. Terima kasih juga karena John Brooker dan Maggi Lussi Bell untuk
perbaikan bahasa dan proofreading.
Sesuai dengan standar etika
pendanaan Dasar yang terdiri dari konstruksi saring dan desain percobaan umpan
curah standar, di mana kerja yang komprehensif ini membangun, sebagian didanai oleh
Komisi untuk Teknologi dan Inovasi (CTI), Swiss, proyek CTI tidak ada. 9647,1
PFLS-LS.
Konflik kepentingan Para penulis menyatakan bahwa mereka memiliki konflik kepentingan.
persetujuan etis Artikel ini tidak berisi studi dengan peserta manusia atau hewan yang
dilakukan oleh salah satu penulis.
Akses terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Pada tr ibut ion
4.0 Int erna t iona l Li membakar kemenyan (ht tp: / / creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang
memungkinkan penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan
Anda memberikan kredit sesuai dengan penulis asli (s) dan sumber, menyediakan link ke lisensi
Creative Commons, dan menunjukkan jika perubahan yang dilakukan.
Referensi
Almquist J, Cvijovic M, Hatzimanikatis V, Nielsen J, Jirstrand M (2014)
model kinetik dalam kinerja pabrik sel bioteknologi-meningkatkan industri.
Metab Eng 24:38 - 60 Barrigon JM, Valero F, Montesinos JL (2015) A model-
macrokinetic
berdasarkan meta-analisis komparatif produksi protein rekombinan oleh pastoris
Pichia di bawah A0X1 promotor. Biotechnol Bioeng 112: 1132 - 1145
Brierley RA, Bussineau C, Kosson R, Melton A, Siegel RS (1990)
pengembangan fermentasi rekombinan pastoris Pichia mengekspresikan gen
heterolog: lisozim sapi. Ann NY Acad Sci 589: 350 - 362
Buchetics M, Dragosits M, Maurer M, Rebnegger C, Porro D, Sauer M,
Gasser B, Mattanovich D (2011) Reverse engineering sekresi protein oleh
uncoupling dari fase siklus sel dari pertumbuhan. Biotechnol Bioeng 108: 2403 - 2412
Capone S, Horvat J, Herwig C, Spadiut O (2015) Pengembangan
Strategi pakan campuran untuk rekombinan sebuah pastoris Pichia regangan memproduksi
dengan promotor de-represi. Pabrik MicroB Sel 14: Artn 101
Carnicer M, Baumann K, Toplitz I, Sanchez-Ferrando F, Mattanovich D,
Ferrer P, Albiol J (2009) makromolekul dan analisis komposisi unsur dan
metabolit ekstraseluler saldo pastoris Pichia
tumbuh pada tingkat oksigen yang berbeda. MicroB Sel Pabrik 8: Artn 65 Curvers
S, Linneman J, Klauser T, Wandrey C, Takors R (2001)
produksi protein rekombinan dengan pastoris Pichia dalam fermentasi kontinyu - Analisis
kinetik pertumbuhan dan pembentukan produk. Chem Ing Tek 73: 1615 - 1621 d ' Anjou
MC, Daugulis AJ (2001) Pendekatan rasional untuk meningkatkan
produktivitas dalam rekombinan pastoris Pichia fermentasi. Biotechnol Bioeng
72: 1 - 11
Dietzsch C, Spadiut O, Herwig C (2011a) Sebuah metode dinamis berdasarkan
tingkat substrat penyerapan spesifik untuk menyiapkan strategi makan untuk
Pichia pastoris. MicroB Sel Pabrik 10: Artn 14
3176
Dietzsch C, Spadiut O, Herwig C (2011b) Pendekatan cepat untuk menentukan
bets makan makan profil untuk rekombinan pastoris Pichia strain. MicroB Sel
Pabrik 10: Artn 85
Egli T, Vandijken JP, VeenhuisM, lebih keras W, Fiechter A (1980) Methanol
metabolisme dalam ragi - regulasi sintesis enzim katabolik. Arch Microbiol 124:
115 - 121
Glick BR (1995) beban metabolik dan ekspresi gen heterolog.
