2.

Pretreatment dan ekstraksi

2.1. Penanganan sampel dan pretreatment

Untuk mengetahui jumlah dan komposisi lignans perlu untuk memisahkannya

darimatriks tanaman secara tradisional. Langkah-langkah kerja, masing-masing
melibatkan risiko kontaminasi, kehilangan sampel, dan reaksi tak terduga dari lignan.
Meskipun demikian, metode preparatif dan analitis, dan peralatan yang tersedia, telah
berevolusi dan saat ini, kemungkinan menerapkan metode ekstraksi dan pretreatment
yang lebih aman dari sampel tanaman. Skema umum yang berlaku untuk lignan
analisis bahan tanaman ditunjukkan pada Fig. 2.
Prosedur sampling, penyimpanan sampel, dan pra-perawatan sampel sangat
penting untuk hasil analisis lignan. Misalnya, mendapatkan sampel kayu yang
representatif dari spesies pohon tertentu melibatkan pertanyaan seperti tempat
pertumbuhan, umur, karakteristik, dan kondisi fisik pohon sampel, dan tinggi sampel.
Sampel sebaiknya diletakkan di freezer segera setelah pengambilan sampel untuk
menghindari reaksi yang tidak diinginkan seperti oksidasi, polimerisasi, dan reaksi
enzimatik. Oxi-dasi ekstraksi lipofilik juga dapat menyebabkan masalah di kemudian
haridalam analisis lignan.
Pretreatments diperlukan untuk sebagian besar sampel tanaman sebelum
ekstraksi pengeringan, dan penggilingan atau penghancuran. Menghindari oksidasi atau
polimerisasi senyawa sensitif, disarankan untuk menggunakan teknik pengeringan
ringan seperti pengeringan beku atau, jika tidak tersedia, pengeringan pada suhu kamar.
Penggilingan juga bisa menyebabkan reaksi yang tidak diinginkan karena suhu di pabrik
mungkin naik terlalu tinggi menambahkan beberapa es kering murni bisa
menghilangkan masalah ini. Sampel tanah atau serbuk lebih rentan terhadap oksidasi
dan degradasi dan karenanya harus disimpan di tempat yang dingin, gelap, dan kering.

