Metode Pengujian Antifungi

Metode pengenceran (bukan metodologi berbasis agar), dianggap paling

handal untuk pengujian produk alami dalam aktivitas antijamur. Berikut adalah jenis-
jenis metode pengujian antifungi.

I.Broth Microdilution

Aliri piringan PDA dengan 1 mL larutan garam steril. Menggunakan loop, periksa
permukaan miselia untuk melihat konidia dalam larutan

Pindah larutan ke tabung steril dan vorteks suspensi minimal 1 menit untuk
menghasilkan larutan homogen

Biarkan selama 3 menit dan kemudian pindah bagian atas cairan ke tabung steril.

Dengan menggunakan spektrofotometer, sesuaikan dengan densitas optik itu sama

dengan larutan stok konidia 0,4-5 × 10 6 atau sporangiospora per mililiter (CFU / mL)

Encerkan suspensi jamur 1:50 dalam PDB untuk membuat kisaran 0,8-1 × 10 5 CFU / mL.

Isi sumur microtiter dengan 100 μl suspensi jamur dan 100 μL bahan uji produk
alami.

Sumur kontrol pertumbuhan (GC) mengandung 100 μL suspensi jamur dan 100 μL air suling

Tambahkan zat antijamur ke suspensi jamur pada positif kontrol dan bahan uji pelarut
pada suspensi jamur
 Inkubasi baki tanpa agitasi pada suhu 35 ° C sampai 70 jam,
memeriksa pertumbuhan terlihat di sumur GC setelah 24 dan 48 jam

Teknik baru untuk pengujian kerentanan jamur memberikan alat tambahan yang
berguna dan wawasan. Berikut ini bukan ulasan yang lengkap semua langkah kerja di
bidang ini, tetapi akan fokus pada isu-isu itu penting untuk di uji di laboratorium klinis
dengan penekanan pada Komite Nasional Klinis yang dipelajari dengan baik
Metodologi Standar Laboratorium (NCCLS).

II.Metode NCCLS Broth-Based Methodology untuk Ragi

Menentukan ukuran inokulum, media uji, waktu inkubasi dan suhu, dan
pembacaan titik akhir untuk flucytosine, amfoterisin B, flukonazol, ketokonazol, dan
itrakonazol. Mikrodilusi telah menjadi metode pilihan karena praktis. Pelat
mikrodilusi mudah disiapkan dan beku dengan baik sebelum digunakan.
Titik akhir untuk azoles untuk pengujian makro dan mikrodilusi telah
didefinisikan pada titik di mana ada penurunan pertumbuhan yang menonjol. Untuk
Uji macrodilution, penurunan pertumbuhan yang menonjol adalah ditunjukkan
setara dengan kekeruhan pengenceran 1: 5 pada kontrol pertumbuhan suplementasi
media inkubasi RPMI 1640 dengan 18 g glukosa per liter (untuk mengubah
konsentrasi glukosa akhir dari 2 sampai 20 g / liter) telah ditunjukkan berulang kali
meningkatkan pertumbuhan isolat. Agitasi microdilution diperlukan untuk
spektrofotometri pembacaan dan nampaknya mempermudah pembacaan visual titik
akhir dan metode ini mempersingkat inkubasi sampai 24 jam dan mengurangi pH
sedang di bawah 5 juga telah diusulkan sebagai metode untuk memperjelas titik akhir
trailing untuk Candida spp.

III.Metodologi NCCLS untuk Cetakan

Mengikuti prinsip yang ditetapkan untuk pengujian ragi, metode standar
yang diusulkan dengan judul "Metode referensi untuk pengenceran antibiotika
antijamur untuk uji konidiumformingjamur filamen "kini telah diterbitkan sebagai
NCCLS M38-P. Metode ini dikembangkan dengan menggunakan isolat Aspergillus
spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., P. boydii, dan S. Schenckii. Perbedaan yang
signifikan dari M27-A adalah inokulum, yang kira-kira 10 kali lipat lebih tinggi
daripada ragi dan membutuhkan metode persiapan yang berbeda karena perbedaan
ukuran dan sifat hamburan cahaya dari berbagai jenis spora yang bisa dihasilkan oleh
jamur ini. Metode M38 menentukan rentang kepadatan optik yang berbeda untuk
setiap genus. Definisi titik akhir adalah area perbedaan lainnya dari M27 dan M38.
Pada M27, azol dibaca pada penghambatan sebagian titik akhir (didefinisikan sebagai
konsentrasi obat terendah yang menghasilkan penurunan pertumbuhan yang
menonjol). Sementara dalam dokumen M38-P untuk azol, data terbaru menunjukkan
bahwa membaca titik akhir pada penghambatan 100% (tidak ada pertumbuhan)

IV. Etest
Etest (AB Biodisk, Solna, Swedia) adalah komersial metode yang tersedia untuk
uji kepekaan antimikroba. MIC ditentukan dari titik persimpangan zona
penghambatan pertumbuhan dengan strip dikalibrasi yang dilewati dengan gradien
konsentrasi antimikroba dan ditempatkan pada piring agar dengan isolat mikroba
yang diuji. Pilihan medium pertumbuhan teknik ini penting, dengan agregat berbasis
RPMI sangat efektif (misalnya, agar ini memberikan korelasi 96% dengan mikrodilusi
referensi)

V.Metode Pengujian Berbasis Alami lainnya

Uji kerentanan berbasis disk ini mudah dan ekonomis. Mengaliri permukaan
pelat dengan biru metilen (0.5 g / ml) mampu memperbaiki definisi tepi zona dan
memfasilitasi pembacaan hasil.

