Pada akhir 1800-an, Hans Christian Gram mengamati bahwa beberapa genus bakteri mempertahankan

kompleks pewarna-Yodium saat dibilas dengan alkohol, sedangkan genus lain mudah decolorized
dengan alkohol dan bisa kemudian divisualisasikan dengan counter kontras pewarnaan.

Prosedur ini pewarnaan mendefinisikan dua kelompok bakteri: mereka yang mempertahankan pewarna
primer ("Positif dengan Metode Gram" atau "Gram-positif") dan orang-orang yang mudah decolorized
("Negatif dengan Metode Gram" atau "Gram-negatif"). Ini adalah titik awal untuk prosedur identifikasi
bakteri.
Perbedaan retensi pewarna tergantung pada sifat fisik seperti ketebalan, densitas, porositas, dan
integritas dinding sel bakteri, serta, sampai batas tertentu, komposisi kimia.
Bakteri Gram-positif memiliki tebal, padat, relatif dinding non-pori, sedangkan bakteri Gram-negatif
memiliki dinding tipis yang dikelilingi oleh membran lipid kaya. Lihat Morfologi Bakteri dan presentasi
Pewarnaan untuk rincian.
Beberapa organisme non-bakteri dengan dinding sel yang tebal (misalnya, beberapa khamir) juga
pewarnaan Gram-positif.
Bakteri gram positif yang telah kehilangan integritas dinding melalui penuaan atau kerusakan fisik atau
kimia mungkin noda Gram-negatif.

Langkah 1 - Siapkan suatu Usap

Tangguhkan beberapa materi yang akan diwarnai dengan setetes air pada slide mikroskop,
menyebarluaskan turun ke tentang ukuran nikel.
Biarkan udara kering. Panaskan memperbaiki dengan lembut pemanasan di atas api atau sumber panas
lainnya.
Perhatikan apa yang terjadi pada "Bakteri" pada setiap langkah
Langkah 2 - Terapkan Stain Dasar
Penuhi Usap dengan Crystal Violet
Memungkinkan untuk berdiri 30 detik sampai 1 menit
Bilas dengan air untuk menghilangkan kelebihan pewarnaan
Langkah 4 - Bilas
Bilas dengan air untuk menghilangkan kelebihan Iodine
Langkah 5 - Dekolorisasi
Tetes 95% Alkohol di slide sekitar 5 detik
Efluen harus tampak pucat atau bening
Langkah 6 - Bilas
Bilas dengan air untuk menghilangkan kelebihan alkohol
Langkah 7 - counterstain
Penuhi slide dengan larutan safranin
Diamkan 30 sec
Langkah 8 - Bilas, Kering dan Amati
Bilas dengan air untuk menghilangkan kelebihan pewarnaan
hapuskanlah kering
Amati di bawah Perendaman Minyak
Pemeriksaan apusan
Memutar kondensor tinggi dan membuka diafragma iris.
Tempatkan setetes minyak imersi pada smear.
Pasang slide dengan sisi smear di atas panggung.
Gunakan lensa minyak imersi.
Turunkan lensa minyak sampai kontak lensa minyak dan hampir menyentuh smear.
Lihatlah melalui bagian mata mikroskop.
Fokus pada obyek menggunakan sekrup penyesuaian kasar maka yang baik.

Interpretasi apusan

Size
Staining Shape
Arrangement
Pewarnaan ZN
Mycobacterium tuberculosis
Panjang, ramping, lurus atau melengkung, basil asam cepat
Penumbuh lambat, aerob obligat, bakteri intraseluler
Struktur terdiri dari lilin berat molekul tinggi asam, asam mycolic, faktor sumsum
Identifikasi Mikroskop Langsung
M. tuberculosis adalah bakteri tahan asam, bakteri berbentuk batang berukuran 2-4 x 0,2-0,5 um.
Mereka muncul sebagai batang merah cerah dengan latar belakang yang kontras.