2.2. Ekstraksi pelarut dan padat

Ekstraksi soxhlet atau perkolasi dengan pelarut polar adalah metode tradisional
untuk mengekstraksi lignans dari tanaman. Namun, ada ekstraksi kurang polar dalam
sebagian besar jaringan tanaman dan mungkin mengganggu analisis lignan berikutnya,
jika ekstraksi langsung dengan pelarut polar digunakan. Oleh karena itu, dianjurkan
untuk melakukan ekstraksi sekuensial dan pertama-tama lepaskan lipofilik
senyawa dengan pelarut organik non-polar seperti heksana, pentana, petroleum eter,
atau diklorometana. Ekstraksi hidrofilik, termasuk lignan, selanjutnya dapat diekstraksi
dengan pelarut polar seperti aseton, metanol, atau etanol. Menambahkan 5-10% air ke
pelarut akan memudahkan penetrasi pelarut dan mempromosikan ekstraksi senyawa
polar lebih banyak seperti lignan glikosida. Ekstraksi polifenol, termasuk lignans dan
lignan glyco-sides, dari biji-bijian tertentu mungkin memerlukan campuran pelarut
dengan jumlah air besar, seperti aseton berair 30% , baru-baru ini digunakan untuk
ekstraksi polifenol dari sorgum. Namun, beberapa lignans memiliki polaritas rendah dan
menengah dan akan diekstraksi dengan pelarut ekstraksi non-polar. Campuran com-
plex, atau sejumlah besar lignan, atau, misalnya resin asam, juga bisa mempengaruhi
kelarutan dan selektifitas senyawa terhadap pelarut non-polar.
Ekstraksi langsung dengan solar ventilasi suhu panas atau ruang-suhu juga telah
digunakan untuk ekstraksi lignans tanaman. Hal ini mungkin juga pendekatan yang
tepat untuk lignans polaritas rendah, tidak hanya mengandung satu gugus hidroksil
bebas, karena ekstraksi selektif dari ekstraksi non-lignan lipofilik tidak mungkin terjadi.
Metode yang sangat baik untuk ekstraksi pelarut lignans tanaman adalah percepatan
ekstraksi pelarut (ASE), yang dilakukan pada suhu tinggi dan tekanan dan di bawah
nitrogen atmosfer inert. Metode ini memungkinkan cepat, otomatis, dan ekstraksi
berurutan menggunakan volume pelarut yang relatif kecil. Ekstraksi ASE baru-baru ini
diterapkan untuk ekstraksi lig-nans dari berbagai spesies pohon. Terutama, ekstrak yang
kaya lignan. Lignan di beberapa bahan tanaman mungkin memerlukan pretreatment
khusus sebelum ekstraksi dan analisis. Seco diglucoside (SDG) di Indonesia biji rami
(Linumusitatissimum) adalah contohnya, karena SDG sebagai oligomer yang terkait
dengan ester, atau bahkan polimer, yang terdiri dari SDG dan asam hidroksimetil
glutarat (HMGA). Turunan lignan oligomerik / polimerik ini mudah larut dalam
metanol atau etanol berair, tapi basa hidrolisis selanjutnya diperlukan untuk melepaskan
SDG bebas.
Selanjutnya, langkah hidrolisis asam tambahan harus ditambahkan jika
Aglycone Seco gratis diminati. Beberapa analitis prosedur, termasuk berbagai langkah
dan kombinasi hidrolisis enzy-matic, acidic, dan alkaline, sebelum atau sesudah
ekstraksi, telah dikembangkan untuk menganalisis SDG dan Seco dalam makanan dan
pakan. Hidrolisis sering juga dilakukan untuk mempermudah analisis kromatografi sub-
sekuen dari ekstrak yang mengandung lignan glikosida terutama dalam proses teknis,
seperti pulping dan pembuatan kertas, tapi juga sampel lingkungan dan untuk beberapa
makanan. Aplikasi, lignans dilarutkan ke dalam air, menurut Ekman dan Holmbom
ekstraksi lipofilik dari sampel air (serat disaring jauh) dari sumber pulp pertama kali
diekstraksi dengan dietil eter, dan kemudian sebagian dari fasa air yang mengandung
lignan dikeringkan dan dianalisis dengan GC. Kekurangan metode ini yaitu,
membutuhkan filtrasi untuk menghilangkan serat, yang mana bisa menjebak beberapa
lignans dengan afinitas tinggi ke serat atau lainnya. Kemudian Ors dan Holmbom
menerbitkan metode sampling yang lebih baik ekstraksi dalam sampel air, yang
mencakup sentrifugasi, mengeluarkan serat dan partikel, mengatur pH sampai 3,5
dengan asam sulfat encer, dan ekstraksi dengan MTBE sebanyak tiga kali sebelum
analisis akhir dari gabungan MTBE-ekstrak oleh GC. Metode ini
memungkinkan ekstraksi> 95% lignans hadir dalam air sam-ples, namun kurang efektif
untuk sesku dan dilignans.
Penggunaan ekstraksi fase padat (SPE) telah diterapkan untuk analisis lignans
dalam biji rami atau cairan biologis, dimana telah digunakan sebagai langkah pemurnian
setelah hidrolisis alkali atau enzimatik dari ekstrak mentah atau untuk
fraksinasi oligomer dari ekstrak mentah yang tidak dihidrolisis. SPE juga telah
digunakan untuk ekstraksi phe-nols dan polifenol sederhana dari tanaman dan makanan.
Ekstraksi cairan superkritis (SFE) adalah teknik ekstraksi yang menarik yang bisa
memiliki beberapa kelebihan juga pada analisis lignan. Ekstraksi SFE dengan karbon
dioksida bekerja dengan baik untuk lignans polaritas rendah sampai sedang seperti yang
diperoleh dari Schizandrachinensis, namun hanya untuk ekstraksi dari
biji dan bukan dari daun. Meskipun demikian, penambahan dari metanol ke karbon
dioksida dapat sangat meningkatkan efisiensi ekstraksi lignans tertentu. Namun, SFE
adalah metode yang mudah digunakan untuk menghilangkan ekstraksi lipofilik dari,
misalnya, biji rami sebelum ekstraksi lignan selanjutnya
pelarut hidrofilik
2.3. Persiapan pemisahan dan isolasi lignan murni