Biotechnol Adv 13: 247 - 261
Menggantung HF, Chen W, Guo MJ, Chu J, Zhuang YP, Zhang SL (2008) A
sederhana terstruktur kontrol berbasis model untuk ekspresi efisien rekombinan
prekursor babi insulin oleh Pichia pastoris. Korea J Chem Eng 25: 1065 - 1069
Hartner FS, RuthC, Langenegger D, Johnson SN, Hyka P, Lin-Cereghino
GP, Lin-Cereghino J, Kovar K, Cregg JM, Glieder A (2008) perpustakaan Promotor
dirancang untuk ekspresi gen fine-tuned di Pichia pastoris. Asam Nukleat Res 36
(12): Artn 76
Hellwig S, Emde F, Raven NP, Henke M, van Der Logt P, Fischer R
(2001) Analisis produksi antibodi rantai tunggal di pastoris Pichia menggunakan
on-line control metanol dalam makan-batch dan fermentasi mixedfeed. Biotechnol
Bioeng 74: 344 - 352 Hesketh AR, Castrillo JI, Sawyer T, Archer DB, Oliver SG
(2013)
Investigasi respon fisiologis Pichia (Komagataella) pastoris GS115 untuk
ekspresi heterolog protein yang gagal melipat menggunakan budaya chemostat.
ApplMicrobiol Biotechnol 97: 9747 - 9762 Hohenblum H, Gasser B, Maurer M, Borth
N, Mattanovich D (2004)
Efek dari dosis gen, promotor, dan substrat pada stres protein dilipat
rekombinan Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng 85: 367 - 375
Hyka P, Zullig T, Ruth C, Looser V, Meier C, Klein J, Melzoch K, Meyer
HP, Glieder A, Kovar K (2010) Gabungan penggunaan pewarna fluorescent dan aliran
cytometry untuk mengukur keadaan fisiologis pastoris Pichia selama produksi protein
heterolog dalam kepadatan sel yang tinggi budaya makan-batch. Appl Lingkungan
Microbiol 76: 4486 - 4496 pedoman Invitrogen proses fermentasi (2002) Pichia. https: //
alat.
thermofisher.com/content/sfs/manuals/pichiaferm_prot.pdf
Diakses 26 Desember 2016
Jungo C, Rerat C, Marison IW, von Stockar U (2006) char- Kuantitatif
acterization dari regulasi sintesis oksidase alkohol dan dari ekspresi avidin
rekombinan dalam pastoris Pichia Mut + regangan. Enzym MicroB Technol 39:
936 - 944
Khasa YP, Khushoo A, Srivastava L, Mukherjee KJ (2007) stud- Kinetic
ies ekspresi konstitutif manusia granulocyte-macrophage colony stimulating factor
(HGM-CSF) dalam budaya terus menerus Pichia pastoris. Biotechnol Lett 29: 1903 - 1908
Kobayashi K, Kuwae S, Ohya T, OHDA T, Ohyama M, Tomomitsu K
(2000) sekresi tingkat tinggi serum manusia rekombinan albumin oleh
fermentasi makan-batch ragi methylotrophic, Pichia pastoris, berdasarkan
strategi metanol makan optimal. J Biosci Bioeng 90: 280 - 288
Kovar K, Looser V, Hyka P, Merseburger T, Meier C (2010) rekombinan
teknologi ragi di tepi pemotongan: alat yang kuat untuk kedua katalis dirancang
dan biologi baru. Chimia 64: 813 - 818 Looser V, Bruhlmann B, Bumbak F, Stenger C,
Costa M, Camattari A,
Fotiadis D, Kovar K (2015) strategi Budidaya untuk meningkatkan produktivitas Pichia
pastoris: review. Biotechnol Adv 33: 1177 - 1193 Cinta KR, Politano TJ, Panagiotou V,
Jiang B, Stadheim TA, Love JC
(2012) analisis-sel tunggal sistematis pastoris Pichia mengungkapkan produktivitas
batas kapasitas sekretori. PLoS One 7: e37915 Maurer M, Kuehleitner M, Gasser B,
Mattanovich D (2006) Versatile
pemodelan dan optimasi proses batch yang makan untuk produksi protein
heterolog disekresikan dengan Pichia pastoris. Pabrik MicroB Sel 5: Artn 37
Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101: 3163 - 3176
Mellitzer A, Ruth C, Gustafsson C, WelchM, Birner-Grunberger R, Weis
R, Purkarthofer T, Glieder A (2014) Sinergis modular promotor dan gen optimasi
untuk mendorong sekresi selulase oleh pastoris Pichia
melampaui benchmark yang ada. J Biotechnol 191: 187 - 195 Morawski B, Lin ZL,
Cirino PC, Joo H, Bandara G, Arnold FH (2000)
ekspresi fungsional dari horseradish peroxidase di Saccharomyces cerevisiae dan Pichia
pastoris. Protein Eng 13: 377 - 384 Naatsaari L, Mistlberger B, Ruth C, Hajek T, Hartner
FS, Glieder A
(2012) Penghapusan dari pastoris Pichia KU70 homolog memfasilitasi generasi
platform regangan untuk ekspresi gen dan biologi sintetis. PLoS One 7: e39720
Ohya T, Ohyama M, Kobayashi K (2005) Optimalisasi serum manusia
produksi albumin dalam ragi methylotrophic pastoris Pichia oleh diulang fermentasi
fed-batch. Biotechnol Bioeng 90 (7): 876 - 887 Paulova L, Hyka P, Branska B, Melzoch
K, Kovar K (2012) Penggunaan
campuran glukosa dan metanol sebagai substrat untuk produksi tripsinogen rekombinan
dalam budaya terus menerus dengan pastoris Pichia
Mut (+). J Biotechnol 157: 180 - 188 Potgieter TI, Kersey SD, Mallem MR, Nylen
AC, d ' Anjou M (2010)
kinetika ekspresi antibodi pada glycoengineered Pichia pastoris.