The Ziehl Neelsen-pewarnaan digunakan untuk menunjukkan keberadaan basil dalam smear. Teknik ini
sederhana, murah dan mendeteksi kasus-kasus tuberkulosis yang menular.
Pelaporan AFB Mikroskop
MEDIA KULTUR DAN METODE KULTUR
Prosedur Umum Diagnosis Bakteriologis
koleksi spesimen
Spesimen harus mewakili proses infeksi;
Materi yang cukup;
Hindari kontaminasi spesimen;
Dikirim ke laboratorium segera metode yang tepat dan diperiksa ASAP.
Dikumpulkan sebelum menggunakan agen antimikroba, misalnya antibiotik.

Spesimen :
Morphologic identification
microscopy & staining
Isolasi, identifikasi
tes biokimia
deteksi antigen
EIA, ELISA, JIKA, uji aglutinasi
Diagnosis serologi (Ab titer)
fase peristirahatan / fase akut 4
Molekul Diagnosis Biologi (hibridisasi, PCR, RT-PCR, dll

Bakteri harus tumbuh (berbudaya) untuk mereka diidentifikasi.

Dengan prosedur yang sesuai mereka harus tumbuh secara terpisah (isolated) pada media budaya dan
diperoleh sebagai murni untuk penelitian.

Jenis media kultur

Berdasarkan konsistensinya
a) medium padat
b) medium cair
c) medium padat semifinal
Berdasarkan konstituen / bahan
a) media sederhana
b) media yang kompleks
c) media sintetis atau didefinisikan
d) Media khusus

III. Berdasarkan fungsi dan komponen kimia:

Dasar Medium
- mengandung nutrisi dasar untuk pertumbuhan bakteri yang paling;
- dasar jenis media lainnya.
- e g.. kaldu.
Gizi Medium / Enriched Medium
Tambahan nutrisi atau khusus (misalnya, serum, faktor pertumbuhan, elemen) yang ditambahkan untuk
mendukung beberapa pertumbuhan bakteri teliti. misalnya agar darah.
Selektif Medium
media yang dapat mencegah bakteri tertentu
pertumbuhan sementara memungkinkan yang lain.
misalnya SS agar
Diferensial Medium
Beberapa substrat dan indikator khusus ditambahkan ke
media untuk menghasilkan perbedaan visual yang
ketika beberapa bakteri tumbuh pada jenis yang sama dari media.
misalnya EMB agar (Eosin-metilen biru agar).
Media khusus
Pengayaan Media
Media pengayaan
Media selektif
Media indikator
Media diferensial
gula Media
media transportasi
Media untuk reaksi biokimia

III. Berdasarkan pada kebutuhan Oksigen

- Media Aerobik
- Media Anaerobik
Media padat - mengandung 2% agar
Morfologi koloni, pigmentasi, hemolisis dapat dihargai.
Agar nutrisi, agar darah: misalnya
Media cair - tidak agar.
Untuk persiapan inokulum, budaya Darah, untuk isolasi patogen dari campuran.
Kaldu nutrisi: misalnya
Semi padat menengah - 0,5% agar.
Misalnya: media Motilitas

Sederhana media / media dasar

- Misalnya: NB, NA
- NB terdiri dari pepton, ekstrak daging, NaCl,
- NB + 2% agar = agar Gizi

Media selektif
Substansi penghambatan ditambahkan ke media padat.
Menekan mikroba yang tidak diinginkan dan mendorong mikroba yang diinginkan.
misalnya:
Media Mac Conkey untuk bakteri gram negatif
TCBS - untuk V.cholerae
LJ menengah - M.tuberculosis
Wilson dan Blair menengah - S.typhi
Kalium menengah tellurite - Difteri basil