Pengayaan dan pemisahan alami masing-masing lignan dalam bentuk murni

sering dikehendaki untuk tujuan analisis. Baru-baru ini penemuan bahwa pohon simpul
dari beberapa jenis pohon mengandung sejumlah besar lignans aglycone bebas telah
memberikan kesempatan untuk mengisolasi lignan murni, terutama dalam isolasi skala
besar HMR dari spesies cemara yang berbeda, karena HMR bisa digunakan sebagai
bahan awal pembuatan lignans lainnya (misalnya MR, 7-hydroxy-Seco, Lari, cLari,
ENL, END, 7-oxo-MR, dan iso-HMR). Lignans murni yang diperoleh tidak hanya
sebagai senyawa standar baru untuk tujuan analitik, tapi juga untuk biotesting. Prinsip
dasar untuk mengisolasi lignans knotwood yang berbeda adalah sebagai berikut:
Knotwood adalah terpecah, beku-kering, dan tanah. Setelah dihapus ekstraksi
lipofilik menggunakan ekstraksi pelarut heksana, Ekstraksi hidrofilik diekstraksi
dengan air, campuran aseton atau dengan etanol. Lignan murni kemudian bisa diperoleh
kromatografi kilat pada kolom silika fase normal dan / atau oleh kristalisasi dari pelarut
yang sesuai (misalnya mencairkan 2-propanol, metanol, atau sikloheksana / etanol).
HMR juga dapat diendapkan dari larutan etanol dengan penambahan potasium asetat,
hingga mencapai kemurnian 90-95%.
Kromatografi kilat adalah metode yang mudah digunakan untuk isolasi prepignif
dari lignan terpilih dari ekstrak kasar, berat sampel bisa jauh lebih besar dibandingkan
dengan HPLC. Namun, kondisi pemisahan dan pemurnian perlu diikutsertakan.
Dichloromethane dan etanol dalam rasio yang berbeda (mis. DCM / EtOH 98: 2; 95: 5)
telah bekerja dengan baik untuk lig-nans aglikon seperti HMR dan juga untuk
sesquilignans. Campuran pelarut yang sesuai dapat ditemukan dari percobaan dengan
kromatografi kolom dan KLT, berbagai kombinasi dan aplikasi open-column
kromatografi, kromatografi cair kinerja sedang (MPLC), (semi) preparatif HPLC, dan
preparatif TLC juga sudah terbiasa mengisolasi lignan. Sebagai contoh, Owen et al.
lignans terisolasi dari minyak zaitun dengan preparatif TLC diikuti dengan HPLC semi
preparatif. Willf atau dkk, kombinasi yang digunakan dari kromatografi flash (kolom
silika fase normal), MPLC (fase normal), dan fase terbalik kutub (eter-linked) fenil
dengan penutup akhir polar) HPLC semi preparatif ke mengisolasi beberapa
sesquilignans dan lignans dari pohon cemara simpul-kayu.(lignans terrain dan
sesquilignans dari kayu hemlock barat dengan preparatif TLC dan HPLC semi
preparatif pada fase normal dan fase terbalik kolom silika mengisolasi beberapa lignan
dari tunas dan daun cemara hinoki menggunakan kolom kromatog-raphy dengan
campuran pelarut yang berbeda: DCM / metanol, etil asetat / n-heksana, dan aseton /
DCM, diikuti oleh TLC (sama pelarut) dan fase terbalik HPLC menggunakan elusi
isokratik dengan asetonitril / air (37:63), dipisahkan dan isomer HMR terisolasi dari
ekstrak HMR kasar dengan HPLC fase terbalik prepara-tive menggunakan etanol atau
metanol dan air. campuran.SDG terisolasi dari ekstrak dari tepung biji rami yang
dihilangkan dengan menggunakan kolom fase terbalik pertama (metanol) dan kemudian
kolom silika fase normal (chloro-form / methanol / water 10: 5: 1), sedangkan Pihlava
dkk menyarankan penggunaan langsung kolom fase balik dan elusi dengan
alkohol seperti yang terlihat dari contoh di atas, pilihan bahan col-umn atau KLT untuk
pemisahan lignan secara preparatif tampaknya fase normal-fase atau fase terbalik (RP)
C18. Namun, pengalaman menunjukkan bahwa RP C8 dalam beberapa kasus
sebenarnya memberikan pemisahan yang lebih baik dibanding C18. Tes pendahuluan
dengan bahan rantai yang lebih pendek, seperti C5, tidak memperbaiki pemisahan (hasil
yang tidak dipublikasikan). Cocok campuran pelarut dapat berupa metanol / air, ace-
tonitril / air, asetonitril / metanol / air, etanol / air, n-heksana / kloroform / metanol, orn-
heksana / etil asetat dalam rasio yang berbeda. Baik elusi isokratik dan gradien dapat
bekerja, tergantung pada kompleksitas ekstraknya.

