BAB III

METODE PENELITIAN

1.1 Jenis dan rancangan penelitian

Penelitian ini menggunakan jenis penelitian true eksperimental dengan rancangan post
test dengan kelompok kontrol (post test only control grup design). Rancangan yang
digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 kelompok
perlakukan yang terdiri atas ekstrak metanol daging buah kawista (Limonia acidissima L)
dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, 100% , dan 2 kelompok kontrol terdiri dari kelompok
kontrol positif dengan Kloramfenikol dan kelompok negatif menggunakan aquadest steril.

1.2 Tempat dan waktu penelitian

1.2.1 Tempat penelitian
Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran Universitas Islam
Al-Azhar Mataram.

1.2.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian akan dilakukan pada bulan Agustus-September 2022

1.3 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa

1.3.1 Kelompok perlakuan

Tabel 3.1 Metode pengelompokan perlakuan berdasarkan kosentrasi ekstrak metanol daging
buah kawista (Limonia acidissima L)
 No Kelompok Perlakuan

1. Kelompok 1 (K1) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan ekstrak Metanol daging buah Kawista
dengan kosentrasi 25%

2. Kelompok 2 (K2) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan ekstrak Metanol daging buah Kawista
dengan kosentrasi 50%

3. Kelompok 3 (K3) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan ekstrak Metanol daging buah Kawista
dengan kosentrasi 75%

4. Kelompok 4 (K4) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan ekstrak Metanol daging buah Kawista
dengan kosentrasi 100%

5. Kelompok 5 (K5) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan Kloramfenikol kontrol positif.

6. Kelompok 6 (K6) Kelompok bakteri Pseudomonas aeruginosa yang

diberikan Aquadest kontrol negatif.

1.3.2 Menentukan jumlah Ulangan Replikasi

Adapun penentuan jumlah ulangan mengunakan Rumus Federer (Ihwah, 2018) adalah
sebagai berikut:
(t-1) . (r-1) ≥ 15
(6-1) . (r-1) ≥ 15
5(r-1) ≥ 15
5r-5 ≥ 15
5r ≥ 20
20
r≥
5

r=4

Keterangan:

t = treatment (jumlah perlakuan)

r = replication (jumlah pengulangan)

15 = derajat kebebasan umum

1.3.3 Menentukan Jumlah Unit Replikasi

N=txr

=6x4

= 24

1.4 Variabel Penelitian

1.4.1 Variabel bebas (Independent)
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kosentrasi ekstrak metanol daging buah
Kawista (Limonia acidissima L).

1.4.2 Variabel terikat (Dependent)

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa diameter
zona hambatan.

1.5 Definisi Operasional

Tabel 3.2 Definisi Operasional variabel Independent dan Dependent

No Variabel Definisi Alat ukur Hasil Skala

Operasional Ukur Pengukuran

1. Variabel bebas: Suatu zat yang Labo ukur Persentase Ratio

Ekstrak Metanol diperoleh dari
daging Buah hasil ekstrak
Kawista metanol daging
buah Kawista
(yang
mengandung,
Alkaloid,
Saponin,
Flavonoid)
melalui proses
maserasi…

Variabel terikat: Pertumbuhan Mengunakan Milimeter Ratio

2. Diameter zona bakteri yang Pengaris untuk (mm)
hambat terhambat mengukur rata
Pseudomonas dengan rata panjang
aeruginosa mengunakan zona hambatan
metode
Sumuran Kirby
Bawer
1.6 Alat dan Bahan
1.6.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, alat pemotong,
blender, gelas beker, Erlenmeyer, corong, rotary evaporator, vortex, botol vial, pingset, pipet
mikro, blue tip, yellow tip, inkubator, paper disk, laminar airflow, Eppendorf, kawat ose,
cawan petri, dan autoclave.

1.6.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daging buah kawista (Limonia
acidissima), bakteri Pseudomonas aeruginosa, standar kekeruhan 0,5 unit Mcfarland, media
Mueller Hinton Agar (MHA), nutrien agar (Merck), Metanol (Merck), aquades, kertas saring,
tisu, cotton swab, bunsen.