Media indikator
Media ini mengandung indikator yang berubah warna ketika bakteri tumbuh di dalamnya.
misalnya:
agar darah
Media mac Conkey ini
Media urease Christensen
Media diferensial
Sebuah media massa yang memiliki zat yang tergabung di dalamnya memungkinkan untuk membedakan
antara bakteri.
Misalnya: media Mac Conkey ini
pepton
laktosa
agar
netral merah
taurocholate
Bedakan antara fermentor laktosa & fermentor non laktosa
Laktosa fermentor - koloni pink
Fermentor laktosa Non - koloni berwarna
Gula Media
Media yang mengandung zat difermentasi.
Misalnya: glukosa, arabinosa, laktosa, pati dll
Media terdiri dari 1% gula dalam air pepton.
Mengandung sebuah tabung kecil (tabung Durham) untuk deteksi gas oleh bakteri.
Media Transportasi
Media yang digunakan untuk mengangkut sampel.
Organisme Delicate tidak dapat bertahan hidup waktu yang dibutuhkan untuk mengangkut spesimen
tanpa media transportasi.
misalnya:
Stuart menengah - non nutrisi lembut gel agar yang mengandung zat pereduksi
Buffered gliserol garam - basil enterik
Media anaerobik
Media ini digunakan untuk tumbuh organisme anaerobik.
Misalnya: media daging cooked Robertson, Thioglycollate menengah.
Biokimia TES & REAKSI
Mereka memberikan informasi tambahan untuk identifikasi bakteri.
Tes meliputi:
uji oksidase
Tiga gula besi agar (TSI)
uji indole
pemanfaatan sitrat
uji urease

Uji Oksidase
Mendeteksi adanya enzim "oksidase" yang diproduksi oleh bakteri tertentu yang akan mengurangi dye -
tetrametil-p-fenilena diamina dihidroklorida.
Tes positif ditunjukkan oleh perkembangan warna ungu.
Oksidase positif - Pseudomonas, Vibrio, Neisseria
Oksidase negatif - Salmonella, Shigella
TRIPLE GULA BESI AGAR (TSI)
Ini merupakan media komposit yang digunakan untuk mempelajari sifat yang berbeda dari bakteri -
fermentasi gula, produksi gas dan produksi H2S.
Selain pepton, ekstrak ragi & agar, mengandung 3 gula - Glukosa, Laktosa, Sukrosa.
Garam Besi - sitrat Ferri menunjukkan produksi H2S.
Fenol merah adalah indikator.
Ini adalah media yang merah oranye dengan miring dan bokong.
pH medium - 7,4
TSI REAKSI:
Kuning - Asam
Pink - Alkaline
Kuning miring / pantat Kuning (A / A) - fermentor laktosa.
Merah muda miring / pantat Kuning (K / A) - fermentor Non laktosa.
Merah muda miring / tidak ada perubahan warna (K / K) - Non fermentor
Warna hitam - produksi H2S.
Gelembung gas atau retak dalam medium - produksi gas.
LF - E.coli, Klebsiella
NLF - Salmonella, Shigella
H2S Proteus

