LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA

TEKNIK UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

Kelompok II
Aan Wahyuni
F1C118019

Dosen Pengampu:
1. Drs. Nelson, M.Si.
2. Indra Lasmana Tarigan, S.Pd., M.Sc.

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI DAN REKAYASA I

PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JAMBI
2021
 PERCOBAAN II
TEKNIK UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan uji aktivitas antibakteri.
2. Mahasiswa mampu menentukan konsentrat hambat tumbuh
minimum (KHTM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dari
senyawa antibakteri.

II. Landasan Teori

Bakteri merupakan mikroorganisme prokariotik yang dapat
memberikan dampak positif bagi kesehatan sebagai flora normal, tetapi
dapat juga memberikan dampak negatif dengan menimbulkan penyakit
atau bersifat patogenJika dilihat dari risiko terjadinya resistensi
antibiotik sintetik terhadap bakteri patogen, maka dibutuhkan solusi
untuk mencari obat alternatif yang aman, murah, mudah diperoleh dan
lebih baik sebagai obat baru pengganti antibiotik sintetik. Senyawa
bahan antibakteri tersebut dapat diperoleh dari mikroba, tumbuh-
tumbuhan dan hewan. Senyawa antibakteri bekerja dengan merusak
dinding sel bakteri, enzim, dan sebagainya (Kurniawan et al., 2019).
Antibakteri adalah zat yang dapat menekan pertumbuhan atau
reproduksi bahkan membunuh bakteri. Antibakteri terbagi atas dua
berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu bakteiosatika yang bersifat
menghambat pertumbuhan bakteri dan bakterisida yang bersifat
membunuh baktei. Antibakteri dapat memiliki aktivitas bakteriosatika
menjadi aktivitas bakterisida apabila kadarnya ditingkatkan melebihi
kadar hambat minimal (Rollando, 2019).
KHM adalah konsentrasi minimal zat antimikroba yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak
tumbuh koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati
banyaknya koloni bakteri yang tumbuh. KHM juga merupakan teknik
untuk menentukan konsentrasi minimum zat antimikroba yang
dibutuhkan dalam menghambat pertumbuhan suatu mikroorganisme.
Konsentrasi hambatan minimum (KHM) adalah konsentrasi antibiotik
terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme
tertentu (Sapuetra et al., 2019).
III. Prosedur Kerja
A. Alat
- Autopipet
- Incubator
- pH meter
- Cawan petri
- Jarum ose
- Neraca analitik
- Spektrofotometer
- Tabung reaksi
- Pipet tetes

B. Bahan
- Bakteri (gram negatif: E. coli, gram positif: Bacillus subtillis)
- Latutan baku McFarland 0,5 (BaCl2 1%, larutan H2SO4)
- Media NA
- Media NB
- Kapas
- Aluminium foil
- Aquades
- Kloramphenikol
IV. Skema Kerja
4.1 Pembuatan Larutan Baku McFarland 0.5
a. Larutan baku Mc. Farland terdiri dari larutan BaCl2 1% dan
H2SO4 1%. Sebanyak 0.05 ml larutan BaCl2 1% dicampurkan
dengan 9.95 ml H2SO4 1%, dikocok hingga homogen.
b. Kekeruhan larutan diukur pada panjang gelombang 450 nm
dengan menggunakan aquades sebagai blanko. Nilai
absorban larutan baku harus berada pada kisaran 0.08
sampai dengan 0.13. Larutan baku McFarland 0.5 ekuivalen
dengan suspense sel bakteri dengan konsentrasi 1.5 x 108
CFU/ml (Nilai absorban 0.138).