VI. Flow Cytometry dan Penggunaan Viability Dyes

Flow cytometry telah lama dikenal sebagai alat yang mungkin untuk uji
kerentanan antijamur dan telah dikembangkan untuk ragi dalam penelitian yang
berfokus terutama pada Candida spp. Pewarnaan (atau kurang pewarnaan) dengan
pewarna sesuai memungkinkan deteksi cepat jamur yang rusak. Secara konseptual
studi terkait, pewarna viabilitas fluorescent telah digunakan untuk memeriksa sifat
kerusakan akibat obat pada ragi dan cetakan dan untuk memperkirakan MIC dan
konsentrasi minim fungisida (MFC) untuk cetakan.

VII. Pengukuran Langsung Efek Azole: Kuantitas Sintesis Ergosterol

Mengingat bahwa zat antijamur azol bertindak dengan penghambatan ergosterol
sintesis, pengukuran langsung perubahan ergosterol sintesis tampak relevan telah
menunjukkan bahwa hal ini berkorelasi baik dengan NCCLS M27-A

VIII. Metode Pengujian Kerentanan Antijamur lainnya untuk Ragi dan Cetakan
Shimokawa dan Nakayama telah menguji azol terhadap Candida spp. pada
acetate-supplemented media menghasilkan MICs yang lebih dekat dengan perkiraan
konsentrasi kritis dimana biosintesis ergosterol berada. Penggabungan MTT [3- (4,5-
dimetil-2-thiazolil) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromida] atau XTT (2,3-bis (2-
methoxy-4-nitro-5-dulfophenyl) -5 - [(phenylamino) karbonil] - 2H-tetrazolium
hidroksida) sebagai penanda warna untuk potensi redoks telah ditemukan sesuai
untuk Candida spp.
 Pendekatan ini menghasilkan MICs yang sebanding metode referensi
NCCLS. Demikian pula metode pengukuran konsentrasi ATP intraselular dan
konsumsi glukosa dari inkubasi medium telah menghasilkan korelasi yang sangat baik
dengan metode referensi kapasitansi menengah. Penilaian awal pertumbuhan jamur
dengan perkiraan MIC langsung dari awal positif spesimen kultur (misalnya, dari
bahan dalam kultur darah botol) tanpa kebutuhan subkultur. Spektrofotometri
pengukuran penggabungan warna merah netral oleh sel layak ditunjukkan untuk
berkorelasi dengan perkiraan MFC untuk Trichophyton spp. Metode berbasis
pengenceran agar menggabungkan konsentrasi tertentu flukonazol (8 g / ml),
dikombinasikan dengan chromogenic CHROM agar Candida medium inkubasi di
bawah 20% CO2 telah disarankan sebagai cara untuk mengklarifikasi titik akhir dalam
agar-agar dengan metode pengenceran

IX. Pengujian Dermatophytes

Dermatophytes tumbuh perlahan, dan karenanya metode berbasis agar
sering digunakan sebagian besar langkah awal terfokus pada pemilihan media,
dengan perhatian khusus untuk memilih sebuah media yang mendukung
pembentukan konidia di Trichophyton rubrum. Langkah selanjutnya menyelidiki
inokulum dan akhir titik yang sedang berjalan.

X. Penentuan MFC (bukan MICs)

MFC memiliki potensi untuk lebih relevan dengan klinis. Hasilnya, terutama
dalam konteks immunocompromised dalam host atau situs tubuh. Memang, ada
yang bekerja dengan MFC telah menyarankan bahwa mereka mungkin lebih prediktif
daripada MICs bahkan untuk pengujian umum. Bahkan definisinya pun sangat
beragam dari istilah "microbicidal" dan "microbistatic" obat antibakteri bakterisida
membunuh 99,9% dari organisme, tetapi harus berlaku untuk jamur dengan enam
kali lipat berlipat ganda.
Klepser dkk. mendekati MFC dengan mengukur kurva vs waktu untuk agen
antijamur. Metode yang dapat dipercaya menghasilkan kurva seperti itu bisa
langsung diaplikasikan pada pengukuran MFC yang diberi titik waktu. Klepser telah
mengusulkan metode standar dan menggunakan teknik ini secara ekstensif dalam
rangkaian investigasi farmakodinamik.