Biotechnol Bioeng 106: 918 - 927
Prielhofer R, Maurer M, Klein J, Wenger J, Kiziak C, Gasser B,
Mattanovich D (2013) Induksi tanpa metanol: diatur Novel promotor
memungkinkan ekspresi tingkat tinggi di Pichia pastoris. Pabrik MicroB Sel 12:
Artn5
Rebnegger C, Graf AB, Valli M, Steiger MG, Gasser B, Maurer M,
Mattanovich D (2014) Dalam Pichia pastoris, Tingkat pertumbuhan mengatur sintesis
protein dan sekresi, kawin dan respon stres. Biotechnol J 9: 511 - 525
Ruth C, Zuellig T, Mellitzer A, Weis R, Looser V, Kovar K, Glieder A
(2010) Jendela produksi Variabel untuk tripsinogen babi mempekerjakan
sintetis varian promotor diinduksi di Pichia pastoris.
Syst Synth Biol 4: 181 - 191
Spadiut O, Herwig C (2014) Dinamika dalam pengembangan bioproses untuk
Pichia pastoris. Buatan 5: 401 - 404 Spadiut O, Rittmann S, Dietzsch C, Herwig
C (2013) proses Dinamis
kondisi dalam pengembangan bioproses. Eng Hidup Sci 13:88 - 101 Spadiut O, Zalai
D, Dietzsch C, Herwig C (2014) compar- Kuantitatif
Ison profil makan fisiologis yang dinamis untuk produksi protein rekombinan
dengan Pichia pastoris. Bioproses Biosyst Eng 37: 1163 - 1172
Stadlmayr G, Mecklenbrauker A, Rothmuller M, Maurer M, Sauer M,
Mattanovich D, Gasser B (2010) Identifikasi dan karakterisasi novel pastoris
Pichia promotor untuk produksi protein heterolog. J Biotechnol 150: 519 - 529 Vogl
T, Glieder A (2013) Peraturan pastoris Pichia promotor dan yang
konsekuensi untuk produksi protein. New Biotechnol 30: 385 - 404 Vogl T,
Sturmberger L, Kickenweiz T, Wasmayer R, Schmid C, Hatzl
AM, Gerstmann MA, Pitzer J, Wagner M, Thallinger GG, Geier M, Glieder A (2016)
Sebuah kotak peralatan beragam promotor terkait dengan pemanfaatan metanol:
bagian fungsional diverifikasi untuk ekspresi jalur heterolog di Pichia pastoris. Acs Syn
Biol 5: 172 - 186 Wu D, Chu J, Hao YY, Wang YH, Zhuang YP, Zhang SL (2010)
Pengaruh laju pertumbuhan spesifik pada produktivitas tertentu dan ikatan disulfida
antarmolekul protein rekombinan yang dihasilkan oleh
pastoris Pichia Mut (+) ketegangan. J Biotechnol 150: S540 - S540 Zalai D, Dietzsch C,
Herwig C, Spadiut O (2012) Batch makan dinamis
Strategi untuk pastoris Pichia sistem pakan campuran untuk meningkatkan proses
pemahaman. Biotechnol Prog 28: 878 - 886 Zhang W, Sinha J, Smith LA, Inan M,
Meagher MM (2005)
Maksimalisasi produksi protein rekombinan disekresikan di
pastoris Pichia fermentasi fed-batch. Biotechnol Prog 21: 386 -
393