4.2 Penentuan Aktivitas Antibakteri

a. Peremajaan Bakteri Uji
- Peremajaan dilakukan dengan menginokulasi bakteri uji
ke dalam media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37°C.
- Koloni yang tumbuh pada media dipindahkan ke dalam 10
mL media NB secara aseptik dan disesuaikan serapannya
dengan larutan baku McFarland 0.5 sehingga diperoleh
suspensi bakteri dengan jumlah sel 1.5 x 108 CFU/ml
b. Pengujian Aktivitas Antibakteri
- Senyawa antibakteri dimasukkan ke dalam sumur cawan
mikro dan diencerkan dengan berbagai konsentrasi
dengan menggunakan media NB steril. Senyawa
antibakteri yang digunakan berupa antibioktik
(konsentrasi stok 1 mg/ml) dengan seri konsentrasi
(p.001%, 0.01%, 0.1%, 1%).
- Sebanyak 5 μl suspense bakteri uji yang distandarisasi
jumlah sel dengan NaCl 0.85% dimasukkan ke dalam
sumur cawan mikro dan diinkubasi selama 24 jam pada
incubator 37°C. Volume total campuran senyawa
antibakteri, media NB dan suspense sel bakteri adalah
200 μl.
- Setelah 24 jam, cawan mikro diamani berdasarkan prinsip
turbidimetri. Konsentrasi paling jernih (tidak keruh)
ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimum.
- Penentuan konsentrasi butuh minimum dilakukan dengan
melakukan subkultur 50 μl suspense yang jernih ke
dalam media NA lalu diamati setelah 24 jam. Konsentrasi
bunuh minimum adalah yang membutuh sebagian besar
bakteri. Kontrol negatif yang digunakan berupa media dan
bakteri uji.
V. Hasil dan Pembahasan
4.1 Pembuatan Larutan Baku McFarland 0.5
Larutan standar McFarland adalah larutan yang digunakan
sebagai pembanding jumlah koloni bakteri pada medium cair yang
digunakan untuk pengujian daya antibakteri dengan range kepadatan
koloni tertentu. Larutan standar McFarland adalah larutan kimia barium
klorida dan asam sulfat. Reaksi antara kedua bahan ini menghasilkan
endapan halus barium sulfat. Ketika dikocok pelan, kekeruhan standa
McFarland visual sebanding dengan konsentrasi suspensi bakteri seperti
yang ditunjukkan pada tabel di bawah ini:
Approximate
McFarland
1% BaCl2 (mL) 1% H2SO4 (mL) Bacterial
Standard
Suspension/mL
0,5 0,05 9,95 1,5 x 108
1,0 0,10 9,90 3,0 x 108
2,0 0,20 9,80 6,0 x 108
3,0 0,3 9,7 9,0 x 108
4,0 0,4 9,6 1,2 x 108
5,0 0,5 9,5 1,5 x 108
6,0 0,6 9,4 1,8 x 108
7,0 0,7 9,3 2,1 x 108
8,0 0,8 9,2 2,4 x 108
9,0 0,9 9,1 2,7 x 108
10,0 1,0 9,0 3,0 x 108
Standar yang paling umum digunakan di Laboratorium
Mikrobiologi adalah Standar McFarland 0,5 yang setara dengan jumlah
perkiraan suspensi bakteri yaitu 1,5 x 108 CFU/ml dimana standar
tersebut merupakan dasar untuk percobaan kerentanan antimikroba
dan percobaan hasil biakan bakteri. Standar McFarland harus disimpan
dalam posisi tegak pada suhu 4°C sampai 25°C dan tehindar dari
cahaya. Pada kondisi ini, standar McFarland memiliki waktu paruh
sampai 12 minggu dimulai dari tanggal pembuatan.
Keakuratan kepadatan standar McFarland diperiksa dengan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Standar McFarland memiliki
pembacaan absorbansi 0,08-0,1 di 625 nm. Cara alternatifnya,
menyesuaian kekeruhan suspensi bakteri yang sama dan
mempersiapkan seri pengenceran 10 kali lipat dapat menjamin
keakuratan sdari standar McFarland dengan melakukan perhitungan
pengenceran dan memastikan bahwa suspensi memberikan jumlah
perwakilan koloni.
4.2 Penentuan Aktivitas Antibakteri
A. Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan bakteri uji dilakukan agar bakteri memulai
metabolisme kerja setelah penyiapan. Peremajaan dilakukan dengan
menginokulasi bakteri uji ke dalam media NA dan diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37°C. Digunakan NA karena merupakan substrat yang
sangat baik untuk memisahkan mikroorganisme, sehingga masing-
masing jenisnya tumbuh terpisah. NA juga memungkinkan
mikroorganisme tumbuh dengan agak berjauhan dan setiap selnya
membentuk koloni atau masa sel yang dapat dilihat oleh mata. Inkubasi
merupakan proses pemeliharaan kultur mikroba dengan
mempertahankan suhu tertentu agar bisa bertahan hidup dalam jangka
waktu tertentu untuk melihat pertumbuhan bakteri. Inkubasi bakteri
dilakukan selama 24 jam karena pada waktu tersebut bakteri
dimungkinkan telah berada pada fase logaritmik atau eksponensial,
pada fase tersebut baktei melakukan pembelahan secara konstan dan
jumlah sel meningkat. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C karena
kebanyakan organisme sel mamalia dan bakteri akan tumbuh dengan
baik pada suhu tersebut.