2.4. Artefak dan transformasi kimia yang tidak diinginkan

Sayangnya, peneliti biasanya tidak melaporkan hasil dan artifak unsuc cessful.
Langkah sederhana, seperti penggunaan inmo-sphere inert, tidak adanya cahaya, dan
hindari suhu tinggi sering terbengkalai, yang ternyata mengarah pada bahan kimia yang
tidak diinginkan reaksi seperti oksidasi, degradasi termal, atau polimerisasi dari lignans
sensitif. HMR adalah salah satu lignans yang paling banyak dipelajari. Freudenberg
dan Knof melaporkan bahwa kondisi asam sangat kuat untuk pembentukan -Coni dari
HMR. Ekman membahas kemungkinan auto-oksidasi HMR sampai 7-oxo-MR pada
sampel kayu non-segar. Dia juga menyarankan agar adanya -ConiA dalam ekstrak buah
kayu segar bisa menjadi hasil hidrolisis cincin lakton -Coni selama prosedur ekstraksi.
Kemudian, Ekman dan Holmbom melaporkan bahwa nilai pH berkisar antara 9-12
dalam air menyebabkan transformasi katalitik dasar HMR ke senyawa (E) -4- (4-
hidroksi-3-methoxyphenyl) -2- (4-hidroksi-3-metoksifenilmetil) tapi-asam 3-enoat dan
transformasi menjad -ConiA karena penumpukan alkalinitas selama pengeringan
sampel. Hal ini juga diperkuat oleh Eklund dkk., menunjukkan bahwa HMR
mengalami beberapa transformasi di bawah dasar dan kondisi asam. Produk yang
mungkin termasuk-Coni, ConiA, HMR acid, dan isomer iso-HMR. HMR juga bereaksi
dengan berbagai nukleofil dalam kondisi asam dan dasar, menghasilkan produk seperti
MR, dan 7-methoxy-dan 7-ethoxy-MR, antara lain. Sebenarnya, HMR sangat tidak
stabil dalam larutan dan akan hilang hampir seluruhnya selama hidrolisis asam dan alka-
line.
Selanjutnya, transformasi ke Coni mungkin tanpa disadari karena kelarutannya?
-Coni dalam air rendah oleh karena itu mungkin akan mengendap dan menghilang untuk
analisis berikutnya. HMR juga mengalami transformasi oksidatif paparan cahaya.
Kedua isomer HMR dapat disamakan dan keduanya dioksidasi menjadi 7-oxo-MR dan
selanjutnya berwarna, oligomer saat terkena iradiasi oleh cahaya. Adanya radikal bebas
dalam larutan yang mengandung lig-nans dapat menyebabkan transformasi kimia yang
tidak diinginkan, karena kebanyakan lignan dikenal sebagai penangkap radikal yang
efekti. Lig-nans tidak bisa hanya membentuk aduk yang berbeda, tapi juga bisa
menjalani dimerisasi dan reaksi radikal mungkin tidak diketahui. Meskipun kinetika
reaksi relatif lambat, risiko ini harus dijaga selama pengolahan sampel dan analisis.
Seco sebagian dapat berubah menjadi Seco-acetonide selama kromatografi kol-umn
dengan aseton pada silika sedikit asam. Artefak serupa, yaitu acetonides dari Seco,
cLari, dan isotaxiresinol juga dilaporkan oleh Yang et al.setelah isolasi senyawa fenolik
dariTaxusmairei. Kondisi asam juga bisa membawa artefak seperti anhydro-Seco
dan anhydro-cLari dengan menghilangkan molekul air dari struktur diol, seperti yang
ditunjukkan pada eter guaiacylglyceryl lignan ini. Anhydro-Seco juga merupakan
artefak yang diproduksi pada hidrolisis asam SDG, sejauh ini dilaporkan terjadi secara
alami hanya disimpul kayu abies amabilis, bisa ditransformasikan ke Lari
dan cLari oleh reaksi siklisasi intramolekuler yang dikatalisis asam. Lari juga akan
mengatur lebih lanjut ke cLari kondisi asam yang lebih kuat. Anjaeyulu dkk membahas
apaka lignan metil dan etil arboreal adalah produk alami dari Artefak Gmelina arboreaor
terbentuk selama proses ekstraksi. Mereka menyimpulkan bahwa lignan ini pasti
terjadi secara alami. Sililasi sebelum analisis dengan GC biasanya cukup lurus untuk
lingkungan, namun hidroksil yang terhambat secara sterik, seperti gugus 8-OH
dalam (-) - NTG, dapat menghasilkan hanya sebagian senyawa sililasi, yang bisa
menyebabkan kebingungan. Artefak sililasi lain yang mungkin adalah cyclisation dari
Lari ke cLari oleh waktu, yang mungkin jatuh tempo untuk pembentukan asam
hidroklorida dalam sampel sililasi Dianjurkan sampel sililasi harus dianalisis di dalam
12 h untuk menghindari degradasi senyawa sililasi.