Uji Indol
Digunakan untuk mendeteksi produksi indole oleh organisme.
Mereka menghasilkan indole dari triptofan hadir dalam air pepton.
Setelah inkubasi semalam, beberapa tetes indole reagent (reagen Kovac itu) ditambahkan.
Tes positif ditunjukkan oleh cincin merah muda.
Uji indol positif - cincin merah muda
Negatif uji indole - cincin kuning
Indole positif - E.coli
Indole negatif - Klebsiella, Salmonella.
Pemanfaatan Sitrat
Lakukan dalam medium Simmon Sitrat itu.
Untuk mendeteksi kemampuan bakteri tertentu untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon.
Berisi Sodium sitrat dan biru Bromothymol sebagai indikator.
Jika sitrat digunakan, alkali diproduksi yang ternyata media menjadi biru.
Sitrat positif - warna biru
Sitrat negatif - warna hijau
Positif - Klebsiella
Negatif - E.coli
METODE KULTUR
Metode kultur yang digunakan tergantung pada tujuan yang mereka dimaksudkan.
Indikasi untuk kultur adalah:
Untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni.
Untuk menunjukkan sifat mereka.
Untuk mendapatkan pertumbuhan yang cukup untuk persiapan antigen dan untuk tes lainnya.
Untuk bakteriofag & bakteriosin kerentanan.
Untuk menentukan sensitivitas terhadap antibiotik.
Untuk memperkirakan jumlah yang layak.
Mempertahankan kebudayaan persediaan.
Metode kultur meliputi:
budaya Streak
budaya Lawn
budaya Stroke
budaya Stab
Metode pour plate
kultur cair
Metode biakan anaerob
KULTUR LAWN
Menyediakan pertumbuhan di permukaan seragam bakteri.
Kegunaan
Untuk bakteriofag mengetik.
Tes sensitivitas antibiotik.
Dalam penyusunan antigen bakteri dan vaksin.
Budaya Lawn disusun dengan membanjiri permukaan piring dengan suspensi cair bakteri.
KULTUR STROKE
Budaya Stroke dibuat dalam tabung yang berisi kemiringan agar / miring.
Kegunaan
Menyediakan pertumbuhan murni bakteri untuk aglutinasi slide dan tes diagnostik lainnya.
STAB KULTUR
Disusun oleh menusuk media yang cocok - gelatin atau glukosa agar dengan panjang, lurus, biaya kawat.
Kegunaan
Demonstrasi gelatin pencairan.
Kebutuhan oksigen dari bakteri yang diteliti.
Pemeliharaan budaya stoke.
POUR PLATE KULTUR
Medium agar dilebur (15 ml) dan didinginkan sampai 45oC.
1 ml inokulum yang ditambahkan ke agar-agar cair.
Aduk rata dan tuangkan ke cawan petri steril.
Biarkan hingga diatur.
Diinkubasikan pada 37oC, koloni akan didistribusikan ke seluruh kedalaman medium.
Kegunaan
Memberikan perkiraan jumlah bakteri yang layak dalam suspensi.
Untuk kultur urin kuantitatif
KULTUR CAIR
Kultur cair diinokulasi dengan menyentuh dengan loop dibebankan atau dengan menambahkan
inokulum dengan pipet atau jarum suntik.
Kegunaan
kultur darah
tes Sterility
Metode kultur kontinyu
kerugian
Ini tidak memberikan kultur murni dari inokulum campuran.
METODE KULTUR ANAEROBIC
Bakteri anaerob berbeda dalam persyaratan dan kepekaan terhadap oksigen mereka.
Cl.tetani adalah anaerob yang ketat - tumbuh pada tekanan oksigen < 2mm Hg.
metode:
Produksi vakum
Pemindahan oksigen dengan gas lain
metode kimia
metode biologi
media reduksi
Metode Kimia
Alkaline pirogalol menyerap oksigen.
McIntosh - Fildes 'anaerobik jar
Terdiri dari sebuah guci logam atau tabung kaca dengan tutup logam yang bisa menjepit kedap udara.
Tutupnya memiliki 2 tabung - inlet gas dan gas outlet
Tutupnya memiliki dua terminal - terhubung ke pasokan listrik.
Di bawah tutup - kecil berlekuk porselen spool, dibungkus dengan lapisan asbes palladinised.
Kerja:
Lempeng diinokulasi ditempatkan di dalam tabung dan tutupnya dijepit kedap udara.
Tabung outlet dihubungkan ke pompa vakum dan udara di dalam dievakuasi.
Outlet keran kemudian ditutup dan tabung inlet terhubung ke pasokan hidrogen.
Setelah tabung diisi dengan hidrogen, terminal listrik terhubung ke pasokan saat ini, sehingga asbes
palladinised dipanaskan.
Bertindak sebagai katalis untuk kombinasi hidrogen dengan oksigen residual.
Gaspak
Tersedia secara komersial sampul pakai.
Mengandung bahan kimia yang menghasilkan H2 dan CO2 pada penambahan air.
Katalis dingin - dalam amplop
Indikator yang digunakan - berkurang metilen biru.
Colourless - anaerob
Warna biru - saat terpapar oksigen
metode biologi
Penyerapan oksigen dengan inkubasi dengan bakteri aerobik, kecambah atau sayuran cincang.
Reduksi oksigen
Dengan menggunakan pereduksi - glukosa 1%, 0,1% Thioglycolate