B. Pengujian Aktivitas Antibakteri

Adanya aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan terbentuknya
zona hambat di sekitar cawan. Terbentuknya zona hambat
menunjukkan adanya indikasi aktivitas terhadap antibakteri. Pengujian
aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode cawan
mikro (microtitre plate). Digunakan sampel dari ekstrak etil asetat daun
A, kontrol positif dengan Ampicilin dan kontrol negatif dari aquades.
Pada percobaan ini digunakan bakteri gram positif Bacillus subtillis dan
bakteri gram negatif E. coli.
Pertumbuhan dan perkembangan sel dapat dilakukan dengan
mengamati fase pertumbuhannya. Pada percobaan ini dilakukan dengan
menggunakan dengan metode turbidimetri, yaitu dengan mengukur
kekeruhan (Optical Density) atau OD kultur dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Berikut data
pengukuran OD pada percobaan ini:
OD (600 nm)
Sampel Rata-rata Kriteria
1 2 3

Kontrol +
0.559 0.589 0.599 0.582 Kuat
(Ampicilin)

Kontrol –
0.989 0.988 0.979 0.985 Lemah
Aquades

Ekstrak Etil Asetat Daun A

5% 0.822 0.821 0.812 0.818 Lemah

10% 0.781 0.785 0.760 0.775 Lemah

15% 0.723 0.721 0.711 0.718 Lemah

25% 0.682 0.667 0.676 0.675 Lemah

35% 0.611 0.62 0.633 0.621 Lemah

50% 0.60 0.620 0.610 0.61 Lemah

Hasil pengukuran OD dengan spektrofotometer menunjukkan

nilai absorbansi yang berbeda dari setiap sampel yang diamati. Nilai
absorbansi tertinggi diperoleh dari sampel dengan konsentrasi 5%,
dengan nilai absorbansi rata-rata sebesar 0.818. Nilai absorbansi
terendah diperoleh dari sampel dengan konsentrasi 50% dengan nilai
absorbansi rata-rata sebesar 0.61. Hubungan antara OD dengan
konsentrasi dapat dilihat pada grafik di bawah ini :

1 y = -0.0045x + 0.8088
R² = 0.8682
0.8
Rata-rata OD

0.6

0.4

0.2

0
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (%)
 Berdasarkan grafik regresi linear di atas, dapat diketahui adanya
hubungan antara konsentrasi dengan OD. Semakin tinggi konsentrasi
sampel, maka semakin kecil nilai OD. Hal ini selaras dengan hasil
penelitian Senati et al (2019), yang menunjukkan adanya korelasi
antara nilai OD dengan jumlah koloni atau mempunyai pola linear.
Semakin tinggi kepadatan bakteri, maka nilai OD juga semakin tinggi.
Artinya, setiap peningkatan nilai absorbansi (OD) diikuti oleh
meningkatnya jumlah bakteri. Dari beberapa paparan diatas, dapat
diketahui bahwa semakin tinggi konsentrasi sampel uji yang digunakan,
maka semakin baik pula aktivitas antibakterinya, yang mana ditandai
dengan nilai OD yang kecil yang, yang artinya jumlah koloni bakteri pun
sedikit.
Dilakukan pula pengujian terhadap aquades sebagai kontrol
negatif dan ampicilin sebaga kontrol positif. Pada aquades, diperoleh
nilai absorbansi rata-rata sebesar 0.985, sedangkan pada ampicilin
diperoleh nilai absorbansi rata-rata sebesar 0.582. Hal ini menunjukkan
bahwa aquades hampir tidak memiliki aktivitas antibakteri, sedangkan
ampicilin memiliki aktivitas antibakteri yang baik. Jika dibandingkan
antara ekstrak etil asetat daun A dengan ampicilin, ampicilin memiliki
aktivitas antibakteri yang lebih baik, dilihat dari nilai absorbansi rata-
ratanya.
VI. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan mengenai Teknik
Uji Aktivitas Antibakteri, dapat disimpulkan beberapa hal diantaranya:
1. Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan berbaga jenis
metode, contohnya metode cawan mikro (microtitre plate) dengan cara
memasukkan senyawa antibakteri ke dalam sumur cawan mikro dan
diencerkan dengan berbaga konsentrasi dengan menggunakan media
NB steril, kemudian setelah 24 jam diamati dengan metode
turbidimetri.
2. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dapat ditentukan dari
konsentrasi yang paling jernih (tidak keruh), sedangkan Konsentrasi
Bunuh Minimum (KBM) ditentukan dengan melakukan subkultur
50μl suspense yang jernih ke dalam media NA lalu diamati setelah 24
jam.
 DAFTAR PUSTAKA

Kurniawan, E., D. S. D. Jekti dan L. Zulkifli. 2019. “Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Metanol Batang Bidara Laut (Strychnos ligustrina)
terhadap Bakteri Patogen”. Jurnal Biologi Tropis. Vol. 19 (1) : 61-
69.
Rollando. 2019. Senyawa Antibakteri dari Fungi Endofit. Malang : CV.
Seribu Bintang.
Saputera, M. M. A., T. W. A. Marpaung dan N. Ayuchecaria. 2019
“Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Kadar Ekstrak Etanol
Batang Bajakah Tampala (Spatholobus littoralis Hassk) terhadap
Bakteri Escherichia coli melalui Metode Sumuran”. Jurnal Ilmiah
Manuntung. Vol. 5 (2) : 167-173.