1.7 Prosedur Penelitian

1.7.1 Pembuatan Ekstrak Daging Buah Kawista
Buah kawista yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah buah kawista muda yang
diperoleh dari kecamatan Kempo kabupaten Dompu. Buah kawista muda dipisahkan antara
kulit dan daging buahnya. Setelah itu daging buah diiris tipis tipis dan kering anginkan. Irisan
buah yang sudah kering diblender sehingga diperoleh serbuk buah kawista.

Buah kawista yang sudah menjadi serbuk selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan cara
maserasi menggunakan pelarut metanol dengan perbandingan 1:2. Larutan didiamkan
selama 2 X 24 jam, kemudian dipisahkan hingga diperoleh filtrat dan residu. Residu
kemudian dimaserasi kembali dengan metanol dengan 3 kali pengulangan. Gabungan ekstrak
yang diperoleh dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator untuk memperoleh
ekstrak metanol buah kawista.

Ekstrak kental yang diperoleh kemudian diencerkan dengan aquades steril. Pengenceran
bertujuan untuk menghasilkan beberapa konsentrasi yang akan digunakan untuk menghambat
pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa. Pengenceran sampel dengan rumus : %=b/v, dengan
“b” menyatakan berat atau massa ekstrak dalam gram dan “v” menyatakan volume
cairan/pelarut yang ditambahkan dalam mililiter. Ekstrak metanol daging buah Kawista
(Limonia acidissima L) pertama-tama dalam keadaan konsentrasi awal yaitu
100% selanjutnya diencerkan menggunakan aquades menjadi 100%, 75%, 50%, dan 25%
secara manual menggunakan pengenceran bertingkat dengan rumus M1×V1=M2×V2
1.7.2 Strilisasi Alat
Mensterilisasi alat dan bahan penelitian, yang digunakan untuk uji penelitian, agar
bebas dari pengaruh mikroorganisme lain yang mungkin mempengaruhi hasil penelitian.
Sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15-20 menit. Alat-alat ditunggu
sampai mencapai suhu kamar dan kering.
1.7.3 Pembuatan Standar Kekeruhan Larutan Mc Farland
Standar kekeruhan Mc Farland dibuat dari campuran asam sulfat 1% dengan BaCl 1%
dimaksudkan untuk menggantikan perhitungan bakteri satu persatu dan untuk memperkirakan
kepadatan sel yang akan digunakan pada prosedur pengujian antimikroba.
Tabel 3.3 Mc Farland Nephelometer Standard

Unit Mc H2SO4 1% (mL) BaCl 1% Perkiraan jumLah

Farland (mL) bakteri (jutaan/mL)
0,5 9,95 0,05 150
1 9,9 0,1 300
2 9,8 0,2 600
3 9,7 0,3 900
4 9,6 0,4 1.200
5 9,5 0,5 1.500
6 9,4 0,6 1.800
7 9,3 0,7 2.100
8 9,2 0,8 2.400
9 9,1 0,9 2.700
10 1,0 3.000

Sumber: Soemarno (2000)

1.7.4 Pembuatan Supensi Bakteri

Bakteri strain murni Pseudomonas aeruginosa diambil dengan jarum Ose dan
disuspensikan dengan cara dimasukkan ke dalam tabung berisi 5 mL larutan NaCl fisiologis
steril 0,9%. Suspensi yang terbentuk disetarakan dengan standar McFarland 0,5 untuk
mendapatkan bakteri sebanyak 1,5 x 108 cfu/mL. Kekeruhan dilihat dengan membandingkan
suspensi bakteri dengan standar kekeruhan McFarland 0,5. Jika kurang keruh, suspensi
ditambahkan koloni sedangkan jika lebih keruh ditambahkan Nutrient Broth (NB) (ICMR,
2009).
1.7.5 Pembuatan Media Agar MHA (Muller Hinton Agar)
Pembuatan Media Agar MHA (Muller Hinton Agar) untuk Metode Sumuran Kirby
Bauer yaitu dengan menimbang media padat sebanyak 3,4 gram MHA oxoid, setelah
ditimbang lalu dilarutkan dalam 100 mL aquades steril dalam labu Erlenmeyer, kemudian
bahan tersebut dipanaskan sambil diaduk di atas hot plate hingga mendidih. Hal ini
dimaksudkan agar mendapatkan larutan dengan sempurna. Setelah itu media disterilisasi
dengan autoclave dengan suhu 120°C selama 15 menit. Larutan didinginkan hingga kira-kira
50°C kemudian dituang dalam petridish dengan ketebalan 4 mm. Selanjutnya dibiarkan beku
dalam suhu kamar (Ramadanti, 2008).

1.7.6 Uji daya Hambat Ekstrak Metanol daging buah Kawista terhadap Pseudomonas
aeruginosa
Ekstrak daging buah kawista dengan konsentrasi 25%, 50%, 75% dan 100%
dimasukkan pada sumuran yang telah dibuat dengan diameter 6 mm pada media agar dengan
jarak ± 15 m sebanyak masing – masing 100 µl (Ainur Rochmah et al., 2013). Klorafmikol
digunakan sebagai kontrol positif untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan dosis 50
µm sebanyak 100 µl, akuades steril digunakan sebagai kontrol negatif dan dimasukan
kedalam sumuran sebanyak 100 µl, kemudian media agar lalu diinkubasi pada suhu kamar
370C selama 24 jam, zona hambat yang terbentuk di sekitar sumuran diukur dengan
menggunakan penggaris, dimana prosedur diatas dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali.
1.8 Alur Penelitian

Persiapan

Pembuatan suspensi Pembuatan Ekstrak

pseudomonas metanol daging buah
aeruginosa kawista (Limonia
dan pembuatan acidissima L)
standart kekeruhan 25%, 50%, 75%, 100%
0,5 Mcfarland

Pembuatan sumuran media MHA

Memasukan ekstrak metanol daging buah kawista pada

media sumuran MHA dengan pengulangan 4 kali

Ekstrak metanol Ekstrak metanol Ekstrak metanol Ekstrak metanol

daging buah daging buah daging buah daging buah
kawista 25% kawista 50% kawista 75% kawista 100%
dan bakteri dan bakteri dan bakteri dan bakteri
pseudomonas pseudomonas pseudomonas pseudomonas
aeruginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa

Inkubasi 1 x 24 jam pada incubator dengan suhu 370 C

Pengukuran zona hambat

Analisis data

Gambar 3.1 Bagan Alur Penelitian

1.9 Pengolahan data dan Analisis data

1.9.1 Pengolahan data
Data hasil pengamatan disajikan dalam bentuk tabel berupa hasil pengukuran diameter
zona hambatan setiap perlakuan kemudian dihitung jumlah total diameter zona hambatan dan
rata-rata diameter zona hambatan tiap perlakuan.
Tabel 3.4 Hasil Jumlah Pengukuran Zona Hambatan

Luas Zona Hambatan

Jumlah
Kelompok perlakuan (mm) Rata-rata
diameter Makna
1 2 3 4
(k1) 25%    
(k2) 50%    
(k3) 75%    
(k4) 100%    
Kontrol (+)
Kontrol (-)

Keterangan:

k1 : Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak Metanol daging buah Kawista (Limonia

acidissima L) 25%
k2 : Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak Metanol daging buah Kawista (Limonia
acidissima L) 50%
k3 : Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak Metanol daging buah Kawista (Limonia
acidissima L) 75%
k4 : Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak Metanol daging buah Kawista (Limonia
acidissima L) 100%
Kontrol Positif (+) : Kloramfenikol
Kontrol Negatif (-) : Aquades steril

1.9.2 Analisis data

Semua data yang diperoleh dilakukan uji statistik dengan One Way Anova yang

memiliki tingkat kepercayaan 95% (p value = 0,05) dan dengan bantuan SPSS

dilanjutkan dengan uji tukey HSD. Jika dari hasil uji hitung didapat p value > 0,05,

berarti tidak terdapat pengaruh ekstrak metanol daging buah kawista (Limonia

acidissima L) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa (Ho diterima),

akan tetapi apabila p value < 0,05 berarti terdapat pengaruh ekstrak daging buah kawista

(Limonia acidissima L) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa (Ho

ditolak).
1.10 Jadwal Penelitian
Tahun 2022
Nama Kegiatan Mei Juni July Agustus
Pencarian jurnal dan pembuatan
proposal
Seminar proposal
Mengurus ethical clearance
Pengambilan sampel
Analisis data
Seminar hasil